ZIC1 modulant distributions du cycle cellulaire et la migration des cellules à travers la régulation de sonic hedgehog, PI
3K et MAPK voies dans le cancer gastrique de signalisation
Résumé de l'arrière-plan
ZIC1, un facteur de transcription essentiel avec des domaines à doigts de zinc, a été impliquée dans le processus de développement du système nerveux. Nous avons montré précédemment que ZIC1 peut fonctionner comme un suppresseur de tumeur dans les cancers gastro-intestinaux. Cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent, la participation ZIC1 dans la progression tumorale reste inconnue. Méthodes de
Le rôle de ZIC1 sur la prolifération et la migration cellulaire a été examinée. La régulation de sonic hedgehog (Shh), phosphoinositide 3-kinase (PI 3K) et de la protéine kinase activée par un mitogene (MAPK) voies après l'expression ectopique de ZIC1 dans les cellules de cancer gastrique de signalisation ont été évalués. Des résultats de
la surexpression de ZIC1 contribue à l'inhibition de la migration de la prolifération cellulaire et la distribution du cycle cellulaire dans le cancer gastrique. La modulation de G1 /S checkpoint par ZIC1 est principalement médiée par la régulation des kinases cycline-dépendantes (p21 WAF1 /Cip1, p27 Kip1 et cycline D1). En outre, ZIC1 peut inactiver le niveau de phospholated Akt et ERK1 /2, et transcriptionnel réguler sonic hedgehog (Shh) de signalisation, conduisant ainsi à réguler l'expression de p21 WAF1 /Cip1 et cycline D1. Enfin, nous avons systématiquement identifié ZIC1 cibles en aval par l'analyse des puces à ADN et a révélé que 132 gènes sont régulés à la baisse et 66 gènes sont régulés à la hausse après transfection avec ZIC1 dans les cellules de cancer gastrique. Ces gènes candidats
jouent un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, le cycle cellulaire et la motilité cellulaire. Conclusions La surexpression de ZIC1 entraîne l'inactivation de Shh, PI 3K et MAPK, ainsi que la régulation de cibles multiples en aval de signalisation ce qui est essentiel pour le développement et la progression du cancer gastrique. ZIC1 sert de cible thérapeutique potentielle pour le cancer gastrique.
Mots-clés
ZIC1 Sonic hedgehog Cycle cellulaire Tumeur suppresseur fond
ZIC1, l'un des cinq gènes de la famille ZIC, est impliqué dans une variété de processus de développement, y compris la neurogenèse et myogenèse [1, 2]. Récemment, ZIC1 a été documentée pour participer à la progression des tumeurs humaines, y compris le médulloblastome, les cancers de l'endomètre, les tumeurs mésenchymateuses et les cancers de liposarcomes [3-6]. Nous avons précédemment montré que le gène ZIC1 est significativement régulée à la baisse dans les tissus de cancer gastrique et des lignées cellulaires par rapport à celle de tissus gastriques normaux. En outre, ZIC1 sert potentiellement aussi un suppresseur de tumeur en inhibant la prolifération cellulaire dans des cellules de cancer gastrique et colorectal [7, 8]. Comme un important facteur de transcription, ZIC1 est essentielle à la régulation de la signalisation Hedgehog (Hh), protéine morphogénétique osseuse (BMP), et les voies de signalisation Notch dans le développement neuronal [2, 9]. Cependant, on sait peu sur la façon dont ZIC1 régule les voies de signalisation et leurs objectifs connexes en aval dans la progression du cancer.
Le cancer gastrique est la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde entier [10, 11]. la signalisation Hh est l'une des principales voies de signalisation impliquées dans la carcinogenèse oncogènes gastrique [12, 13]. Sonic Hedgehog (Shh), un membre de la famille des mammifères Hh [14], il a été démontré à la fois être régulée à la hausse dans les tissus du cancer de l'estomac par un dosage d'hybridation in situ et essentiel pour la progression du cancer gastrique [13, 15]. voie de signalisation Hh est activé par Shh liaison avec le Patched (Ptch) - Smoothened (Smo) membrane-récepteur complexe [16]. L'activation de Shh favorise la différenciation des cellules du cancer gastrique et la prolifération. Il a été rapporté que ZIC1 pourrait réduire l'expression de PTCH1
et les gènes de Shh dans le tissu nerveux au cours du développement du cerveau antérieur [17]. En revanche, il a été démontré que le Shh réprime l'expression de ZIC1 au cours du développement du tube neural [18]. Néanmoins, l'influence de ZIC1 sur la voie de signalisation Hh dans le cancer gastrique reste inconnue.
