ZIC1 modula distribuições do ciclo celular e migração celular através da regulação de sonic hedgehog, PI
3K e MAPK vias de sinalização em câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
ZIC1, um fator de transcrição vital com domínios dedos de zinco, tem sido implicados no processo de desenvolvimento neural. Anteriormente mostrou que ZIC1 pode funcionar como um supressor tumoral em cancros gastrointestinais. No entanto, o mecanismo molecular subjacente ZIC1 participação na progressão tumoral permanece desconhecida.
Methods of the papel de ZIC1 sobre a proliferação e migração celular foi examinada. Os resultados foram avaliados a regulação da sonic hedgehog (Shh), fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3K) e MAP quinase (MAPK) vias de sinalização após a expressão ectópica de ZIC1 em células cancerosas gástricas.
a sobre-expressão de ZIC1 contribui para a inibição da migração de células e proliferação de distribuição do ciclo celular no cancro gástrico. A modulação do G1 /S checkpoint por ZIC1 é mediada principalmente através da regulação das quinases dependentes da ciclina (p21 WAF1 /Cip1, p27 KIP1 e ciclina D1). Além disso, ZIC1 podem inactivar o nível de phospholated Akt e ERK1 /2, e transcricionalmente regular sonic hedgehog (Shh) de sinalização, conduzindo assim para regular a expressão de p21 WAF1 /Cip1 e ciclina D1. Finalmente, temos sistematicamente identificados ZIC1 alvos a jusante por meio de análise de cDNA microarray e revelou que 132 genes são regulados negativamente e 66 genes são regulados positivamente após transfecção com ZIC1 em células cancerosas gástricas. Estes genes candidatos desempenham papéis críticos na proliferação de células, do ciclo celular e a motilidade celular.
Conclusões A sobre-expressão de ZIC1 resultados na inactivação de Shh, PI 3K e MAPK vias de sinalização, bem como a regulação de vários alvos a jusante que são essenciais para o desenvolvimento e progressão do cancro gástrico. ZIC1 serve como um potencial alvo terapêutico para o câncer gástrico.
Palavras-chave
ZIC1 sonic hedgehog ciclo celular do tumor supressor de fundo
ZIC1, um dos cinco genes da família ZIC, está envolvida em uma variedade de processos de desenvolvimento, incluindo a neurogênese e miogénese [1, 2]. Recentemente, tem sido documentada ZIC1 para participar na progressão de tumores humanos, incluindo meduloblastoma, cancro do endométrio, cancros e neoplasias mesenquimais lipossarcoma [3-6]. Foi anteriormente mostrado que o gene ZIC1 é significativamente regulada negativamente em tecidos de cancro gástrico e linhas de células quando comparada com a de tecidos gástricos normais. Além disso, ZIC1 potencialmente serve como um supressor de tumores por inibição da proliferação celular em células de cancro gástrico e colorectal [7, 8]. Como um fator de transcrição importante, ZIC1 é essencial para a regulação do Hedgehog sinalização (HH), proteína morfogenética óssea (BMP), e Notch vias de sinalização no desenvolvimento neural [2, 9]. No entanto, pouco se sabe sobre como ZIC1 regula vias de sinalização e os seus alvos a jusante relacionados em progressão do câncer.
O câncer gástrico é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [10, 11]. sinalização de Hh é uma das vias de sinalização oncogénicos chave envolvidos na carcinogénese gástrica [12, 13]. Hedgehog Sonic (Shh), um membro da família de Hh de mamífero [14], foi demonstrada a ser tanto regulada positivamente em tecidos de cancro gástrico em pelo ensaio de hibridação in situ e essencial para a progressão do cancro gástrico [13, 15]. via de sinalização de Hh é activada por ligação de Shh com a Patched (Ptch) - Smoothened de membrana do receptor (Smo) complexo [16]. A activação de Shh promove a diferenciação de células de cancro gástrico e proliferação. Tem sido relatado que ZIC1 poderia reduzir a expressão de Shh e PTCH1
genes no tecido neuronal durante o desenvolvimento do cérebro anterior [17]. Em contraste, a evidência mostrou que a Shh reprime a expressão de ZIC1 durante o desenvolvimento do tubo neural [18]. No entanto, a influência de ZIC1 na via de sinalização de Hh em cancro gástrico permanece desconhecida.
