ZIC1 модулирует распределения клеточного цикла и миграцию клеток путем регулирования звуковой еж, PI3K и МАРК сигнальных путей при раке желудка

ZIC1 модулирует распределения клеточного цикла и миграцию клеток путем регулирования звуковой еж, PI <суб> 3K и МАРК сигнальных путей при раке желудка
Аннотация
Справочная информация
ZIC1, жизненно важного фактора транскрипции с доменами цинковых пальцев, имеет участвует в процессе развития нервной системы. Ранее мы показали, что ZIC1 может функционировать как опухолевый супрессор при желудочно-кишечных раковых образований. Однако, молекулярный механизм, лежащий в основе участия ZIC1 в прогрессии опухоли остается неизвестной.
Методы
Роль ZIC1 на клеточной пролиферации и миграции была рассмотрена. Регулирование звуковой еж (Shh), фосфоинозитидного 3-киназы (PI <суб> 3K) и митоген-активируемая протеинкиназа (МАРК) сигнальных путей после эктопической экспрессии ZIC1 в клетках рака желудка оценивали.
Результаты
Избыточная экспрессия ZIC1 способствует торможению миграции пролиферации клеток и распределение клеточного цикла при раке желудка. Модуляция G1 /S контрольной точки по ZIC1 главным образом опосредовано регуляции циклин-зависимых киназ (р21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 и циклин D1). Кроме того, ZIC1 может инактивировать уровень phospholated Akt и ERK1 /2, и транскрипционно регулируют звуковой еж (Shh), сигнализирующих, что приводит к регуляции экспрессии р21 Waf1 /Cip1 и циклин D1. Наконец, мы определили системно ZIC1 нижестоящих мишеней при помощи анализа кДНК микрочипов и показал, что 132 генов понижающей регуляции и 66 генов повышающей регуляции после трансфекции ZIC1 в раковых клетках желудка. Эти гены-кандидаты играют важную роль в пролиферации клеток, клеточного цикла и подвижности клеток.
Выводы
оверэкспрессия ZIC1 результатов в инактивации Shh, PI <суб> 3K и МАРК сигнальных путей, а также регулирование нескольких нижестоящих мишеней которые имеют важное значение для развития и прогрессирования рака желудка. ZIC1 служит в качестве потенциальной терапевтической мишени для рака желудка.
Ключевые слова
ZIC1 Соник цикла ежа Cell Опухоль супрессора фон
ZIC1, один из пяти генов семьи ZIC, участвует в различных процессах развития, в том числе и нейрогенеза миогенез [1, 2]. В последнее время ZIC1 было зарегистрировано для участия в прогрессии опухолей человека, включая медуллобластоме, рака эндометрия, мезенхимальных новообразований и липосаркома видов рака [3-6]. Ранее мы показали, что ген ZIC1 значительно подавлена ​​в желудочном раковые ткани и клеточных линий по сравнению с этим нормальных тканей желудка. Кроме того, ZIC1 потенциально служит в качестве супрессора опухоли путем ингибирования пролиферации клеток в желудочном и клеток колоректального рака [7, 8]. В качестве важного фактора транскрипции, ZIC1 имеет важное значение для регуляции передачи сигналов Hedgehog (Hh), костного морфогенетического белка (BMP), и Notch сигнальных путей в развитии нервной системы [2, 9]. Тем не менее, мало известно о том, как ZIC1 регулирует сигнальные пути и связанные с ними вниз по течению цели в прогрессии рака.
Рак желудка является второй ведущей причиной рака, связанных смерти во всем мире [10, 11]. передача сигналов Hh является одним из ключевых онкогенных сигнальных путей, вовлеченных в желудочном канцерогенезе [12, 13]. Звуковой еж (Shh), членом млекопитающих семейства Hh [14], было продемонстрировано, что как усиливается в раковых тканях желудка с помощью гибридизация анализа в систему и существенно важное значение для прогрессирования рака желудка [13, 15]. Hh сигнальный путь активируется с помощью Shh связывания с Пропатченный (Ptch) - сглаженный (SMO) мембранно-рецепторного комплекса [16]. Активация Shh способствует желудочной дифференциации раковых клеток и пролиферации. Сообщалось, что ZIC1 может снизить экспрессию pTCH1
и SHH
генов в нервной ткани во время развития переднего мозга [17]. В отличие от этого, данные показали, что Тсс репрессирует экспрессию ZIC1 во время развития нервной трубки [18]. Тем не менее, влияние на ZIC1 сигнального пути Hh в развитии рака желудка остается неизвестным.
