| Stomach Health > Vatsa terveys >  > Stomach Knowledges > tutkimukset

ZIC1 moduloi solusyklin jakaumat ja solujen maahanmuuton sääntelyn Sonic Hedgehog, PI3K ja MAPK signaalireaktioteissä mahasyövän

ZIC1 moduloi solusyklin jakaumat ja solujen maahanmuuton sääntelyn Sonic Hedgehog, PI 3 K ja MAPK signaalireaktioteissä mahasyövässä
tiivistelmä
tausta
ZIC1, elintärkeä transkriptiotekijä kanssa sinkkisormidomeenia, on sekaantuneet prosessissa hermoston kehittymistä. Olemme aiemmin osoittaneet, että ZIC1 voi toimia tuumorisuppressori gastrointestinaalisten syöpien. Kuitenkin molekyylimekanismin taustalla ZIC1 osallistuminen syövän etenemiseen ei tunneta. Tool Menetelmät
rooli ZIC1 soluproliferaatioon ja muuttoliike tutkittiin. Sääntely sonic hedgehog (Shh), fosfoinositidi 3-kinaasi (PI 3 K) ja mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK) signalointipolkujen jälkeen ektooppinen ilmentyminen ZIC1 mahasyövän soluissa arvioitiin.
Tulokset
yliekspressio ZIC1 edistää soluproliferaation inhibointi kulkeutumista ja solujen syklin jakelun mahasyövässä. Modulointi G1 /S tarkastuspiste by ZIC1 pääasiassa välittyvät sääntelyn sykliiniriippuvaisten kinaasien (p21 Waf1 /CIP1, P27 Kip1 ja sykliini D1). Lisäksi ZIC1 voi inaktivoida tason phospholated Akt ja Erk1 /2, ja kopiointia säädellä Sonic Hedgehog (Shh) signalointia, mikä johtaa säätelemään p21 Waf1 /CIP1 ja sykliini D1. Lopuksi olemme systeemisesti tunnistettu ZIC1 myötävirtaan tavoitteensa cDNA mikrosiruanalyysillä ja paljasti, että 132 geenejä alassäädetty ja 66 geenejä säädellään ylöspäin transfektion jälkeen ZIC1 mahalaukun syöpäsoluja. Nämä kandidaattigeenit kriittisiä rooleja solujen lisääntymisen, solusyklin ja solun liikkuvuus.
Johtopäätökset
yliekspressio ZIC1 johtaa inaktivaation Shh, PI 3 K ja MAPK signalointireitteihin sekä sääntelyä useiden alavirran tavoitteiden jotka ovat välttämättömiä kehittymistä ja etenemistä mahasyövän. ZIC1 toimii mahdollisena terapeuttisena kohteena mahasyövän.
Avainsanat
ZIC1 Sonic hedgehog Cell cycle Kasvaimen suppressori tausta
ZIC1, yksi viidestä Žic perheen geenejä, on mukana erilaisia ​​kehitysprosesseja, mukaan lukien neurogenesis ja myogeneesin [1, 2]. Äskettäin ZIC1 on dokumentoitu osallistua etenemistä ihmisen kasvaimista kuten medulloblastoma, kohdun limakalvon syöpiä, mesenkymaaliset kasvaimet ja liposarkooma syöpiä [3-6]. Olemme aiemmin osoittaneet, että ZIC1 geeni on merkittävästi vaimentua mahasyövän kudoksissa ja solulinjoissa, kun verrataan normaalin mahan kudoksissa. Lisäksi, ZIC1 mahdollisesti toimii tuumorisuppressorina estämällä solujen proliferaatiota mahalaukun ja paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, [7, 8]. Tärkeänä transkriptiotekijä, ZIC1 on olennaista sääntelyn Hedgehog signalointi (Hh), luun morfogeneettinen proteiini (BMP), ja Notch signaalireaktioteissä hermoston kehittymistä [2, 9]. Kuitenkin vähän tiedetään miten ZIC1 säätelee signaalien kulkureiteillä ja niihin liittyviä loppupään tavoitteensa syövän etenemiseen.
Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [10, 11]. Hh signalointi on yksi tärkeimmistä onkogeenisten signalointireittejä mukana mahasyövän [12, 13]. Sonic hedgehog (Shh), jäsen nisäkkään Hh perhe [14], on osoitettu olevan sekä yliaktiivista mahasyövän kudoksiin in situ liuoshybridisaatiomääritysmenetelmä ja olennaisia ​​etenemisen mahasyövän [13, 15]. Hh-signalointireitin aktivoidaan Shh sitoutumisen kanssa paikattava (Ptch) - smoothened (Smo) kalvo-reseptorikompleksin [16]. Aktivointi Shh edistää mahasyövän solujen erilaistumista ja lisääntymistä. On raportoitu, että ZIC1 voi vähentää ilmentymistä PTCH1
ja Shh
geenien hermokudoksessa aikana etuaivojen kehitys [17]. Sen sijaan on saatu näyttöä siitä, että Shh tukahduttaa ilmentymisen ZIC1 aikana hermostoputken kehityksen [18]. Kuitenkin vaikutus ZIC1 on Hh-signalointireitin mahasyövän on tuntematon.
ZIC1 säätelee myös lukuisia tavoitteita kuten sykliini D1, P27, Wnt1 ja Wnt7a aikana hermoston kehittymistä Xenopus ektodermaalinen eksplanttien ja mutanttihiirillä malleja [9, 19, 20]. Olemme erityisen kiinnostuneita solusyklin sääntelyviranomaisten tärkeää syöpäsolujen lisääntymistä ja erilaistumista. Olemme aiemmin osoittaneet, että yli-ilmentyminen ZIC1 voi muuttaa G1 /S siirtymä mahasyövän soluissa [8]. Useat mekanismit sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK) osallistuvat säätelyyn G1 /S tarkastuspiste ihmisen syövissä [21]. Siirtymisen aikana G1: stä S-vaiheeseen, sykliini D joka muodostaa aktiivisia komplekseja CDK4 on säädelty mahasyövän [22, 23]. Menetys sykliiniriippuvaisten estäjät kuten p21 Waf1 /CIP1 ja p27 Kip 1 edistää CDK2 aktiivisuutta ja säätelevät G1 /S siirtyminen [12, 24]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että mutantti ZIC1 tai voiman yliekspressio ZIC1 säätelee ilmentymistä p27 Kip 1 hiirissä pikkuaivojen kudosten ja liposarkooma solujen [3, 20]. Mielenkiintoista, Shh signalointireitille säätelee negatiivisesti p21 Waf1 /CIP1 ja sykliini D1 on GLI1 riippuvaisella tavalla [16, 25]. Kuitenkin myös ZIC1 voi vuorovaikutus Shh väylän säätelyssä solusyklin jakaumien ei ole määritelty. Selvittäminen tämä signalointi verkko voi tarjota lisää tietoa roolista ZIC1 mahasyövän.
Meidän Esillä olevassa tutkimuksessa osoittavat, että yli-ilmentyminen ZIC1 tukahduttaa mahasyövän solumigraatioon ja invaasio, sekä muuttaa solusyklin jakaumat. ZIC1 voi transkriptionaalisesti downregulate SHH signalointi ja tukahduttaa taso phospholated Akt ja Erk, mikä johtaa säätelyyn solu- syklin säädin kinaasien p21 Waf1 /CIP1, P27 Kip1 ja sykliini D1 mahalaukun syöpäsoluja. Havaitsimme myös useita tärkeitä ZIC1 loppupään tavoitteita mahasyövän soluissa cDNA mikrosiruanalyysillä.
Tulokset
ZIC1 estää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen
määrittämiseksi vaikutuksen ZIC1 soluproliferaatioon, suoritimme solujen elävyyden analyysi MTS analyysit mahalaukun syöpäsoluja. Mahasyövän solulinjoissa (AGS, MKN28, BGC823 ja SGC7901) transfektoitiin pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 tyhjän vektorin. Transfektion tehokkuus varmistettiin RT-PCR: llä ja western blot (kuvio 1A). Tulokset osoittivat, että elävien solujen lukumäärä oli merkittävästi tukahdutti ektooppinen ilmentyminen ZIC1 on 5 päivän havainto BGC823 soluissa (kuvio 1 B). Tukahduttamista soluproliferaation ZIC1 oli yhdenmukainen aiempien havaintojen AGS ja MKN28 mahasyövän soluja, sekä paksusuolen syöpäsoluissa [7, 8]. Kuva 1 ZIC1 tukahduttaa soluproliferaatiota ja muuttoliikkeen mahasyövässä. (A) Mahalaukun syöpäsolulinjoissa (AGS, MKN28, BGC823 ja SGC7901) transfektoitiin stabiilisti pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 tyhjän vektorin. Ilmentymistasojen ZIC1 mRNA: ta ja proteiinia, suoritettiin RT-PCR: llä (ylempi kaavio) ja Western blot (pieni kuva). GAPDH ja β-aktiini käytettiin sisäisen valvonnan. (B) Solujen elinkelpoisuus mahalaukun syövän solulinja (BGC823) määritettiin MTS-soluproliferaatiomääritys. Tähti osoittaa tilastollista merkitsevyyttä (** p < 0. 01). (C) solumigraation arvioitiin muutettu Boyden Transwell kammiot määrityksiä inkubaation jälkeen 16 tuntia. Solut, jotka vaelsivat pohjaan kalvon värjättiin DAPI. (D) määrä näkyvän vaeltavia solujen (keskiarvo ± S.D) arvioitiin laskemalla viiden satunnaisen HPF (× 400 suurennus). Nämä kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Edustaja tiedot esitetään. Tähti osoittaa tilastollista merkitsevyyttä (*** p < 0,001).