ZIC1 também regula numerosos objectivos, incluindo a ciclina D1, p27, Wnt1 e Wnt7a durante o desenvolvimento neural em explantes de Xenopus e ectodérmicos modelos de ratos mutantes [19, 9, 20]. Estamos particularmente interessados em reguladores do ciclo celular importantes para a proliferação de células cancerígenas e diferenciação. Temos demonstrado anteriormente que a superexpressão de ZIC1 pode alterar G1 /S de transição em células cancerosas gástricas [8]. Vários mecanismos de quinases dependentes de ciclina (CDKs) são envolvidos na regulação de G1 /S do ponto de verificação em cancros humanos [21]. Durante a transição da fase G1 para a fase S, a ciclina D que forma complexos activos com CDK4 é sobre-regulada no cancro gástrico [22, 23]. Perda de inibidores da quinase dependente de ciclina, tais como p21 WAF1 /Cip1 e p27 Kip 1 promover a atividade CDK2 e regular o G1 /S de transição [12, 24]. Estudos recentes têm demonstrado que o mutante ZIC1 ou força sobre-expressão de ZIC1 regula a expressão de p27 Kip 1 em ratinhos tecidos e células cerebelares lipossarcoma [3, 20]. Curiosamente, a via de sinalização do Shh regula negativamente p21 WAF1 /Cip1 e ciclina D1 de um modo dependente-GLI1 [16, 25]. No entanto, se ZIC1 pode interagem com Shh percurso na regulação da distribuição do ciclo celular não foi definido. A elucidação desta rede de sinalização pode fornecer uma visão mais aprofundada do papel da ZIC1 no câncer gástrico.
Em nosso estudo, demonstramos que a superexpressão de ZIC1 suprime a migração de células de câncer gástrico e invasão, bem como altera a distribuição do ciclo celular. ZIC1 pode transcrição regular negativamente a sinalização Shh e suprimir o nível de phospholated Akt e Erk, portanto, leva à regulação do regulador do ciclo celular quinases p21 WAF1 /Cip1, p27 KIP1 e ciclina D1 em células cancerosas gástricas. Foram também identificados vários alvos a jusante ZIC1 importante em células cancerosas gástricas por análise de cDNA microarray.
Resultados
ZIC1 inibe a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro gástrico
Para determinar o efeito de ZIC1 sobre a proliferação celular, foi realizada análise de viabilidade celular por ensaios MTS em células cancerosas gástricas. linhas celulares de cancro gástrico (AGS, MKN28, BGC823 e SGC7901) foram transfectadas com pCDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA3.1 vector vazio. A eficiência de transfecção foi confirmada por RT-PCR e western blot, respectivamente (Figura 1A). Os resultados mostraram que o número de células viáveis foi significativamente suprimida pela expressão ectópica de ZIC1 em uma observação de 5 dias em BGC823 células (Figura 1B). A supressão da proliferação celular por ZIC1 foi consistente com as nossas observações anteriores em AGS e células de cancro gástrico MKN28, bem como células de cancro do cólon [7, 8]. Figura 1 ZIC1 suprime a proliferação e migração celular no cancro gástrico. (A) linhas celulares de cancro gástrico (AGS, MKN28, BGC823 e SGC7901) foram estavelmente transfectadas com pCDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA3.1 vector vazio. Os níveis de mRNA e proteína ZIC1 de expressão foram realizados por RT-PCR (diagrama superior) e Western blot (baixo diagrama). GAPDH e β-actina foram utilizados como controlos internos. (B) A viabilidade das células de linha celular de cancro gástrico (BGC823) foi determinada pelo ensaio de proliferação celular MTS. O asterisco indica significância estatística (** p < 0. 01). (C) A migração celular foi avaliada através de Boyden modificada Transwell ensaios câmaras após incubação durante 16 h. As células que migraram para a parte inferior da membrana foram coradas com DAPI. (D) O número de células migratórias visíveis (média ± D.P.) foi estimado por contagem cinco campos aleatórios de alta potência (400 × de ampliação). Estas experiências foram realizadas em triplicado. Os dados representativos são mostrados. O asterisco indica significância estatística (*** p < 0,001).