ZIC1 также регулирует многочисленные цели, включая циклина D1, Р27, Wnt1 и Wnt7a во время развития нервной системы в Xenopus эктодермальными эксплантов и мутантных моделей мышей [9, 19, 20]. Мы особенно заинтересованы в регуляторов клеточного цикла, важных для пролиферации и дифференцировки клеток рака. Ранее мы показали, что избыточная экспрессия ZIC1 может изменить переход G1 /S в клетках рака желудка [8]. Несколько механизмов циклин-зависимая киназа (CDKS) участвуют в регуляции G1 /S контрольной точки в злокачественных опухолях человека [21]. При переходе от G1 к фазе S, циклин D, который образует активные комплексы с CDK4 является повышающей регуляции при раке желудка [22, 23]. Потеря циклинзависимых ингибиторов киназы, такие как p21 Waf1 /Cip1 и p27 Кип 1 способствуют CdK2 активности и регулируют G1 /S переход [12, 24]. Недавние исследования показали, что мутант ZIC1 или сила избыточная экспрессия ZIC1 регулирует экспрессию р27 Кип 1 у мышей мозжечка тканей и клеток липосаркома [3, 20]. Интересно, что сигнальный путь Тсс негативно регулирует p21 Waf1 /Cip1 и циклин D1 в Gli1-зависимым способом [16, 25]. Тем не менее, может ли ZIC1 взаимодействие с Shh пути в регуляции клеточного цикла распределений не была определена. Выяснение этой сигнальной сети может обеспечить дальнейшее понимание роли ZIC1 при раке желудка.
В нашем настоящем исследовании мы показали, что избыточная экспрессия ZIC1 подавляет желудочную миграцию раковых клеток и инвазии, а также изменяет распределение клеточного цикла. ZIC1 может транскрипционно подавляют сигналы Shh и подавить уровень phospholated Akt и Эрк, таким образом, приводит к регуляции регулятора клеточного цикла киназ р21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 и циклин D1 в клетках рака желудка. Мы также определили несколько ниже по течению цели важно ZIC1 в желудочном раковых клеток с помощью анализа кДНК микрочипов.
Результаты
ZIC1 ингибирует пролиферацию, миграцию и инвазии клеток рака желудка
Для определения влияния ZIC1 на пролиферацию клеток, мы провели анализ жизнеспособности клеток с помощью анализов МТС клеток рака желудка. Желудочный линий раковых клеток (AGS, MKN28, BGC823 и SGC7901) трансфицировали пкДНК3.1-ZIC1 или пкДНК3.1 пустым вектором. Эффективность трансфекции была подтверждена с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга соответственно (Рис. 1А) Результаты показали, что количество жизнеспособных клеток значительно подавляется эктопической экспрессии ZIC1 в наблюдении за 5 дней в BGC823 клетках (Фигура 1В). Подавление пролиферации клеток ZIC1 согласуется с нашими предыдущими наблюдениями в AGS и MKN28 рака желудка клетки, а также клетки рака толстой кишки [7, 8]. Рисунок 1 ZIC1 подавляет пролиферацию и миграцию клеток при раке желудка. (A) Желудочный клеточные линии рака (AGS, MKN28, BGC823 и SGC7901) стабильно трансфицировали с пкДНК3.1-ZIC1 или пкДНК3.1 пустым вектором. Уровни экспрессии мРНК ZIC1 и белка проводили с помощью ОТ-ПЦР (верхний график) и Вестерн-блоттинга (низкая диаграмма). GAPDH и β-актина были использованы в качестве внутреннего контроля. (Б) жизнеспособность клеток желудочного клеточной линии (BGC823) определяли с помощью анализа клеточной пролиферации MTS. Звездочка означает статистическую значимость (** р &Лт; 0. 01). (С) миграция клеток оценивали по модифицированной Бойден Transwell камерах анализов после инкубации в течение 16 ч. Клетки, которые мигрировали к нижней части мембраны окрашивали DAPI. (D) Число видимых мигрирующих клеток (среднее значение ± S.D) была оценена путем подсчета пять случайных полей высокой мощности (× 400 увеличении). Эти эксперименты проводились в трех экземплярах. Представительные данные показаны. Звездочка означает статистическую значимость (*** р &Лт; 0,001).