Lisäksi määritimme rooli ZIC1 solujen maahanmuuton ja hyökkäyksen mahasyövässä. Solujen migraation ja invaasion määritykset suoritettiin siirtokuoppaan maahanmuutto- ja Matrigel päällystetty invaasiomääritys järjestelmiä, vastaavasti. Havaitsimme, että uudelleen ilmentyminen ZIC1 suppressoi merkittävästi soluvaelluksen AGS, BGC823 ja SGC7901 mahasyövän solulinjoissa (p < 0,001) (kuvio 1C, D). Lisäksi uudelleen ilmaus ZIC1 näkyy huomattavasti vähemmän aktiivisuutta solujen invaasio verrattaessa tyhjän vektorin transfektanttien in AGS soluissa (p < 0,05) (Additional tiedosto 1: Kuva S1). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ektooppinen ekspressio ZIC1 estää mahalaukun syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota.
ZIC1 muuttaa solusyklin jakaumat ja säätelee ilmentymistä sykliiniriippuvaisten kinaasien mahasyövän soluissa
edelleen ymmärtää mekanismit inhibition soluproliferaatiota yliekspressio ZIC1, arvioimme solusyklin jakaumat mahalaukun syöpäsoluja. Havaitsimme suurempi osuus solujen G1 vaiheeseen AGS (42,74%) ja SGC7901 (54,03%) solulinjoissa yliekspressio ZIC1. Kuitenkin, soluissa, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla, osuus on laskenut sekä AGS (32,66%) ja SGC7901 (47,00%) ja solujen osuus S-vaiheessa oli suhteellisen kasvoi (kuvio 2A). On yleisesti hyväksytty, että p21 (tunnetaan myös nimellä p21 Waf1 /CIP1) ja p27 (tunnetaan myös nimellä p27 KIP1), kaksi sykliiniriippuvainen estäjät, tarvitaan lopettamista aikana tulon S-vaihe [26]. Aktivointi sykliini D1 kuitenkin pääasiassa vastuussa sääntelystä G1-S-faasimuutos [23]. Olemme osoittaneet, että ilmentymisen taso sykliini D1-proteiinin väheni, kun taas p21 ja p27 olivat merkittävästi indusoitiin mahasyövän transfektoiduissa soluissa pCDNA3.1-ZIC1 verrattaessa pCDNA3.1 tyhjän vektorin transfektanttien (kuvio 2B). Olemme myös arvioineet apoptoosia jakaumat pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 vektori transfektanttien vuonna AGS ja MKN28 soluja, mutta ei ilmeisiä eroja solujen apoptoosin havaittiin (Additional tiedosto 2: Kuva S2). Siksi nämä tulokset tukevat että yliekspressio ZIC1 muuttaa solusyklin jakaumien säätelyn kautta sykliiniriippuvaisten kinaasien p21, p27 sekä sykliini D1 mahalaukun syöpäsoluja. Kuvio 2 ZIC1 muuttaa solusyklin jakaumat asetuksella p21, P27 ja sykliini D1 mahalaukun syöpäsoluja. (A) Cell cycle jakaumat havaittiin virtaussytometrialla analyysi AGS ja SGC7901 soluissa, sen jälkeen ohimenevän transfektion pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 tyhjän vektorin 24 tuntia. (B) ekspressio tasoja p21, p27 ja sykliini D1 määritettiin Western blot. β-aktiini havaittiin latauskontrollina. Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna pCDNA3.1 vektorisäädön arvot normalisoitu 1. (C) Ilmaus tasot phospholated Akt ja Erk1 /2, sekä kokonaisia ​​Akt ja Erk1 /2 tutkittiin Western blot.