ZIC1 réglemente également de nombreuses cibles, y compris la cycline D1, p27, Wnt1 et Wnt7a au cours du développement neuronal dans des explants ectodermiques xénope et des modèles de souris mutantes [9, 19, 20]. Nous sommes particulièrement intéressés par des régulateurs importants pour la prolifération des cellules cancéreuses et la différenciation du cycle cellulaire. Nous avons précédemment montré que la surexpression de ZIC1 peut modifier transition G1 /S dans des cellules de cancer gastrique [8]. Plusieurs mécanismes de kinases dépendantes cycline (CDK) sont impliqués dans la régulation de G1 /S point de contrôle dans les cancers humains [21]. Pendant la transition de G1 à la phase S, la cycline D qui forme des complexes actifs avec CDK4 est régulée à la hausse dans le cancer gastrique [22, 23]. Perte d'inhibiteurs de kinases cycline-dépendantes telles que p21 WAF1 /Cip1 et p27 Kip 1 promotion de l'activité de CDK2 et de réguler la transition G1 /S [12, 24]. Des études récentes ont montré que le mutant ou la force ZIC1 surexpression de ZIC1 régule l'expression de p27 Kip 1 chez les souris des tissus et des cellules cérébelleuses de liposarcomes [3, 20]. Fait intéressant, la voie de signalisation de Shh régule négativement la p21 WAF1 /Cip1 et la cycline D1 d'une manière dépendante de GLI1 [16, 25]. Cependant, si ZIC1 peut interaction avec Shh voie dans la régulation des distributions du cycle cellulaire n'a pas été définie. Elucidation de ce réseau de signalisation peut fournir un éclairage supplémentaire sur le rôle de ZIC1 dans le cancer gastrique.
Dans notre étude, nous montrons que la surexpression de ZIC1 supprime la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion, ainsi que modifie les distributions du cycle cellulaire. ZIC1 peut transcriptionnel réguler négativement la signalisation de Shh et supprimer le niveau de phospholated Akt et Erk, conduit ainsi à la régulation du régulateur du cycle cellulaire des kinases p21 WAF1 /Cip1, p27 Kip1 et cycline D1 dans les cellules de cancer gastrique. Nous avons également identifié plusieurs ZIC1 importantes cibles en aval dans les cellules de cancer gastrique par l'analyse des puces à ADN
. Résultats
ZIC1 inhibe la prolifération, la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique
Pour déterminer l'effet de ZIC1 sur la prolifération cellulaire, nous avons effectué l'analyse de la viabilité des cellules par des tests de MTS dans les cellules cancéreuses gastriques. des lignées cellulaires de cancer gastrique (AGS, MKN28, BGC823 et SGC7901) ont été transfectées avec pCDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA3.1 vecteur vide. L'efficacité de transfection a été confirmée par RT-PCR et transfert de Western, respectivement (figure 1A). Les résultats ont montré que le nombre de cellules viables a été significativement supprimée par l'expression ectopique de ZIC1 dans une observation de 5 jours dans BGC823 cellules (figure 1B). La suppression de la prolifération cellulaire par ZIC1 était en accord avec nos observations antérieures dans AGS et des cellules de cancer de l'estomac MKN28, ainsi que des cellules de cancer du côlon [7, 8]. La figure 1 ZIC1 supprime la prolifération et la migration cellulaire dans le cancer gastrique. (A) gastriques lignées cellulaires de cancer (AGS, MKN28, BGC823 et SGC7901) ont été transfectées de façon stable avec pCDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA3.1 vecteur vide. Les niveaux d'ARNm et de protéine ZIC1 expression ont été effectuées par RT-PCR (diagramme du haut) et Western Blot (bas du diagramme). GAPDH et la β-actine ont été utilisés comme contrôles internes. (B) La viabilité des cellules de la lignée cellulaire de cancer gastrique (BGC823) a été déterminée par dosage MTS de la prolifération cellulaire. L'astérisque indique la signification statistique (** p < 0. 01). (C) La migration cellulaire a été évaluée par Boyden modifiée Transwell à-essais après incubation pendant 16 h. Les cellules qui ont migré vers le bas de la membrane ont été colorées avec du DAPI. (D) Le nombre de cellules migratoires visibles (moyenne ± S.D) a été estimée en comptant cinq champs haute puissance aléatoires (400 × grossissement). Ces expériences ont été réalisées en triple. Les données représentatives sont présentés. L'astérisque indique la signification statistique (*** p < 0,001).