Кроме того, мы определили роль ZIC1 в миграции клеток и вторжения в рак желудка. клеточной миграции и инвазии анализы проводили в Transwell миграции и Матригель покрытием систем нашествие опробования, соответственно. Мы наблюдали, что повторное выражение ZIC1 в значительной степени подавленным миграцию клеток в AGS, BGC823 и SGC7901 желудка линий раковых клеток (р &ЛТ; 0,001) (рис 1C, D). Кроме того, повторное выражение ZIC1 проявляли значительно меньшую активность клеточного вторжения, когда по сравнению с теми пустыми векторных трансфектантов в AGS клетках (р ≪ 0,05) (Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Эти данные свидетельствуют о том, что эктопическая экспрессия ZIC1 подавляет желудочную миграцию раковых клеток и инвазию.
ZIC1 изменяет распределение клеточного цикла и регулирует экспрессию циклин-зависимых киназ в раковых клетках желудка
Для более глубокого понимания механизмов, лежащих в основе ингибирования пролиферации клеток с повышенной экспрессией ZIC1, мы оценивали распределение клеточного цикла в клетках рака желудка. Мы наблюдали более высокий процент клеток в G1 фазе в AGS (42,74%) и SGC7901 (54,03%) клеточных линий, после того, как избыточная экспрессия ZIC1. Тем не менее, в клетках, трансфецированных с контрольным вектором, доля была снижена как в AGS (32,66%) и SGC7901 (47,00%) и доли клеток в фазе S была относительно повышенном (фиг.2А). Хорошо принято, что p21 (также известный как p21 Waf1 /Cip1) и p27 (также известный как p27 Kip1), два основных Циклинзависимые ингибиторов киназы, которые необходимы для прекращения во время входа в S-фазе [26]. Активация циклина D1, однако, в основном отвечает за регулирование G1-S фазового перехода [23]. Мы показали, что уровень экспрессии белка циклина D1 была уменьшена в то время как р21 и р27 были заметно индуцированный в клеток рака желудка, трансфицированных пкДНК3.1-ZIC1 по сравнению с теми pCDNA3.1 пустым вектором трансфектантов (рис 2B). Мы также оценили распределение апоптоза клеток в пкДНК3.1-ZIC1 или pCDNA3.1 векторных трансфектантов в AGS и MKN28 клеток, но никаких очевидных различий клеточного апоптоза не наблюдалось (дополнительный файл 2: Рисунок S2). Таким образом, эти результаты подтверждают, что избыточная экспрессия ZIC1 изменяет распределение клеточного цикла посредством регулирования циклин-зависимых киназ p21, p27, а также циклина D1 в клетках рака желудка. Рисунок 2 ZIC1 изменяет распределение клеточного цикла путем регуляции p21, p27 и циклин D1 в клетках рака желудка. (A) распределения клеточного цикла были обнаружены с помощью проточной цитометрии в AGS и SGC7901 клеток после кратковременной трансфекции с пкДНК3.1-ZIC1 или пкДНК3.1 пустым вектором в течение 24 ч. (Б) Уровни экспрессии р21, р27 и циклин D1 определяли с помощью Вестерн-блоттинга. β-актин был обнаружен в качестве нагрузочного контроля. Значения Денситометрические выражены в виде кратного изменения по сравнению со значениями pCDNA3.1 контрольным вектором нормированы на 1. (C) уровни экспрессии phospholated Akt и ERK1 /2, а также общей Akt и ERK1 /2 были исследованы с помощью Вестерн-блоттинга.
МАРК и PI <суб> 3K пути играют жизненно важную роль в регуляции киназ клеточного цикла. Мы оценивали экспрессию основных нижестоящих эффекторов этих двух путей, ERK1 /2 и Akt, после того, как стабильно введения пкДНК3.1-ZIC1 к АГС, MKN28, BGC823 и SGC7901 клеток рака желудка (Рис. 1А) Мы обнаружили, что уровни фосфорилирование ERK1 /2 и Akt были подавлены резко сверхэкспрессией ZIC1 во всех линиях выше испытанных клеточных (фиг.2с). Эти результаты свидетельствуют о том, что регулирование распределения клеток по cylce ZIC1 может быть опосредовано через PI <югу> 3K и МАРК путей и их вниз по течению циклин-зависимые киназы p21, p27 и циклин D1 при раке желудка.