MAPK ja PI 3 K väyliä elintärkeä tehtävä säätelyssä solusyklin kinaasien. Olemme arvioineet ekspression tärkeimmät alavirran efektorien näiden kahden reitin, Erk1 /2 ja Akt jälkeen stabiilisti käyttöön pCDNA3.1-ZIC1 AGS, MKN28, BGC823 ja SGC7901 mahasyövän soluja (kuvio 1A). Olemme havainneet, että fosforylaation taso Erk1 /2 ja Akt dramaattisesti vaimentaa yliekspressio ZIC1 kaikissa edellä testatuissa solulinjoissa (kuvio 2C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että sääntely solu-cylce jakautuminen ZIC1 voidaan välittyvän PI 3 K ja MAPK reittejä ja niiden loppupään sykliiniriippuvaisten kinaasien p21, P27 ja sykliini D1 mahasyövän.
ZIC1 tukahduttaa ilmaisun Sonic hedgehog (Shh) mahalaukun syöpäsoluissa
Molecular luonnehdinta on osoittanut, että ZIC1
on sinkki-sormidomaini ja voisi torjua kanssa GLI1 sitoutumalla GC-rikas sekvenssit [2]. GLI1 on alavirran kohde hedgehog (hh) signalointireitin, joka on välttämätöntä mahalaukun syövän kehittymisen ja etenemisen [9, 27]. Oletimme, että Hh-signalointireitin voi olla mukana ZIC1 asetuksessa mahasyövän solusyklin ja solumigraatio. Tämän kysymyksen, tutkimme ilmaus Sonic hedgehog (Shh), keskeinen jäsen Hh perhe, mahalaukun syöpäsoluissa jälkeen yliekspressio ZIC1. Olemme havainneet, että uudelleen ilmentyminen ZIC1 vähentää tehokkaasti Shh ilmentymistä BGC823 ja SGC7901 solulinjojen Western blot -analyysillä (kuvio 3A). Lisäksi RT-PCR-analyysi osoitti, että transkriptio taso Shh myös merkittävästi vaimentua mahasyövän transfektoiduissa soluissa ZIC1 suhteessa tyhjän vektorin transfektanttien (p < 0,01) (kuvio 3B). (Muita tiedosto 3: Kuva S3) . Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että ZIC1 voi transkriptionaalisesti säätelemään Shh mahalaukun syöpäsoluja. Kuvio 3 ZIC1 estää ilmentymistä Sonic hedgehog (Shh). (A): n ekspressio Shh-proteiinin analysoitiin Western blot BGC823 ja SGC7901 pysyvästi transfektoitujen solujen pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 tyhjän vektorin. (B) ekspressiotaso Shh-mRNA määritettiin reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR-analyysillä. Suhteellinen ilmentymistaso ilmaistiin kertainen muutos (keskiarvo ± SEM) verrattuna pCDNA3.1 tyhjällä vektorilla normalisoitu 1.
Hedgehog (Hh) signalointireitin on mukana ZIC1 säätely solusyklin ja solumigraatio mahasyövän solut
vaikutuksen määrittämiseksi Shh solujen syklin jakaumat, pyrimme vaikutusten tutkimiseksi farmakologisen estäjä Hh-signaloinnin ilmenemistä p21 ja sykliini D1. AGS, BGC823 ja SGC7901 mahasyövän solulinjoja käsiteltiin syklopamiinilla (10 uM), steroidista alkaloidi, joka on vuorovaikutuksessa suoraan Smo estää Hh signalointia [28], tai DMSO-kontrollin 24 tuntia. Havaitsimme, että ekspressiotaso p21 oli selvästi säädelty, kun taas sykliini D1 alassäädetty jälkeen kasvainsoluja käsiteltiin syklopamiinilla (kuvio 4A). Huomata, estää Shh signalointireitin antamalla syklopamiinin ei vaikuta ekspressiotasot ZIC1 mRNA: BGC823 ja SGC7901 solujen RT-PCR-määrityksissä (kuvio 4B). Puuttuvat tai alhainen ilmentyminen ZIC1 mRNA mahasyövän soluissa pääosin meditoi jonka promoottori DNA Metylointia kuvasimme aikaisemmin [8]. Kuva 4 Hh-signalointireitin osallistuu ilmaus p21, sykliini D1 ja sääntelyn solumigraation. AGS, BGC823 ja SGC7901 mahasyövän soluja käsiteltiin syklopamiinilla (10 uM), steroidista alkaloidi, joka on vuorovaikutuksessa suoraan Smo estää Hh signalointia, tai DMSO-kontrollin 24 tuntia. (EN) ekspressiotasot p21 ja sykliini D1 määritettiin western blot AGS, BGC823 ja SGC7901 soluja. (B) ekspressiotaso ZIC1 mRNA tutkittiin tavanomaisilla RT-PCR: llä. (C) Cell muuttoliikettä arvioitiin muutettu Boyden TranswellTM kammioita määrityksiä. Solut, jotka vaelsivat pohjaan kalvon värjättiin DAPI. (D) keskimääräinen lukumäärä näkyvissä vaeltavia solujen (keskiarvo ± S.D) laskettiin viidessä satunnaisessa HPF (x 400). Tähti osoittaa tilastollista merkitsevyyttä (*** p < 0,001).