Além disso, determinou-se o papel de ZIC1 na migração celular e invasão de cancro gástrico. Os ensaios de migração e invasão celular foram realizados em Transwell migração e Matrigel-revestidas sistemas de ensaio de invasão, respectivamente. Observou-se que a re-expressão de ZIC1 suprimiu significativamente a migração celular em AGS, BGC823 SGC7901 e linhas celulares de cancro gástrico (p < 0,001) (figura 1C, D). Além disso, a re-expressão de ZIC1 exibido uma actividade significativamente menor de invasão celular, quando em comparação com os transfectantes vector vazio em células AGS (p < 0,05) (arquivo adicional 1: Figura S1). Estes dados sugerem que a expressão ectópica de ZIC1 suprime a migração celular e invasão do cancro gástrico.
ZIC1 altera distribuições do ciclo celular e regula a expressão de quinases dependentes de ciclina em células de cancro gástrico
Para melhor compreender os mecanismos subjacentes à inibição de proliferação celular por sobre-expressão de ZIC1, avaliou-se as distribuições do ciclo celular em células de cancro gástrico. Observou-se uma maior proporção de células em fase G1 em AGS (42,74%) e SGC7901 (54,03%) linhas de células, após sobre-expressão de ZIC1. No entanto, nas células transfectadas com um vector de controlo, a proporção diminuiu tanto em AGS (32,66%) e SGC7901 (47,00%) e a percentagem de células na fase S foi relativamente aumentado (Figura 2A). É bem aceite que a p21 (também conhecida como p21 WAF1 /Cip1) e P27 (também conhecida como p27 KIP1), dois principais inibidores de quinase dependentes de ciclina, são necessários para a cessação durante a entrada para a fase S [26]. A activação da ciclina D1, no entanto, é principalmente responsável pela regulação da transição de fase G1-S [23]. Demonstrou-se que o nível de proteína ciclina D1 expressão foi reduzido, enquanto a p21 e p27 foram significativamente induzida em células de cancro gástrico transfectadas com pCDNA3.1-ZIC1 quando em comparação com os transfectantes pCDNA3.1 vector vazio (Figura 2B). Avaliamos também as distribuições de apoptose celular em pCDNA3.1-ZIC1 ou transfectantes vector pcDNA3.1 em células AGS e MKN28, mas há diferenças óbvias de apoptose celular foram observados (arquivo adicionais 2: Figura S2). Portanto, estes resultados confirmam que a sobre-expressão de ZIC1 altera a distribuição do ciclo celular através da regulação da ciclina cinases dependentes de p21, p27, bem como a ciclina D1 em células de cancro gástrico. Figura 2 ZIC1 altera as distribuições do ciclo celular pela regulação de p21, p27 e ciclina D1 em células cancerosas gástricas. distribuições de ciclo celular (A) foram detectadas por análise de citometria de fluxo em AGS e SGC7901 células após a transfecção transiente com pCDNA3.1-ZIC1 ou vector pcDNA3.1 vazio durante 24 h. (B) Os níveis de p21, p27 e expressão da ciclina D1 foi determinada por transferência de Western. β-actina foi detectado como um controlo de carga. Densitometria valores são expressos como alteração de dobragem em comparação com valores de controlo de vector pcDNA3.1 normalizados para 1. (C) Os níveis de phospholated Akt e ERK1 /2 de expressão, bem como Akt total de e ERK1 /2 foram analisados por Western blot.