ZIC1 подавляет экспрессию Звуковой еж (Тсс) в клеток рака желудка
Молекулярная характеристика показала, что ZIC1
имеет домены цинком палец и может противодействовать с Gli1 путем связывания с GC-богатыми последовательностями [2]. Gli1 является нижестоящей мишенью ежа (чч) сигнального пути, который имеет важное значение для развития рака желудка и прогрессирования заболевания [9, 27]. Мы предположили, что сигнальный путь Hh может участвовать в регуляции ZIC1 рака желудка клеточного цикла и клеточной миграции. Для решения этой проблемы, мы исследовали экспрессию ежик Соник (Shh), одним из ключевых членов семьи Hh, в раковых клетках желудка после того, как избыточная экспрессия ZIC1. Мы обнаружили, что повторное выражение ZIC1 эффективно уменьшает экспрессию Shh в BGC823 и SGC7901 клеточных линий с помощью Вестерн-блот-анализа (рис 3A). Кроме того, анализ ОТ-ПЦР показал, что уровень транскрипта ВГГ также значительно подавлена ​​в желудочном раковых клетках, трансфицированных ZIC1 относительно пустого вектора трансфектантов (р ≪ 0,01) (рис 3б) (Дополнительный файл 3: Рисунок S3). , Взятые вместе, наши результаты свидетельствуют о том, что ZIC1 может транскрипционно регулировать экспрессию Shh в желудочном раковых клеток. Рисунок 3 ZIC1 ингибирует экспрессию ежик Соник (Тсс). (А) Экспрессия белка Shh анализировали с помощью Вестерн-блоттинга в BGC823 и SGC7901 клетки, стабильно трансфицированные пкДНК3.1-ZIC1 или пкДНК3.1 пустым вектором. (Б) Уровень экспрессии мРНК Тсс определяли в реальном времени количественного анализа RT-PCR. Было выражено относительный уровень экспрессии, как кратное изменение (среднее ± SEM) по сравнению с пкДНК3.1 пустым вектором нормированной 1.
Hedgehog (Hh) сигнальный путь участвует в регуляции ZIC1 клеточного цикла и миграции клеток при раке желудка клетки
чтобы определить влияние Shh на распределений клеточного цикла, мы стремились изучить влияние ингибитора фармакологического сигнализации Hh на экспрессию р21 и циклин D1. AGS, BGC823 и SGC7901 желудка клеточные линии рака обрабатывали cyclopamine (10 мкМ), стероидного алкалоида, который взаимодействует непосредственно с Smo ингибировать передачу сигналов Hh [28], или контроль ДМСО в течение 24 ч. Мы наблюдали, что уровень экспрессии p21 был значительно повышающей регуляции, в то время как циклин D1, понижающей регуляции после того, как опухолевые клетки обрабатывали cyclopamine (фиг.4А). Следует отметить, что блокирование сигнального пути Shh путем введения cyclopamine не влияет на уровни экспрессии мРНК ZIC1 в BGC823 и SGC7901 клеток с помощью анализов RT-PCR (рис 4б). Отсутствует или низкая экспрессия мРНК ZIC1 в клеток рака желудка, в основном, медитировал метилирование ДНК промотора, как было описано ранее [8]. Рисунок 4 Hh сигнального пути участвует в экспрессии р21, циклин D1 и регуляции клеточной миграции. АГС, BGC823 и SGC7901 рака желудка клетки обрабатывали cyclopamine (10 мкМ), стероидного алкалоида, который взаимодействует непосредственно с Smo ингибировать передачу сигналов Hh, или контроль ДМСО в течение 24 ч. (А) Уровень экспрессии p21 и циклин D1 определяли с помощью Вестерн-блоттинга в AGS, BGC823 и SGC7901 клеток. (Б) Уровень экспрессии мРНК ZIC1 исследовали с помощью обычной ОТ-ПЦР. (С) миграция клеток оценивали по модифицированной Бойден Transwell камерах анализов. Клетки, которые мигрировали к нижней части мембраны окрашивали DAPI. (D) Среднее число видимых мигрирующих клеток (среднее значение ± S.D) была рассчитана в пяти случайных полей высокой мощности (× 400). Звездочка означает статистическую значимость (*** р &Лт; 0,001).