En outre, nous avons déterminé le rôle de ZIC1 dans la migration cellulaire et l'invasion dans le cancer gastrique. la migration et l'invasion cellulaire des essais ont été effectués dans la migration et Transwell revêtus de Matrigel, respectivement des systèmes d'analyse d'invasion. Nous avons observé que réexpression de ZIC1 supprimé de manière significative la migration des cellules AGS, et BGC823 SGC7901 lignes gastriques de cellules cancéreuses (p < 0,001) (figure 1C, D). En outre, ré-expression de ZIC1 affiché une activité significativement plus faible de l'invasion cellulaire par rapport à ces vecteurs transfectants vides dans les cellules AGS (p < 0,05) (fichier supplémentaire 1: Figure S1). Ces données suggèrent que l'expression ectopique de ZIC1 inhibe la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion.
ZIC1 modifie la distribution du cycle cellulaire et régule l'expression des kinases cycline-dépendantes dans les cellules cancéreuses gastriques
Pour mieux comprendre les mécanismes sous-tendant l'inhibition de la prolifération cellulaire par la surexpression de ZIC1, nous avons évalué la distribution du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses gastriques. Nous avons observé une forte proportion de cellules en phase G1 en AGS (42,74%) et SGC7901 (54,03%), les lignées cellulaires après surexpression de ZIC1. Cependant, dans les cellules transfectées avec un vecteur de contrôle, la proportion a diminué à la fois dans AGS (32,66%) et SGC7901 (47,00%) et la proportion de cellules en phase S a été relativement augmenté (figure 2A). Il est bien admis que p21 (également connu sous le nom p21 WAF1 /Cip1) et p27 (également connu sous le nom p27 KIP1), deux inhibiteurs de kinases cycline-dépendantes principales, sont nécessaires à l'arrêt lors de l'entrée en phase S [26]. L'activation de la cycline D1, cependant, est principalement responsable de la régulation de la transition de phase G1-S [23]. Nous avons démontré que le niveau de la protéine cycline D1 expression a été réduite tout en p21 et p27 ont été induites de façon marquée dans les cellules cancéreuses gastriques transfectées par pCDNA3.1-ZIC1 par rapport à ceux pCDNA3.1 vecteur vide transfectants (figure 2B). Nous avons également évalué les distributions de l'apoptose cellulaire dans pCDNA3.1-ZIC1 ou transfectants vecteur pCDNA3.1 dans les cellules AGS et MKN28, mais pas de différences évidentes de l'apoptose des cellules n'a été observé (fichier supplémentaire 2: Figure S2). Par conséquent, ces résultats confirment que la surexpression de ZIC1 modifie la distribution du cycle cellulaire par la régulation des kinases cycline-dépendante p21, p27, ainsi que la cycline D1 dans les cellules cancéreuses gastriques. Figure 2 ZIC1 modifie les distributions du cycle cellulaire par régulation de p21, p27 et la cycline D1 dans les cellules de cancer gastrique. (A) distributions du cycle cellulaire ont été détectés par cytométrie de flux en AGS et SGC7901 cellules après transfection transitoire avec pCDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA3.1 vecteur vide pendant 24 h. (B) Les niveaux de p21, p27 et cycline D1 expression ont été déterminées par Western blot. β-actine a été détectée en tant que témoin de chargement. Les valeurs de densitométrie sont exprimés en facteur de variation par rapport aux valeurs de vecteurs de pCDNA3.1 de contrôle normalisées à 1. (C) Les niveaux de phospholated Akt et ERK1 /2 expression, ainsi que le total Akt et ERK1 /2 ont été examinés par Western blot.
MAPK et PI 3K voies jouent un rôle vital dans la régulation des kinases du cycle cellulaire. Nous avons évalué l'expression des principaux effecteurs en aval de ces deux voies, ERK1 /2 et Akt, après avoir introduit de manière stable pCDNA3.1-ZIC1 à AGS, MKN28, BGC823 et SGC7901 cellules de cancer gastrique (Figure 1A). Nous avons constaté que les niveaux de ERK1 /2 et la phosphorylation de Akt ont été considérablement supprimée par la surexpression de ZIC1 dans toutes les lignées cellulaires testées ci-dessus (figure 2C). Ces résultats suggèrent que la régulation de la distribution de cellules cylce par ZIC1 peut être médiée par PI 3K et voies de MAPK et leur aval kinases cycline-dépendantes p21, p27 et la cycline D1 dans le cancer gastrique.