MAPK e PI 3K vias desempenham um papel vital na regulação das quinases do ciclo celular. Avaliou-se a expressão das principais efectores a jusante destas duas vias, ERK1 /2 e AKT, após a introdução de forma estável pCDNA3.1-ZIC1 a AGS, MKN28, e BGC823 SGC7901 células de cancro gástrico (Figura 1A). Nós descobrimos que os níveis de fosforilação de ERK1 /2 e Akt foram dramaticamente suprimida por sobre-expressão de ZIC1 em todas as linhas celulares testadas acima (Figura 2C). Estes resultados sugerem que a regulação da distribuição das células-cylce por ZIC1 pode ser mediada através de PI 3K e MAPK e sua jusante quinases dependentes da ciclina p21, p27 e ciclina D1 em câncer gástrico.
ZIC1 suprime a expressão de sonic hedgehog (Shh) em células cancerosas gástricas
caracterização molecular mostrou que ZIC1
tem domínios de dedos de zinco e poderia neutralizar com GLI1 por ligação a sequências ricas em GC [2]. GLI1 é um alvo a jusante do hedgehog (hh) via de sinalização que é essencial para o desenvolvimento de câncer gástrico e progressão [9, 27]. Colocámos a hipótese de via de sinalização Hh pode estar envolvido na regulação da célula ZIC1-ciclo cancro gástrico e a migração celular. Para abordar esta questão, que examinaram a expressão do Sonic hedgehog (Shh), um membro chave da família Hh, em células de câncer gástrico após superexpressão de ZIC1. Descobrimos que a re-expressão de ZIC1 reduz eficazmente a expressão de Shh em BGC823 SGC7901 e linhas de células por análise de transferência de Western (Figura 3A). Além disso, a análise de RT-PCR demonstrou que o nível de transcrição de Shh também é regulada negativamente de forma significativa em células de cancro gástrico transfectadas com ZIC1 relação ao transfectantes vector vazio (p < 0,01) (Figura 3B) (ficheiro adicional 3: Figura S3). . Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que ZIC1 transcricionalmente pode regular a expressão de Shh em células de cancro gástrico. Figura 3 ZIC1 inibe a expressão de hedgehog Sonic (Shh). (A) A expressão de proteína Shh foi analisada por Western blot e em BGC823 SGC7901 células estavelmente transfectadas com pCDNA3.1-ZIC1 ou vector vazio pCDNA3.1. (B) O nível de ARNm de Shh expressão foi determinado por análise de RT-PCR quantitativo em tempo real. O nível de expressão relativa foi expressa como alteração vezes (média ± SEM), comparada com o vector pcDNA3.1 vazio normalizados para 1.
Hedgehog (Hh) via de sinalização está envolvido na regulação de ZIC1-ciclo celular e migração celular no cancro gástrico células
para determinar o efeito de Shh em distribuições do ciclo celular, procurou-se analisar os efeitos do inibidor farmacológico da sinalização de Hh sobre a expressão da p21 e ciclina D1. AGS, BGC823 SGC7901 e linhas celulares de cancro gástrico foram tratados com ciclopamina (10 uM), um alcalóide de esteróides que interage directamente com Smo para inibir a sinalização de Hh [28], ou controlo de DMSO, durante 24 h. Observou-se que o nível de expressão de p21 foi significativamente regulada para cima, enquanto que a ciclina D1 regulada para baixo depois de as células tumorais foram tratadas com ciclopamina (Figura 4A). Digno de nota, o bloqueio da via de sinalização de Shh por administração de ciclopamina não afecta os níveis de expressão de mRNA em ZIC1 BGC823 e SGC7901 células por ensaios de RT-PCR (Figura 4B). A expressão ausente ou baixa de mRNA ZIC1 em células cancerosas gástricas foi meditado principalmente por metilação do DNA promotor como descrito anteriormente [8]. Figura 4 via de sinalização Hh está envolvida na expressão de p21, a ciclina D1 e regulação da migração de células. AGS, e BGC823 SGC7901 células gástricas cancerosas foram tratados com ciclopamina (10 uM), um alcalóide de esteróides que interage directamente com Smo para inibir a sinalização de Hh, ou controlo de DMSO, durante 24 h. (A) Os níveis de p21 e ciclina D1 expressão foi determinada por western blot em AGS, BGC823 e SGC7901 células. (B) O nível de ARNm ZIC1 expressão foi analisada através de RT-PCR convencional. (C) A migração celular foi avaliada através de Boyden modificada Transwell ensaios câmaras. As células que migraram para a parte inferior da membrana foram coradas com DAPI. (D) O número médio de células migratórias visíveis (média ± D.P.) foi calculada em cinco campos aleatórios de alta potência (400 ×). O asterisco indica significância estatística (*** p < 0,001).