Myös arvioitiin vaikutuksia Shh signaloinnin mahasyövässä solujen vaeltamiseen. Kuten kuviossa 4 C ja D, AGS, BGC823 ja SGC7901 mahasyövän solulinjat osoittivat merkittävää laskua solumigraatiota annon jälkeen syklopamiinilla (10 uM) 24 tunnin ajan (p < 0,01). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ZICI voi moduloida solun lukiertosäätelijöistä ja solumigraatio kautta Shh-signalointi mahalaukun syövän soluissa.
Geenien ilmentyminen profiili muuttuu ektooppinen ilmentyminen ZIC1
To järjestelmällisesti määrittämiseksi alavirtaan tavoitteet ZIC1, teimme affymatrix oligonukleotidi microarray in MKN28 mahasyövän soluja tai ilman pCDNA3.1-ZIC1. Käyttämällä katkeamisen > 1,5 kertainen tilastollista merkittävyyttä, microarray paljasti, että 132 geenejä alassäädetty taas 66 geenit ovat ajan säätelevät eksogeeninen ilmaus ZIC1 (edustaja geenien kuvassa 5A). Monet geenit on raportoitu kriittisiä rooleja solujen lisääntymisen, solusyklin ja solumigraatio mukaan geenin toiminta-analyysi (http: //www. Genecards. Org) (kuvio 5B). Esimerkiksi kaksi keskeistä solun lukiertosäätelijöistä TP53INPI
ja CDKN2B
on todettu vapautettiin MKN28 soluissa transfektoiduissa kanssa pCDNA3.1-ZIC1. Tuloksemme osoittavat, että ZIC1 mahdollisesti säätelee useiden alavirran geenien mahalaukun kasvaimien syntyyn. Kuva 5 geeniekspressioprofiili muutosten jälkeen ektooppinen ilmaus ZIC1. (EN) geeniekspressioprofiilien pcDNA3.1-ZIC1 tai tyhjän pCDNA3.1 vektorin vakaata transfektantit analysoitiin cDNA microarray sisään MKN28 soluissa. Edustavia geenit on esitetty oikealla puolella heatmap kuvan käyttämällä cut-off > 1,5 tai < -1,5-Kertaisesti niin merkittävää eroa ,. (B) Genes mukana solusyklin, solujen lisääntymisen ja solumigraatio mukaan geenin toiminta-analyysi (http: //www. Genecards. Org) esitetään. Suhteellinen kertainen muutos ilmaistaan ​​suhde pCDNA3.1-ZIC1 versus pCDNA3.1 ohjaus. (C) systeeminen ymmärtäminen väyliä ZIC1 sääntelyn signaloinnin ja kohdegeenien kehittymistä ja etenemistä mahasyövän.
Keskustelu
Kasvava näyttö on osoittanut, että ZIC1 osallistuu etenemisen useita kasvaimia [3-8] . Näyttää siltä, ​​että ZIC1 on poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​tiettyjen syöpien ja differentiaalisesti toimii tuumorisuppressorina tai onkogeenisten geeni. Esimerkiksi ZIC1 ilmentyminen raportoitiin olevan alhainen tai ei lainkaan gastrointestinaalisia ja keuhkosyövän solulinjat, ja sen havaittiin tukahduttaa maha-syöpäsolujen proliferaatiota [7, 8, 29]. Sen sijaan, yliekspressio ZIC1 on liposarkooma havaittiin edistää solujen lisääntymistä ja invaasiota [3]. Me ja muut ovat osoittaneet, että epigeneettiset modulaatiot lukien DNA: n metylaation ja histoni remodeling, ja geneettiset mutaatiot voivat vaikuttaa sen differentiaalikaavojen malleja syöpien [3, 4, 7, 8]. On käymässä selväksi, että koska sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijä, ZIC1 voi mukauttaa useita alavirran geenien Hermokudoksessa, peräsuolen syöpä ja liposarkooma solut [2, 3, 7, 9]. Kuitenkin vähän tiedetään mekanismia taustalla ZIC1 toiminnon kehittymistä ja etenemistä mahasyövän. Mikä korostaa avain reittejä ja loppupään tavoitteet säätelee ZIC1 voi helpottaa ymmärrystä sen tehtävistä kasvainten synnyssä. Tässä olemme osoittaneet, että yliekspressio ZIC1 aiheuttaa huomattavia eston solujen eloonjäämistä ja arvonalentumiset solumigraation. ZIC1 vaimentaa Shh, PI3K ja MAPK signalointireitteihin jotka ovat kriittisiä säätelyyn solu- syklin jakaumat ja soluvaelluksen mahasyövässä. Lisäksi ZIC1 estää solusykliä sääntelyyn kinaasien, p21, P27 ja sykliini D1, mikä johtaa G1 /S solusyklin kauttakulku mahalaukun syöpäsoluja. ZIC1 vaimentaa Shh signalointireitille joka on kriittinen säätelyyn solu- syklin jakaumat ja soluvaelluksen mahasyövässä.