Мы также оценивали влияние сигналов Shh на миграцию клеток рака желудка. Как показано на рисунке 4 С и D, AGS, BGC823 и SGC7901 линий рака желудка клеток показали значительное уменьшение клеточной миграции после введения с cyclopamine (10 мкМ) в течение 24 ч (р &л; 0,01). В совокупности эти результаты показывают, что ZICI могут модулировать регуляторов клеточного цикла и клеточной миграции посредством передачи сигналов Shh в желудочном раковых клеток.
Экспрессии генов изменения профиля эктопической экспрессии ZIC1
Систематическое определения вниз по течению целей ZIC1, мы провели affymatrix олигонуклеотид микрочипов в MKN28 клеток рака желудка с или без пкДНК3.1-ZIC1. Использование отсечение &Гт в 1,5 раза для статистической значимости, микрочипов показало, что 132 генов вниз регулируется в то время как 66 гены повышающей регуляции экзогенной экспрессии ZIC1 (представительных генов, показанной на рисунке 5А). Многие гены, как сообщалось, играют важную роль в пролиферации клеток, клеточный цикл и миграции клеток в соответствии с генного функционального анализа (HTTP:.. //WWW GeneCards орг) (Фиг.5В). Например, два ключевых регуляторов клеточного цикла TP53INPI
и CDKN2B
будут признаны дерегулирование в MKN28 клетках tranfected с пкДНК3.1-ZIC1. Наши результаты указывают на то, что потенциально ZIC1 регулирует несколько ниже по течению генов, участвующих в желудочном онкогенеза. Рисунок 5 Генные изменения профиля экспрессии после эктопической экспрессии ZIC1. (А) Профили экспрессии генов в пкДНК3.1-ZIC1 или пустых pCDNA3.1 векторных стабильных трансфектантов анализировали с помощью кДНК-микрочипов в MKN28 клетках. Типичные гены показаны на правой стороне Heatmap изображения, используя отсечку > 1,5 или &л; -1,5 Раза, как значительная разница ,. (Б) генов, участвующих в клеточном цикле, клеточной пролиферации и миграции клеток в соответствии с геном функционального анализа (HTTP:.. //WWW GeneCards орг) представлены. Относительное изменение раза выражается отношением пкДНК3.1-ZIC1 по сравнению с контролем пкДНК3.1. (C) системного понимания путей для ZIC1 регуляции сигнализации и генов-мишеней в развитии и прогрессии рака желудка.
Обсуждение
Growing доказательств показал, что ZIC1 участвует в прогрессии опухолей нескольких [3-8] , Оказывается, что ZIC1 является аберрантно выражается в определенных типах рака и дифференциально функций в качестве супрессора опухоли или онкогенного гена. Например, выражение ZIC1, как сообщалось, с низким или отсутствует в желудочно-кишечного тракта и рака легких клеточных линий, и было обнаружено, чтобы подавить желудочно-кишечного тракта пролиферации раковых клеток [7, 8, 29]. В отличие от этого, было обнаружено, что сверхэкспрессия ZIC1 в липосаркомы, чтобы способствовать клеточной пролиферации и инвазии [3]. Мы и другие показали, что эпигенетические модуляциями включая метилирование ДНК и гистонов ремоделирования и генетические мутации могут способствовать его паттернов дифференциальной экспрессии при раке [3, 4, 7, 8]. Становится ясно, что в качестве фактора транскрипции цинка палец, ZIC1 может модулировать множественные гены вниз по течению в нервной ткани, колоректальный рак и липосаркома клеток [2, 3, 7, 9]. Тем не менее, мало известно о механизме основной функции ZIC1 в развитии и прогрессии рака желудка. Подчеркивая основные пути и вниз по течению цели, регулируемые ZIC1 может облегчить наше понимание его роли в онкогенеза. Здесь, мы показали, что избыточная экспрессия ZIC1 приводит к значительному ингибированию выживаемости клеток и нарушению клеточной миграции. ZIC1 подавляет сигнальные пути Тсс, PI3K и МАРК, которые имеют решающее значение для регуляции распределений клеточного цикла и миграции клеток при раке желудка. Кроме того, ZIC1 ингибирует клеточного цикла регуляторные киназы, Р21, Р27 и циклина D1, таким образом приводя к транзиту клеточного цикла G1 /S в клетках рака желудка. ZIC1 подавляет сигнальный путь Shh, который имеет решающее значение для регуляции распределений клеточного цикла и миграции клеток при раке желудка.