Também foram avaliados os efeitos de sinalização Shh sobre a migração de células de câncer gástrico. Como mostrado na Figura 4 C e D, AGS, e BGC823 SGC7901 linhas celulares de cancro gástrico mostraram uma diminuição significativa na migração celular após a administração com ciclopamina (10 uM) durante 24 h (p < 0,01). Colectivamente, estes resultados demonstram que ZICI podem modular os reguladores do ciclo celular e a migração de células através de Shh de sinalização em células de cancro gástrico.
Perfil de expressão do gene por alterações da expressão ectópica ZIC1
Para determinar sistematicamente alvos a jusante de ZIC1, realizamos um microarray affymatrix oligonucleotídeo em MKN28 células cancerosas gástricas com ou sem pCDNA3.1-ZIC1. Utilizando um corte de > 1,5 vezes para significância estatística, um microarray revelou que 132 genes são regulados negativamente enquanto 66 genes são regulados positivamente por expressão exógena de ZIC1 (genes representativos mostrados na Figura 5A). Muitos genes foram relatadas como desempenham papéis críticos na proliferação celular, o ciclo celular e migração de células de acordo com a análise funcional do gene (http:.. //Www GeneCards org) (Figura 5B). Por exemplo, dois reguladores do ciclo celular chave TP53INPI Comprar e CDKN2B
são encontrados para ser desregulamentados MKN28 células transfectadas com pCDNA3.1-ZIC1. Os nossos resultados indicam que ZIC1 potencialmente regula múltiplos genes a jusante envolvidos na tumorigénese gástrico. Figura 5 Gene mudanças no perfil de expressão após a expressão ectópica de ZIC1. (A) Os perfis de expressão de genes em pCDNA3.1-ZIC1 ou transfectantes estáveis vector pcDNA3.1 vazio foram analisadas por micromatriz de ADNc em células MKN28. os genes representativos são ilustrados no lado direito da imagem de mapa de calor usando um cut-off > 1,5, ou < -1.5 Dobrar como uma diferença significativa ,. (B) genes envolvidos no ciclo celular, a proliferação celular e migração de células de acordo com a análise funcional do gene (http:.. //Www GeneCards org) são apresentados. mudança vezes em relação é expressa com a razão entre pCDNA3.1-ZIC1 versus controlo pCDNA3.1. (C) compreensão sistémica de vias para ZIC1 regulação de genes alvo e de sinalização para o desenvolvimento e progressão do cancro gástrico.
Discussão
evidências crescentes têm mostrado que ZIC1 está envolvida na progressão de vários tumores [3-8] . Parece que ZIC1 é expresso de forma aberrante em certos tipos de cancro e funções diferencialmente como um supressor de tumor ou gene oncogénico. Por exemplo, a expressão ZIC1 foi relatado para ser baixa ou ausente em linhas de células de cancro do pulmão e gastrointestinais, e verificou-se suprimir a proliferação de células de cancro gastrointestinal [7, 8, 29]. Em contraste, a sobre-expressão de ZIC1 em lipossarcoma foi encontrada para promover a proliferação celular e invasão [3]. Nós e outros demonstraram que as modulações epigenéticas, incluindo a metilação do DNA e remodelação histona, e mutações genéticas podem contribuir para os seus padrões de expressão diferencial em cancros [3, 4, 7, 8]. Está se tornando claro que, como um fator de transcrição dedo de zinco, ZIC1 podem modular vários genes a jusante no tecido neural, células cancerosas e lipossarcoma colorretal [2, 3, 7, 9]. No entanto, pouco se conhece sobre a função ZIC1 subjacente mecanismo no desenvolvimento e progressão do cancro gástrico. Ressaltando as vias principais e alvos a jusante regulados por ZIC1 pode facilitar nossa compreensão dos seus papéis na tumorigênese. Aqui, demonstramos que sobreexpressão de ZIC1 resulta na inibição significativa da sobrevivência celular e diminuição da migração celular. ZIC1 suprime as vias de sinalização Shh, PI3K e MAPK que são fundamentais para a regulação da distribuição do ciclo celular e migração celular no cancro gástrico. Além disso, ZIC1 inibe cinases do ciclo celular, reguladores p21, p27 e ciclina D1, conduzindo assim a G1 /S do ciclo celular de trânsito em células de cancro gástrico. ZIC1 suprime a via de sinalização do Shh, que é crítico para a regulação da distribuição do ciclo celular e na migração de células do cancro gástrico.