MAPK ja PI 3 K väyliä kriittisiä rooleja solujen lisääntymisen, erilaistumisen, ja etenemistä erilaisissa ihmisen syövissä [30]. Äskettäin on lisäksi raportoitu, että aktivointi molemmat reitit ovat oleellista aikaansaada solusyklin alkamista [30, 31]. Tämän prosessin aikana sykliiniriippuvaiset estäjät p21, P27 ja sykliini D /E osallistuvat säätelyyn p53 indusoi solusykliä pidätys [24, 32]. Aktivointi MAPK ja sen loppupään kinaasi-Erk voinut johtaa ainoastaan ​​induktioon sykliini D1 ja kulkevat G1 /S tarkastuspiste, mutta myös kertyminen p21, joka estää sykliini E /CDK2 kompleksit estää S-vaihe tulo [30] . PI 3K /Akt-reitin voi inaktivoida GSK3-β ja FOXO transkriptiotekijöitä, mikä estää sykliini D1 taas aiheuttaa p27 ja p21 säätelyssä solusyklin entry [31]. Olemme osoittaneet, että uudelleen ilmentyminen ZIC1 tehokkaasti inaktivoida fosforyloidun Akt ja Erk1 /2 AGS, MKN28, BGC823 ja SGC7901 mahasyövän solulinjoissa. Tässä suhteessa CDK1 inhibiittori p21 on aktivoitu, kun taas sykliini D1 inaktivoidaan, kun yliekspressio ZIC1 mahalaukun syöpäsoluja. Vaikka tulokset on validoitu tulevissa tutkimuksissa, meidän miroarray tiedot ovat osoittaneet, että muut keskeiset komponentit solukierron kinaasin sääntelyviranomaisten lukien TP53INPI
ja CDKN2B
, sääntely on purettu, joissa on pakotettu ilmentymä ZIC1 yksilössä MKN28 mahasyövän solu rivi (kuvio 5 A ja B). Siksi ehdotamme, että ZIC1 säätelee G1 /S kauttakulku lähinnä PI 3 K ja MAPK polkuja ja loppupäässä solusyklin säädin kinaasien mahalaukun syöpäsoluja.
Toinen merkittävä havainto tämänhetkiseen tutkimuksessa on, että ZIC1 transkriptionaalisesti säätelee Sonic Hedgehog (Shh) signalointia mahasyövän soluissa. Paitsi sen keskeistä roolia sääntelystä maharauhanen morfogeneesissä ihmisen vatsassa, Shh signalointi osallistuu myös patogeneesiin mahasyövän [16, 33]. Shh usein aktivoidaan kehittynyt mahalaukun adenokarsinooman ja liittyy aggressiivinen kasvain käytös [13, 15, 33]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Shh signalointi edistää motiliteettia ja invasiivisuus mahalaukun syövän soluihin TGF-β-Alk 5-Smad3 reitti [34]. Shh signalointi voisi myös säätelemään p21 ja sykliini D1 on Gli-riippuvaisen reitin [16, 25]. Olemme havainneet, että esto Shh signaloinnin antamalla syklopamiinilla tukahduttaa AGS, BGC823 ja SGC7901 mahasyövän solujen vaeltamiseen, ja säätelee ilmentymistä p21 ja sykliini D1 (kuva 4). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiemmin raportoitujen tutkimusten [25, 34]. Niinpä on havaittu, että ZIC1 on merkittäviä rooleja mahasyövän etenemisen asetukseksi Shh signalointireitin.