ZIC1 supprime l'expression de Sonic hedgehog (Shh) dans les cellules cancéreuses gastriques
la caractérisation moléculaire a montré que ZIC1
possède des domaines de doigts de zinc et pourrait contrer avec GLI1 en se liant à des séquences riches en GC [2]. GLI1 est une cible en aval de hedgehog (hh) voie de signalisation qui est essentielle pour le développement du cancer de l'estomac et de la progression [9, 27]. Nous avons supposé que la voie de signalisation Hh peut être impliqué dans la régulation de ZIC1 du cancer du cycle cellulaire gastrique et la migration des cellules. Pour résoudre ce problème, nous avons examiné l'expression de Sonic hedgehog (Shh), un membre clé de la famille Hh, dans les cellules de cancer gastrique après surexpression de ZIC1. Nous avons constaté que réexpression de ZIC1 réduit efficacement l'expression de Shh dans BGC823 et SGC7901 lignées cellulaires par analyse Western Blot (figure 3A). En outre, l'analyse par RT-PCR a démontré que le niveau de Shh de transcription est également significativement downregulated dans les cellules cancéreuses gastriques transfectées avec ZIC1 par rapport au vecteur vide transfectées (p < 0,01) (figure 3B) (fichier supplémentaire 3: Figure S3). . Prises ensemble, nos résultats suggèrent que ZIC1 peut réguler l'expression transcriptionnelle de Shh dans les cellules cancéreuses gastriques. Figure 3 ZIC1 inhibe l'expression de Sonic hedgehog (Shh). (A) L'expression de la protéine Shh a été analysée par Western blot en BGC823 et SGC7901 cellules transfectées de façon stable avec pCDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA3.1 vecteur vide. (B) Le niveau de Shh ARNm d'expression a été déterminée par l'analyse quantitative RT-PCR en temps réel. Le niveau d'expression relative a été exprimée comme facteur de variation (moyenne ± SEM) par rapport à pCDNA3.1 vecteur vide normalisé à 1.
Hedgehog (Hh) voie de signalisation est impliquée dans la régulation de ZIC1 du cycle cellulaire et la migration cellulaire dans le cancer gastrique cellules
pour déterminer l'effet de Shh sur les distributions du cycle cellulaire, nous avons cherché à examiner les effets de l'inhibiteur pharmacologique de la signalisation Hh sur l'expression de p21 et la cycline D1. AGS, et BGC823 SGC7901 lignées cellulaires de cancer gastrique ont été traitées avec Cyclopamine (10 uM), un alcaloïde stéroïde qui interagit directement avec Smo pour inhiber la signalisation Hh [28], ou d'un témoin de DMSO pendant 24 h. Nous avons observé que le niveau d'expression de p21 est nettement régulée à la hausse, tandis que la cycline D1 régulée à la baisse après que les cellules tumorales ont été traitées avec la cyclopamine (figure 4A). Il faut noter que le blocage de la voie de signalisation de Shh par l'administration de la cyclopamine ne modifie pas les niveaux d'expression de l'ARNm dans ZIC1 BGC823 et SGC7901 cellules par des tests de RT-PCR (figure 4B). L'expression absente ou faible ZIC1 ARNm dans les cellules de cancer gastrique a été principalement médité par le promoteur méthylation de l'ADN que nous avons décrit précédemment [8]. Figure 4 voie de signalisation Hh est impliqué dans l'expression de p21, la cycline D1 et la régulation de la migration cellulaire. AGS BGC823 et SGC7901 cellules cancéreuses gastriques ont été traitées avec Cyclopamine (10 uM), un alcaloïde stéroïde qui interagit directement avec Smo pour inhiber la signalisation Hh, ou d'un témoin de DMSO pendant 24 h. (A) Les niveaux de p21 et la cycline D1 expression ont été déterminées par western blot dans AGS, BGC823 et SGC7901 cellules. (B) Le niveau de ZIC1 ARNm d'expression a été examinée par RT-PCR classique. (C) La migration cellulaire a été évaluée par Boyden modifiée TRANSWELL Chambers essais. Les cellules qui ont migré vers le bas de la membrane ont été colorées avec du DAPI. (D) Le nombre moyen de cellules migratoires visibles (moyenne ± S.D) a été calculé dans cinq champs haute puissance aléatoires (× 400). L'astérisque indique la signification statistique (*** p < 0,001).