MAPK e PI 3K vias desempenham papéis críticos na proliferação celular, diferenciação, e a progressão de uma variedade de cancros humanos [30]. Recentemente, também foi relatado que a activação de ambas as vias são essenciais para induzir a entrada do ciclo celular [30, 31]. Durante este processo, dependente de ciclina inibidores de cinase p21, p27 e ciclina D /E participar na regulação de p53 induzida paragem do ciclo celular [24, 32]. A activação de MAPK e a sua jusante de quinase-Erk poderá não apenas conduzir à indução de ciclina D1 e passar através G1 /S do ponto de verificação, mas também a acumulação de p21, que inibe complexos ciclina E /CDK2 a bloquear a entrada na fase S [30] . PI 3K /Akt poderia inativar os fatores GSK3-beta e de transcrição FOXO, assim, inibir a ciclina D1, enquanto induzir a p27 e p21 na regulação da entrada do ciclo celular [31]. Mostrámos que re-expressão de ZIC1 inactivam eficazmente a Akt fosforilada e ERK1 /2 em AGS, MKN28, e BGC823 SGC7901 linhas celulares de cancro gástrico. A este respeito, o inibidor de p21 CDK1 foi activado, enquanto que a ciclina D1 inactivado, após sobre-expressão de ZIC1 em células de cancro gástrico. Embora os resultados precisam ser validados em estudos futuros, os nossos dados miroarray revelaram que outros componentes-chave de reguladores do ciclo celular da quinase incluindo TP53INPI Comprar e CDKN2B
, estão desregulados com expressão forçada de ZIC1 em um MKN28 célula cancerosa gástrica indivíduo A linha (Figura 5 A e B). Por isso, propomos que ZIC1 regula G1 /S de trânsito, principalmente através PI 3K e MAPK caminhos e quinases do regulador do ciclo celular a jusante em células cancerosas gástricas.
Outra constatação importante em nosso estudo é que ZIC1 transcrição regula o Sonic hedgehog (Shh) de sinalização em células cancerosas gástricas. Além do seu papel central na regulação da morfogénese glândula gástrica no estômago humano, sinalização Shh também está envolvida na patogénese do cancro gástrico [16, 33]. Shh é frequentemente ativada em adenocarcinomas gástricos avançados e associada ao comportamento agressivo tumor [13, 15, 33]. Estudos anteriores têm demonstrado que a sinalização do Shh promove a motilidade e invasividade de células gástricas cancerosas através de Smad3-TGF-β ALK5 via [34]. Shh sinalização pode também regular a expressão de p21 e ciclina D1 numa via Gli-dependente [16, 25]. Temos observado que a inibição da sinalização de Shh por administração com ciclopamina suprime AGS, BGC823 SGC7901 e migração de células de cancro gástrico, e regula a expressão de p21 e ciclina D1 (Figura 4). Estes resultados são consistentes com estudos previamente relatados [25, 34]. Assim, temos revelou que ZIC1 desempenha um papel importante na progressão do cancro gástrico pela regulação da via de sinalização Shh.