МАРК и PI <суб> 3K пути играют решающую роль в клеточной пролиферации, дифференцировки и прогрессии в различных злокачественных опухолей человека [30]. В последнее время, также сообщалось, что активация обоих путей необходимы, чтобы вызвать вступление клеточного цикла [30, 31]. Во время этого процесса зависит циклин ингибиторов киназы р21, р27 и циклин D /E участвуют в регуляции р53 индуцированного остановки клеточного цикла [24, 32]. Активацию МАРК и ее вниз по течению киназы-Эрка может привести не только к индукции циклин D1 и проходят через G1 /S контрольной точки, но и накопление p21, который ингибирует циклин Е /CdK2 комплексы, чтобы блокировать вход S-фазе [30] , PI <суб> 3K /Akt путь может инактивировать GSK3-бета и FOXO факторы транскрипции, таким образом, ингибируют циклин D1 в то время как индуцируют P27 и P21 в регуляции входа клеточного цикла [31]. Мы показали, что повторное выражение ZIC1 эффективно инактивировать фосфорилированного АКТ и ERK1 /2 в AGS, MKN28, BGC823 и SGC7901 желудочных клеточные линии рака предстательной. В связи с этим, ингибитор CDK1 P21 был активирован, в то время как циклин D1, инактивированные, после того, как избыточная экспрессия ZIC1 в клеток рака желудка. Хотя результаты должны быть подтверждены в будущих исследованиях, наши данные miroarray показали, что другие ключевые компоненты регуляторов киназ клеточного цикла, включая TP53INPI
и CDKN2B
, дерегулирования с принудительным выражением ZIC1 в индивидуальном MKN28 клетку рака желудка линия (рис 5 а и В). Таким образом, мы полагаем, что ZIC1 регулирует G1 /S транзит в основном через PI <югу> 3K и МАРК путей и вниз по течению клеточного цикла регулятора киназ в клетках рака желудка.
Другой основные выводы, сделанные в нашем настоящем исследовании является то, что ZIC1 транскрипционно регулирует Еж Соник (Тсс) сигнализации в клеток рака желудка. Помимо своей центральной роли в регулировании желудочного морфогенез железы в желудке человека, сигнализация Тсс также участвует в патогенезе рака желудка [16, 33]. Тсс часто активируется в передовых желудка аденокарциномы и связанные с агрессивным поведением опухоли [13, 15, 33]. Предыдущие исследования показали, что передача сигналов Shh способствует моторику и инвазивности клеток рака желудка с помощью TGF-бета-ALK5-Smad3 пути [34]. Тсс сигнализации может также регулировать экспрессию р21 и циклин D1 в Gli-зависимого пути [16, 25]. Мы заметили, что ингибирование передачи сигналов Shh путем введения с cyclopamine подавляет AGS, BGC823 и SGC7901 желудка миграции раковых клеток и регулирует экспрессию р21 и циклин D1 (рисунок 4). Эти результаты согласуются с ранее опубликованных исследований [25, 34]. Таким образом, мы показали, что ZIC1 играет важную роль в прогрессии рака желудка путем регуляции сигнального пути Shh.
ZIC1 может регулировать гены-мишени в обоих последовательность-специфических и независимых манер [9]. ZIC1 может регулировать транскрипционную экспрессию мишеней в том числе циклин D1, р27, Wnt1 и Wnt7a, и модулируют пути Notch и BMP в развитии нервной системы [2, 9]. ZIC1 может противодействовать GLI путем связывания с GC-богатых последовательностей, и подавляют экспрессию GLI-связывающую последовательность направлена ​​репортерных генов [9, 35]. Мы определили несколько ZIC потенциал генов-мишеней в желудочном раковых клеток с помощью анализа микрочипов. Эти цели тесно связаны с клеточным циклом, пролиферации и миграции клеток (Фиг.5В). Связь между ZIC и нижестоящих мишеней может быть ключом для понимания потенциальной перспективы ZIC белков в прогрессии рака желудка.