Nous avons également évalué les effets de la signalisation de Shh sur la migration des cellules de cancer de l'estomac. Comme on le voit sur la figure 4, C et D, AGS, et BGC823 SGC7901 lignées cellulaires de cancer gastrique a montré la diminution significative de la migration cellulaire après l'administration de la cyclopamine (10 uM) pendant 24 h (p < 0,01). Collectivement, ces résultats démontrent que ZICI peut moduler les régulateurs du cycle cellulaire et la migration des cellules grâce à la signalisation Shh dans les cellules de cancer gastrique.
Profil d'expression génique des changements par l'expression ectopique de ZIC1
Pour déterminer systématiquement des cibles en aval de ZIC1, nous avons mené un microréseau affymatrix d'oligonucléotide dans MKN28 cellules de cancer gastrique avec ou sans pCDNA3.1-ZIC1. L'utilisation d'un cut-off de > 1,5 fois pour la signification statistique, un microréseau a révélé que 132 gènes sont régulés à la baisse tandis que 66 gènes sont régulés à la hausse par l'expression exogène de ZIC1 (gènes représentatifs représenté sur la figure 5A). De nombreux gènes ont été rapportés pour jouer un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, le cycle cellulaire et la migration des cellules selon l'analyse fonctionnelle des gènes (http:. //Www. GeneCards org) (figure 5B). Par exemple, deux régulateurs du cycle cellulaire clés TP53INPI
et CDKN2B
se révèlent être déréglementés en MKN28 cellules transfectées avec pCDNA3.1-ZIC1. Nos résultats indiquent que ZIC1 réglemente potentiellement plusieurs gènes en aval impliqués dans la tumorigenèse gastrique. Figure 5 profil d'expression génique des changements après l'expression ectopique de ZIC1. (A) Les profils d'expression de gènes dans pCDNA3.1-ZIC1 ou un vecteur vide pCDNA3.1 transfectants stables ont été analysés par l'ADNc de puces à ADN dans des cellules MKN28. gènes représentatifs sont illustrés sur le côté droit de l'image heatmap utilisant un cut-off > 1,5 ou < -1.5 Fois comme une différence significative ,. (B) des gènes impliqués dans le cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la migration des cellules selon l'analyse fonctionnelle des gènes (http:. //Www. GeneCards org) sont présentés. Relative facteur de variation est exprimée avec un rapport de pCDNA3.1-ZIC1 par rapport au contrôle pCDNA3.1. Rapport de (C) compréhension systémique des voies pour ZIC1 régulation de la signalisation et des gènes cibles dans le développement et la progression du cancer de l'estomac.
plus de preuves a montré que ZIC1 est impliqué dans la progression de plusieurs tumeurs [3-8] . Il apparaît que ZIC1 est exprimé de manière aberrante dans certains types de cancer et les fonctions différentiellement comme un suppresseur de tumeur ou un gène oncogène. Par exemple, l'expression de ZIC1 a été rapportée pour être faible ou absente dans des lignées de cellules gastro-intestinales et le cancer du poumon, et a été trouvée pour supprimer gastro-prolifération des cellules cancéreuses [7, 8, 29]. En revanche, la surexpression de ZIC1 dans liposarcome a été trouvée pour favoriser la prolifération et l'invasion cellulaire [3]. Nous et d'autres ont démontré que les modulations épigénétiques, dont la méthylation de l'ADN et des histones remodelage, et des mutations génétiques peuvent contribuer à ses profils d'expression différentielle dans les cancers [3, 4, 7, 8]. Il devient clair que, comme un facteur de transcription à doigt de zinc, ZIC1 peut moduler plusieurs gènes en aval dans le tissu nerveux, les cellules cancéreuses et liposarcome colorectaux [2, 3, 7, 9]. Cependant, on sait peu sur la fonction ZIC1 sous-jacente de mécanisme dans le développement et la progression du cancer gastrique. Soulignant les principales voies et les cibles en aval réglementées par ZIC1 peut faciliter notre compréhension de son rôle dans la tumorigenèse. Ici, nous avons démontré que la surexpression de ZIC1 se traduit par une inhibition significative de la survie des cellules et une altération de la migration cellulaire. ZIC1 supprime les voies de signalisation Shh, PI3K et MAPK qui sont critiques pour la régulation de la distribution du cycle cellulaire et la migration cellulaire dans le cancer gastrique. En outre, ZIC1 inhibe les kinases du cycle cellulaire de régulation, p21, p27 et la cycline D1, entraînant ainsi le transit du cycle cellulaire G1 /S dans des cellules cancéreuses gastriques. ZIC1 supprime la voie de signalisation de Shh qui est essentiel pour la régulation de la distribution du cycle cellulaire et la migration cellulaire dans le cancer gastrique.