ZIC1 pode regular genes alvo em ambos os modos específicos de sequência e independentes [9]. ZIC1 poderia regular a expressão transcricional de objectivos, incluindo a ciclina D1, p27, Wnt1 e Wnt7a, e modulam Notch e BMP caminhos no desenvolvimento neural [2, 9]. ZIC1 poderia contrariar GLI por ligação a sequências ricas em GC, e suprimir a expressão de genes repórter de sequência de ligação dirigido GLI [9, 35]. Foram identificados vários genes potencial alvo ZIC em células cancerosas gástricas por análise de microarray. Estes objectivos estão intimamente relacionadas com ciclo celular, proliferação e migração celular (Figura 5B). A associação entre ZIC e alvos a jusante pode ser uma pista para compreender a perspectiva potencial de proteínas ZIC na progressão do câncer gástrico.
Conclusões
Sumariamente, propomos um modelo que representa os caminhos através dos quais ZIC1 contribui para o câncer gástrico progressão (Figura 5C). Superexpressão de resultados ZIC1 em suprimir Hedgehog (Hh) de sinalização e os seus alvos a jusante incluindo p21, p27 e ciclina D1. Como um factor de dedo de zinco de transcrição, ZIC1 também potencialmente modula a expressão transcricional de genes alvo por directamente a ligação a sequências ricas em GC [2], assim funcionar como um supressor do tumor por inibição da proliferação celular, a migração celular e invasão de cancro gástrico.
Métodos
cultura celular e tratamento
As linhas celulares de cancro gástrico humano (AGS, MKN28, e BGC823 SGC7901) foram obtidos a partir de Riken Gene Bank (Japão) e American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA ). Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, CA, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e incubadas em 5% de CO 2, 37 ° C e 95% de humidade. linhas celulares de cancro gástrico (AGS, BGC823, e SGC7901) foram tratadas com 10? M de ciclopamina (Sigma, St Louis, MO, EUA) em DMSO durante 24 horas. Uma concentração equivalente do veículo (DMSO) foi utilizado como controlo.
Transfecção celular
AGS, MKN28, e BGC823 SGC7901 células foram cultivadas durante 24 h em uma placa de 6 cavidades e foram transfectadas com pcDNA3.1-ZIC1 ou pCDNA 3.1 vector vazio utilizando Fugene HD (Roche) segundo as instruções do fabricante. Após 48 h, os transfectantes foram seleccionados de forma contínua em meio RPMI 1640, contendo G418 (200-400 ug /mL) (Merck, Alemanha) durante 14 dias.
RT-PCR e análise por PCR em tempo real quantitativo
ARN total ( 1 ug) foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante e reversamente transcrito em ADNc com M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japão). Os níveis de transcrição de ZIC1 e Shh foram determinados por RT-PCR convencional com TaKaRa Taq polimerase (Takara, Japão) ou quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) com o kit de SYBR Green Master Mix (Takara, Japão) em ABI 7500 sistema de PCR. Os iniciadores utilizados para ZIC1 F foram: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC e R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Shh foram F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG e R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Gliceraldeído-3-; phosohate desidrogenase (GAPDH) foi usada como um controlo interno. Os níveis de transcritos são expressos como 2 -ΔΔCt valores e mudanças expressão vezes em relação é normalizada para GAPDH. Ensaio de viabilidade celular
A viabilidade celular foi detectado com um ensaio de proliferação celular não radioactivo com 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio (MTS) reagentes (Promega, Madison, EUA). As células transfectadas estáveis foram colocadas em placas em 96 poços (2000 células /poço), durante 6 h, 24 h, 72 h e 120 h. A absorvância foi medida a 490 nm após 1 h de incubação com o reagente CellTiter 96 Aqueous One Solution. Cell-ciclo
e análise de apoptose celular
distribuições do ciclo celular foram detectados por análise de citometria de fluxo. As células transfectadas com pCDNA3.1-ZIC1 ou vector vazio pCDNA3.1 foram colhidas e lavadas com PBS. O ADN celular foi corada com solução de coloração do ciclo celular contendo iodeto de propídio (PI) a 4 ° C no escuro. ciclo celular foi determinada utilizando um FACS Calibur e analisados com o software ModFitLT (Phoenix, EUA).
apoptose celular foi realizada utilizando FITC anexina V Apoptosis Detection Kit II (BD Pharmingen) por análise de citometria de fluxo. As células transfectadas de forma transiente foram suspensos em Tampão de Ligação Anexina V. Em seguida, soluções de FITC anexina V e PI foram adicionados em sequência. Após incubação durante 15 min, as células coradas foram analisadas por citometria de fluxo FACScan de fluxo (Becton Dickinson, EUA).