Выводы
бесцеремонно, мы предлагаем модель, которая представляет пути, через которые ZIC1 вносит свой вклад в рак желудка прогрессирование (5С). Сверхэкспрессия результатов ZIC1 при подавлении Hedgehog (Hh) сигнальных и его нижестоящих мишеней, включая p21, p27 и циклин D1. В качестве фактора цинковый палец транскрипции, ZIC1 также потенциально модулирует транскрипционную экспрессию генов-мишеней путем прямого связывания с GC-богатыми последовательностями [2], таким образом, функционирует как супрессор опухоли путем ингибирования пролиферации клеток, миграции клеток и вторжения в рак желудка. <бр> Методы
культура клеток и лечение
человеческого желудка линий раковых клеток (AGS, MKN28, BGC823 и SGC7901) были получены из банка генов Riken (Япония) и американской коллекции типовых культур (АТСС, Manassas, VA, США ). Все клеточные линии культивировали в среде RPMI 1640 (фирма Invitrogen, CA, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и инкубировали при 5% CO <суб> 2, 37 ° C и 95% влажности. Желудочный линий раковых клеток (АГС, BGC823 и SGC7901) обрабатывали 10 мкМ cyclopamine (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) в ДМСО в течение 24 часов. Эквивалентная концентрация транспортного средства (ДМСО), использовали в качестве контроля.
Трансфекции клеток
АГС, MKN28, BGC823 и SGC7901 клетки культивировали в течение 24 ч в 6-луночный планшет и трансфицировали pCDNA 3,1-ZIC1 или pCDNA 3.1 пустой вектор с использованием Fugene HD (Roche) в соответствии с инструкциями изготовителя. Через 48 часов трансфектанты непрерывно выбирается в среде RPMI 1640, содержащей G418 (200-400 мкг /мл) (Merck, Германия) в течение 14 дней.
RT-PCR и количественный ПЦР в реальном времени анализом
Суммарную РНК ( 1 мкг) экстрагируют с использованием тризола реагента (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя и обратной транскрипции в кДНК с М-MLV RTase Синтез кДНК Kit (Takara, Japan). Уровни Стенограмма ZIC1 и Shh определяли с помощью обычного RT-PCR с TaKaRa Taq-полимеразы (Takara, Япония) или количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) с комплектом SYBR Green Master Mix (Takara, Япония) в ABI 7500 система ПЦР. Праймеры, используемые для ZIC1 были F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC и R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Тсс были F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG и R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Глицеральдегид-3-; phosohate-дегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве внутреннего контроля. Уровни транскриптов выражаются в виде 2 -ΔΔCt значения и относительное изменение экспрессии раза нормирована на GAPDH.
Жизнеспособность клеток анализ
Жизнеспособность клеток определяли с помощью нерадиоактивного анализа клеточной пролиферации с 3- (4,5- диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2 Н-тетразолия (MTS) реагенты (Promega, Madison, USA). Стабильные трансфицированные клетки высевают в 96-луночный (2000 клеток /лунку) в течение 6 ч, 24 ч, 72 ч и 120 ч. Оптическую плотность измеряли при 490 нм после 1 ч инкубации с CellTiter 96 ВОДНОЙ реагентом Одно из возможных решений.
Клеточного цикла и анализ клеточного апоптоза
распределений для клеточного цикла были обнаружены с помощью проточной цитометрии анализа. Клетки, трансфицированные пкДНК3.1-ZIC1 или пкДНК3.1 пустого вектора собирали и промывали PBS. Клеточная ДНК окрашивали клеточного цикла красящий раствор, содержащий пропидиума йодида (PI) при 4 ° С в темноте. Клеточного цикла определяли с помощью FACS Calibur и проанализированы с помощью программного обеспечения ModFitLT (Phoenix, США).
Апоптозом клеток проводили с использованием FITC аннексина V апоптозом Detection Kit II (BD Pharmingen), с помощью проточной цитометрии. Трансфицированы клетки суспендировали в аннексина V связывающем буфере. Тогда FITC аннексина V и PI решения были добавлены в последовательности. После инкубации в течение 15 мин, Окрашенные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии FACScan потока (Becton Dickinson, США).