MAPK et PI 3K voies jouent un rôle crucial dans la prolifération cellulaire, la différenciation et la progression dans une variété de cancers humains [30]. Récemment, il a également été rapporté que l'activation des deux voies sont essentiels pour induire l'entrée [30, 31] cycle cellulaire. Pendant ce processus, dépendant de cycline inhibiteurs de la kinase p21, p27 et cycline D /E participent à la régulation de p53 induite par arrêt du cycle cellulaire [24, 32]. L'activation de MAPK et son aval kinase Erk ne pouvait que conduire à l'induction de la cycline D1 et passer à travers G1 /S point de contrôle, mais aussi l'accumulation de p21 qui inhibe les complexes cycline E /CDK2 pour bloquer l'entrée en phase S [30] . PI voie 3K /Akt pourrait inactiver les facteurs GSK3-ß et FOXO transcription, ainsi inhiber la cycline D1 alors induire p27 et p21 dans la régulation de l'entrée du cycle cellulaire [31]. Nous avons montré que l'expression de ré-ZIC1 inactivent efficacement l'Akt phosphorylée et ERK1 /2 dans AGS, MKN28, et BGC823 SGC7901 lignées cellulaires de cancer gastrique. A cet égard, l'inhibiteur de p21 a été activé CDK1, alors que la cycline D1 inactivée après surexpression de ZIC1 dans les cellules cancéreuses gastriques. Bien que les résultats doivent être validés dans des études futures, nos données miroarray ont révélé que d'autres éléments clés du cycle cellulaire des régulateurs de kinases dont TP53INPI
et CDKN2B
, sont déréglementés avec l'expression forcée de ZIC1 dans une MKN28 cellule de cancer gastrique individuelle ligne (Figure 5 A et B). Par conséquent, nous proposons que ZIC1 réglemente G1 /transit S principalement par PI 3K et MAPK et en aval kinases de régulation du cycle cellulaire dans les cellules de cancer gastrique.
Une autre constatation importante dans notre étude actuelle est que ZIC1 réglemente transcriptionnelle Sonic hedgehog (Shh) de signalisation dans les cellules cancéreuses gastriques. Mis à part son rôle central sur la régulation des glandes gastriques morphogenèse dans l'estomac humain, signalisation de Shh est également impliquée dans la pathogenèse du cancer gastrique [16, 33]. Shh est souvent activée dans les adénocarcinomes gastriques avancés et associés à un comportement de tumeur agressive [13, 15, 33]. Des études antérieures ont montré que la signalisation de Shh favorise la mobilité et le caractère invasif des cellules cancéreuses gastriques par le TGF-β-ALK5-voie Smad3 [34]. Shh signalisation pourrait également réguler l'expression de p21 et la cycline D1 dans une voie dépendante de Gli [16, 25]. Nous avons observé que l'inhibition de la signalisation de Shh par l'administration avec cyclopamine supprime AGS, BGC823 et SGC7901 gastrique migration des cellules cancéreuses, et régule l'expression de p21 et la cycline D1 (Figure 4). Ces résultats sont cohérents avec les études précédemment rapportées [25, 34]. Ainsi, nous avons montré que ZIC1 joue un rôle important dans l'estomac progression du cancer par régulation de la voie de signalisation de Shh.