Migração celular e invasão ensaios
migração celular foi avaliada através de Boyden modificada Transwell câmaras de ensaio (Coring, EUA). Resumidamente, as células foram cultivadas em meio livre de soro durante 24 h e 5 × 10 4 células foram plaqueadas para a câmara superior em 300 uL meio contendo 5% de FBS. Após 16 h de incubação, as células não-migratórias no cenáculo foram cuidadosamente removidos com um cotonete. As células migraram foram coradas com DAPI coloração Solution. Os números de células foram contadas em cinco campos aleatoriamente (400x de ampliação).
Invasão celular foi realizada em um Millipore de 24 cavidades revestidas com Matrigel BD. Depois de inanição em meio isento de soro durante 24 h, 1 × 10 5 células foram plaqueadas para a câmara superior em 300 uL de meio contendo FBS a 5%, enquanto a câmara inferior foi preenchida com 600 ul de meio de cultura com 15% FBS. Depois de terem sido incubadas durante 30 h, as membranas foram incubadas com Cell Stain Solution (Millorpore, EUA). A mistura de corantes foi lavada com tampão de extracção e transferida para um de 96 poços para a medição colorimétrica a 560 nm.
Análise de Western blot
proteínas totais foram extraídas a partir de células usando o radio-imunoprecipitação de lise tampão de ensaio suplementado com inibidor da protease. Os lisados foram separados em minigéis de 6-12% SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA). As membranas foram bloqueadas em leite 5% em TBST e incubaram-se em 4 ° C durante a noite com os anticorpos seguintes: ZIC1 (1: 500; Abcam), fosfo-Akt (1: 1000; Cell Signaling), Akt (1: 500; Abcam), fosfo-ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), p21 WAF1 /Cip1 (1: 1000; Cell Signaling), p27 KIP1 (1: 500; Epitomics), ciclina D1 (1: 1000; Cell Signaling) e Shh (1: 1000; Cell Signaling). Por conseguinte, os anticorpos secundários acoplados a peroxidase de rábano silvestre (HRP) foram visualizadas utilizando um quimioluminescência com Las-Imaging System 4000 (Fujifilm, Japão). As densidades relativas das proteínas foram quantificadas com imagem J. software e normalizado para p-actina. (1: 2500, Multisciences Biotech)
análise de cDNA microarray
O ARN total foi isolado a partir de células MKN28 que estavelmente transfectadas com pCDNA3.1 -ZIC1 ou vector vazio pCDNA3.1, e foi transcrito de forma inversa em ADNc. amostras marcadas foram hibridizados com toda Agilent genoma humano contém mais de 41.000 sondas (http:.....? //www NCBI NLM nih gov /geo /query /acc cgi acc = GSE38924). Os dados de microarranjos foram analisados usando Agilent software Feature Extraction. Nós selecionamos uma mudança vezes ≥1.5 ou ≤ -1.5 como uma diferença significativa.
Análise estatística
teste t
de Student foi realizado para comparar dados de dois independentes, enquanto o teste exato de qui-quadrado ou Fisher foi utilizado para analisar as variáveis categóricas. Um corte de p < 0,05 foi aplicado para significância estatística.
Notas
Jing Zhong, Shujie Chen contribuíram igualmente para este trabalho.
Declarações
Reconhecimento
O projecto foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (30.900.676, 81071961), Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa) (2012CB945004) e Ciência e Tecnologia de projeto chave da Província de Zhejiang, na China (2009 C03012-3). Os autores são gratos ao Prof. Tianhua Zhou e Prof. Lei Guo para sugestões úteis e discussão; . E Thomas R. Austin para revisão crítica e edição do manuscrito material suplementar eletrônico
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff arquivo adicionais 1: Figura S1.
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