Клеточной миграции и инвазии анализы
Миграция клеток оценивали с помощью модифицированного Boyden Transwell камер анализа (удаление сердцевины, США). В кратком изложении, клетки культивировали в среде без сыворотки в течение 24 ч и 5 × 10 4 клетки высевали в верхней камере в 300 мкл среды, содержащей 5% FBS. Через 16 ч инкубации, не мигрирующие клетки в верхней камере были тщательно удалены с помощью ватного тампона. Перенесенные клетки окрашивали DAPI окрашивающего раствора. Числа клеток были случайным образом подсчитывали в пяти областях (× 400-кратное увеличение).
Инвазии клеток проводили в Millipore 24-луночного покрытого BD Матригель. После голодания в свободной от сыворотки среде в течение 24 ч, 1 × 10 5 клеток высевали в верхней камере в 300 мкл среды, содержащей 5% FBS, в то время как нижняя камера была заполнена 600 мкл культуральной среды с 15% ФБС. После того, инкубировали в течение 30 ч, мембраны инкубировали с Cell Stain раствором (Millorpore, США). Смесь краситель промывают путем экстракции буфера и переносили в 96-луночный для колориметрических измерений при 560 нм.
Вестерн-блот анализ
Всего белков были выделены из клеток с использованием радио-иммунопреципитации анализ лизис буфера с добавлением ингибитора протеазы. Лизаты были разрешены на 6-12% SDS-PAGE minigels и переносили на мембраны ПВДФ (Millipore, Bedford, MA). Мембраны блокировали в 5% молоке с TBST и инкубировали в 4 ° С в течение ночи со следующими антителами: ZIC1 (1: 500; Abcam), фосфо-Akt (1: 1000; Cell Signaling), Akt (1: 500; Abcam), фосфо-ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), p21 Waf1 /Cip1 (1: 1000; Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500; Epitomics), циклин D1 (1: 1000; Cell Signaling) и Тсс (1: 1000; Cell Signaling). Соответственно, вторичные антитела, соединенные с хрена peroxidise (HRP), визуализировали с помощью хемилюминесценции с Лас-4000 Imaging System (FUJIFILM, Япония). Относительные плотности белков были определены количественно с изображением J. программного обеспечения и нормализуется к бета-актина. (1: 2500, Multisciences Biotech)
анализа кДНК-микрочипов
Общую РНК выделяли из MKN28 клеток, которые стабильно трансфицированных pCDNA3.1 -ZIC1 или pCDNA3.1 пустой вектор, и подвергали обратной транскрипции в кДНК. Меченые образцы гибридизовали с Аджилент весь человеческий геном, содержащий более 41000 зондов (HTTP:.....? //WWW NCBI NLM NIH гов /гео /запрос /акк CGI акк = GSE38924). Данные микрочипов были проанализированы с использованием Agilent Характеристика Extraction программного обеспечения. Мы выбрали кратное изменение ≥1.5 или ≤ -1,5, как существенная разница.
Статистический анализ
т
Стьюдента проводили для сравнения двух независимых данных, в то время как хи-квадрат или точный критерий Фишера использовался для анализировать категориальные переменные. Отсечка р &ЛТ; 0,05 применялся для статистической значимости.
Notes
Цзин Чжун, Шуцзе Чен также внесли вклад в эту работу.
Объявления
Выражение признательности
Проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (30900676, 81071961), Национальный программы фундаментальных исследований Китая (+973 Program) (2012CB945004) и науке и технике Ключевой проект провинции Чжэцзян в Китае (2009 C03012-3). Авторы выражают благодарность профессору Tianhua Чжоу и профессор Го Lei за полезные советы и обсуждения; . И Томас Р. Остин для критического анализа и редактирования рукописи
Электронный дополнительный материал
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff Дополнительный файл 1: Рисунок S1. GAPDH, был использован в качестве внутреннего контроля.

• Рекомендации по размеру и положению хирургическим путем и gastrically имплантированных электронных меток в европ…
• инфекции связывает Желудочный Helicobacter Pylori с повышенным риском развития полипов в африканских Americans