ZIC1 peut réguler les gènes cibles dans les deux manières de séquence spécifiques et indépendants [9]. ZIC1 pourrait réguler l'expression transcriptionnelle de cibles, y compris la cycline D1, p27, Wnt1 et Wnt7a et moduler Notch et BMP voies dans le développement neuronal [2, 9]. ZIC1 pourrait contrecarrer GLI en se liant à des séquences riches en GC, et supprimer l'expression de la séquence dirigée gènes rapporteurs de GLI liaison [9, 35]. Nous avons identifié plusieurs ZIC gènes cibles potentiels dans les cellules de cancer gastrique par l'analyse des microréseaux. Ces objectifs sont étroitement liés au cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la migration (figure 5B). L'association entre les ZIC et les cibles en aval pourrait être un indice pour comprendre la perspective potentielle des protéines ZIC dans la progression du cancer de l'estomac.
Conclusions
Sommairement, nous proposons un modèle qui représente les voies par lesquelles ZIC1 contribue au cancer de l'estomac progression (figure 5C). La surexpression des résultats de ZIC1 en supprimant Hedgehog (Hh) de signalisation et ses cibles en aval, y compris p21, p27 et cycline D1. En tant que facteur doigt de zinc de la transcription, ZIC1 modulant potentiellement l'expression de la transcription des gènes cibles en se liant directement à des séquences riches en GC [2], ce qui fonctionne comme un suppresseur de tumeur par inhibition de la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion cellulaire dans le cancer gastrique.
Méthodes
culture cellulaire et le traitement
Les lignées cellulaires de cancer gastrique humain (AGS, MKN28, BGC823 et SGC7901) ont été obtenus à partir de Riken Gene Bank (Japon) et American type culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen, CA, USA) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et incubés à 5% de CO 2, 37 ° C et 95% d'humidité. des lignées cellulaires de cancer gastrique (AGS, BGC823 et SGC7901) ont été traitées avec 10 uM de cyclopamine (Sigma, St Louis, MO, USA) dans du DMSO pendant 24 heures. Une concentration équivalente du véhicule (DMSO) a été utilisé comme témoin.
Cellulaire transfection
AGS, MKN28, BGC823 et SGC7901 cellules ont été cultivées pendant 24 h dans une plaque de 6 puits et transfectées avec pcDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA 3.1 vecteur vide en utilisant Fugene HD (Roche) selon les instructions du fabricant. Au bout de 48 h, les transfectants ont été sélectionnés en continu dans un milieu RPMI 1640 contenant du G418 (200 à 400 pg /ml) (Merck, Allemagne) pendant 14 jours. Le plus RT-PCR et l'ARN total d'une analyse quantitative PCR en temps réel ( 1 ug) a été extrait en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) selon les instructions du fabricant et une transcription inverse en ADNc avec le kit M-MLV RTase de synthèse d'ADNc (Takara, Japon). Les niveaux de ZIC1 et Shh transcription ont été déterminés par RT-PCR classique avec TaKaRa Taq polymerase (Takara, Japon) ou quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) avec le kit SYBR Green Master Mix (Takara, Japon) dans un ABI 7500 système de PCR. Amorces utilisées pour ZIC1 étaient F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC et R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Shh étaient F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG et R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Glycéraldéhyde-3-; déshydrogénase phosohate (GAPDH) a été utilisé comme témoin interne. Les niveaux de transcription sont exprimés en 2 -ΔΔCt valeurs et changement relatif expression de pliage est normalisée à GAPDH.
Test de viabilité cellulaire
viabilité cellulaire a été détectée avec un essai de prolifération cellulaire non radioactif avec 3- (4,5- diméthylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxyméthoxyphényl) -2- (4-sulfophényl) -2 H-tétrazolium (MTS) réactifs (Promega, Madison, Etats-Unis). des cellules transfectées stables ont été plaquées dans 96 puits (2000 cellules /puits) pendant 6 h, 24 h, 72 h et 120 h. L'absorbance a été mesurée à 490 nm après 1 heure d'incubation avec le réactif CellTiter 96 Aqueous One Solution.
Du cycle cellulaire et analyse de l'apoptose des cellules
distributions de cycle cellulaire ont été détectés par l'analyse de cytométrie en flux. Les cellules transfectées avec pCDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA3.1 vecteur vide ont été récoltées et lavées avec du PBS. L'ADN cellulaire a été coloré avec une solution de coloration du cycle cellulaire contenant de l'iodure de propidium (PI) à 4 ° C dans l'obscurité. cycle cellulaire a été déterminée en utilisant un FACS Calibur et analysé avec le logiciel ModFitLT (Phoenix, Etats-Unis).
l'apoptose des cellules a été réalisée en utilisant FITC Annexin V Apoptose Detection Kit II (BD Pharmingen) par cytométrie de flux. cellules transfectées transitoirement ont été suspendues en Annexin V Binding Buffer. Puis solutions FITC Annexin V et PI ont été ajoutés dans l'ordre. Après incubation pendant 15 minutes, les cellules colorées ont été analysées par flux FACScan de cytométrie de flux (Becton Dickinson, USA).