ZIC1 voi säädellä kohdegeenien sekä sekvenssin erityisiä ja riippumaton tavoista [9]. ZIC1 voisi säädellä transkription ilmentymistä tavoitteiden kuten sykliini D1, P27, Wnt1 ja Wnt7a, ja moduloivat Notch ja BMP reittejä hermoston kehittymistä [2, 9]. ZIC1 voisi torjua GLI sitoutumalla GC-rikas sekvenssit, ja tukahduttaa ilmaisun GLI-sitovan sekvenssin suunnatun reportterigeenien [9, 35]. Olemme tunnistaneet useita Žic potentiaalia kohdegeenien mahasyövän soluissa mikrosiruanalyysillä. Nämä tavoitteet liittyvät läheisesti solusyklin, solujen lisääntymistä ja muuttoliike (kuvio 5B). Yhdistyksen välinen Žic ja loppupään tavoitteet saattavat olla aavistustakaan ymmärtämiseksi mahdollisten näkökulmasta Žic proteiinien etenemistä mahasyövän.
Johtopäätökset
Summittaisesti ehdotamme mallia, joka edustaa polkuja, jotka ZIC1 myötävaikuttaa mahasyövän etenemisen (kuvio 5C). N yli-ilmentyminen ZIC1 tulosten tukahduttamaan Hedgehog (Hh) signalointia ja sen loppupään tavoitteet lukien p21, P27 ja sykliini D1. Kuten sinkkisormen transkriptiotekijä, ZIC1 mahdollisesti myös moduloi transkriptiota ilmentymistä kohde- geenien suoraan sitovia GC-rikas sekvenssejä [2], mikä toimii tuumorisuppressorina estämällä solujen lisääntymisen, solumigraatio ja hyökkäyksen mahasyövässä.
menetelmät
Soluviljely ja käsittely
ihmisen mahalaukun syövän solulinjoissa (AGS, MKN28, BGC823 ja SGC7901) saatiin riken geenipankki (Japani) ja American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). Kaikkia solulinjoja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja inkuboitiin 5% CO 2, 37 ° C: ssa ja 95%: n kosteudessa. Mahalaukun syöpäsolulinjoissa (AGS, BGC823, ja SGC7901) käsiteltiin 10 uM syklopamiinin (Sigma, St Louis, MO, USA) DMSO: ssa 24 tunnin ajan. Vastaava pitoisuus ajoneuvon (DMSO) käytettiin kontrollina.
Cell transfektio
AGS, MKN28, BGC823 ja SGC7901 soluja viljeltiin 24 tunnin ajan 6-kuoppaiselle levylle ja transfektoitiin pCDNA 3.1-ZIC1 tai pCDNA 3.1 tyhjää vektoria käyttäen Fugene HD (Roche) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen, kun 48 tunnin transfektantit valitaan jatkuvasti RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi G418: aa (200-400 ug /ml) (Merck, Saksa) 14 päivää.
RT-PCR ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi
Kokonais-RNA ( 1 ug) uutettiin käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja käänteistranskriptio cDNA: M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japani). Transkriptio tasot ZIC1 ja Shh määritettiin tavanomaisella RT-PCR TaKaRa Taq-polymeraasia (Takara, Japani) tai kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) kanssa SYBR Green Master Mix Kit (Takara, Japani) ABI 7500 PCR-järjestelmä. Käytetyt alukkeet ZIC1 olivat F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC ja R: 5'- CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Shh olivat F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG ja R: 5'- GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Glyseraldehydi-3-, phosohate (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina. Otteen tasot ilmaistaan ​​2 -ΔΔCt arvot ja suhteellinen ilmaisu kertainen muutos normalisoidaan GAPDH.
Solunelinkykyisyysmääritys
Solujen elinkelpoisuus havaittiin ei-radioaktiivisella soluproleferaatiomäärityksessä 3- (4,5- dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsoliumia (MTS) reagenssit (Promega, Madison, USA). Stabiileja transfektoituja soluja maljattiin 96-kuoppaisille (2000 solua /kuoppa) 6 tuntia, 24 tuntia, 72 tuntia ja 120 tuntia. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä 1 h inkuboinnin CellTiter 96 Aqueous One Solution reagenssia.
Solusyklin ja solu- apoptoosin analyysi
Cell cycle jakaumia havaittiin, että virtaussytometrialla analysointia. Solut, jotka on transfektoitu pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 tyhjän vektorin otettiin talteen ja pestiin PBS: llä. Solujen DNA värjättiin solusyklin värjäys, joka sisälsi propidiumjodidi (PI) 4 ° C: ssa pimeässä. Solusyklin määritettiin käyttäen FACS Calibur ja analysoitiin ModFitLT ohjelmisto (Phoenix, USA).
Solujen apoptoosin suoritettiin käyttäen FITC anneksiini V Apoptosis Detection Kit II (BD Pharmingen) virtaussytometrialla analysointia. Ohimenevästi transfektoituja soluja suspendoitiin anneksiini V Binding Buffer. Sitten FITC anneksiini V ja PI liuokset lisättiin peräkkäin. Kun oli inkuboitu 15 minuutin ajan, värjättiin solut analysoitiin virtaussytometrialla FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, USA).