Migration cellulaire et l'invasion des essais
migration cellulaire a été évaluée par Boyden modifiée TRANSWELL chambres dosage (carottage, États-Unis). En bref, les cellules ont été cultivées dans un milieu exempt de sérum pendant 24 h et 5 × 10 4 cellules ont été ensemencées dans la chambre supérieure à 300 ul de milieu contenant 5% de FBS. Après 16 heures d'incubation, les cellules non-migrateurs dans la chambre supérieure ont été soigneusement enlevées avec un coton-tige. Les cellules migrées ont été colorées avec du DAPI Coloration Solution. Les nombres de cellules ont été comptés au hasard en cinq domaines (grossissement x 400).
Invasion des cellules a été réalisée dans un millipore de 24 puits revêtue de Matrigel BD. Après la famine dans un milieu exempt de sérum pendant 24 h, 1 × 10 5 cellules ont été étalées à la chambre supérieure dans 300 ul de milieu contenant du FBS à 5%, tandis que la chambre inférieure a été remplie avec 600 pi de milieu de culture avec 15% FBS. Après avoir été mis en incubation pendant 30 heures, les membranes ont été incubées avec la solution de cellules Stain (Millorpore, États-Unis). Le mélange de colorants a été lavé par le tampon d'extraction et transféré dans un 96 puits pour la mesure colorimétrique à 560 nm.
Analyse par transfert de Western
Les protéines totales ont été extraites de cellules à l'aide de radio-immunoprécipitation du tampon analytique de lyse additionné d'un inhibiteur de protéase. Les lysats ont été résolus sur des minigels de 6 à 12% de SDS-PAGE et transférés sur des membranes de PVDF (Millipore, Bedford, MA). Les membranes ont été bloquées dans 5% de lait avec du TBST et on fait incuber à 4 ° C pendant une nuit avec les anticorps suivants: ZIC1 (1: 500; Abcam), phospho-Akt (1: 1000; Cell Signaling), Akt (1: 500; Abcam), phospho-ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), p21 WAF1 /Cip1 (1: 1000; Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500; Epitomics), la cycline D1 (1: 1000; Cell Signaling) et Shh (1: 1000; Cell Signaling). En conséquence, des anticorps secondaires couplés à la peroxydase de raifort (HRP) ont été visualisées en utilisant une chimioluminescence avec Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japon). Les densités relatives des protéines ont été quantifiées avec le logiciel et J. image normalisées par rapport à la ß-actine. (1: 2500, Multisciences Biotech) L'ARN total
ADNc microréseau analyse a été isolé à partir de cellules MKN28 transfectées de manière stable avec pCDNA3.1 -ZIC1 ou pCDNA3.1 vecteur vide, et a été une transcription inverse en ADNc. échantillons marqués ont été hybridées avec Agilent génome humain entier contenant plus de 41.000 sondes (http:.....? //www NCBI nlm nih gov /geo /query /acc cgi acc = GSE38924). Les données de puces à ADN ont été analysées à l'aide du logiciel Agilent Feature Extraction. Nous avons sélectionné un facteur de changement ≥1.5 ou ≤ -1.5 comme une différence significative statistique analyse.
T
test de Student a été effectuée pour comparer les données de deux indépendants, alors que le test exact de pêcheurs Chi-carré ou a été utilisé pour analyser les variables catégorielles. Une coupure de p < 0,05 a été appliqué pour la signification statistique.
Jing Zhong Notes, Shujie Chen a contribué également à ce travail.
Déclarations
Accusé
Le projet a été soutenu par le National Natural Science Foundation de Chine (30900676, 81071961), Programme de recherche de base nationale de Chine (Programme 973) (2012CB945004) et de la science et de la technologie projet clé de la province du Zhejiang en Chine (2009 C03012-3). Les auteurs remercient le Professeur Tianhua Zhou et le professeur Lei Guo suggestions et discussions utiles; . Et Thomas R. Austin pour examen critique et édition du manuscrit
matériel supplémentaire électronique
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff fichiers supplémentaires 1: Figure S1.
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