Solumigraation ja invaasion määritykset
migraatiota arvioitiin muutettu Boyden transwell kammioiden määrityksessä (Coring, USA). Lyhyesti, soluja viljeltiin seerumivapaassa väliaineessa 24 h ja 5 x 10 4 solut maljattiin ylempään kammioon 300 ui elatusainetta, joka sisälsi 5% FBS: ää. 16 tunnin kuluttua inkubaation, ei-vaeltavia solujen ylemmässä kammiossa poistettiin varovasti pumpulipuikolla. Siirtynyt Solut värjättiin DAPI värjäys Solution. Solumäärät satunnaistettiin laskettiin viidellä (x 400 suurennos).
Solujen invaasiota suoritettiin Milliporen 24 kuopan päällystetty BD Matrigel. Ruoattaolon jälkeen seerumittomassa väliaineessa 24 h, 1 x 10 5 solua maljattiin ylempään kammioon 300 ui elatusainetta, joka sisälsi 5% FBS: ää, kun taas alempi kammio täytettiin 600 ui elatusainetta, jossa on 15% FBS: ää. Sen jälkeen kun on inkuboitu 30 tuntia, kalvoja inkuboitiin Cell Stain Solution (Millorpore, USA). Väriaine Seos pestiin uuttopuskuria ja siirrettiin 96-kuoppaiselle kolorimetriseen mittaus 560 nm: ssä.
Western blot-analyysi
Yhteensä proteiinit uutettiin soluista käyttäen radioimmunologisissa määrityksen hajotuspuskuria, jota oli täydennetty proteaasi-inhibiittori. Lysaatit eroteltiin 6-12% SDS-PAGE minigeeleissä ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, Bedford, MA). Kalvot blokattiin 5% maito TBST ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli seuraavilla vasta-aineilla: ZIC1 (1: 500, Abcam), fosfo-Akt (1: 1000, Cell Signaling), Akt (1: 500, Abcam), fosfo-Erk1 /2 (1: 1000, Cell Signaling), Erk1 /2 (1: 1000, Cell Signaling), p21 Waf1 /CIP1 (1: 1000, Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500; Epitomics), sykliini D1 (1: 1000, Cell Signaling) ja Shh (1: 1000, Cell Signaling). Siten toissijainen vasta kytketty piparjuuri peroxidise (HRP) visualisoitiin käyttäen kemiluminesenssi Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japani). Suhteelliset tiheydet proteiinit kvantitoitiin Image J. ohjelmiston ja normalisoitiin p-aktiini (1: 2500, Multisciences Biotech).
CDNA microarray-analyysi
Kokonais-RNA eristettiin MKN28 soluja, jotka on stabiilisti transfektoitu pCDNA3.1 -ZIC1 tai pCDNA3.1 tyhjän vektorin, ja sen käänteistranskriptio cDNA: ksi. Merkityt näytteet hybridisoitiin Agilent koko ihmisen genomin sisältävät yli 41000 antureista (http: //www. NCBI. NLM. NIH. Gov /geo /kysely /acc. Cgi? Acc = GSE38924). Microarray data analysoitiin Agilent Feature Extraction ohjelmisto. Valitsimme kertamuutos ≥1.5 tai ≤ -1,5 kuin merkittävä ero.
Tilastollinen analyysi
Studentin t
suoritettiin verrata kahta riippumatonta dataa, kun taas Chi-square tai Fisherin tarkkaa testiä käytettiin analysoida kategorinen muuttujia. Cut-off p < 0.05 haettiin tilastollista merkittävyyttä.
Huomautuksia
Jing Zhong, Shujie Chen vaikuttanut yhtä tähän työhön.
Julistukset
kuittaus
Hanketta tukivat National Natural Science Foundation of China (30900676, 81071961), National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB945004) ja Science and Technology Key projekti Zhejiangin maakunnassa Kiinassa (2009 C03012-3). Kirjoittajat ovat kiitollisia professori Tianhua Zhou ja professori Lei Guo varten hyödyllisiä ehdotuksia ja keskustelua; ja Thomas R. Austin kriittisen tarkastelun ja editointi käsikirjoituksen.
Elektroninen oheismateriaali
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff Additional tiedosto 1: Kuva S1.
  • vatsa artikla
    •   
  • mahalaukun rakenne
    •   
  • Hoito Vatsa
    •   
  • tutkimukset

    • tutkimukset

    tutkimukset

    Other Languages

    Vatsa terveys © https://www.stomachillness.com/fi