| Stomach Health > gyomor egészség >  > Stomach Knowledges > kutatások

ZIC1 modulálja sejtciklus-eloszlás és a sejt migráció szabályozásán keresztül sonic hedgehog, PI3K és a MAPK jelátviteli utak gyomorrák

ZIC1 modulálja sejtciklus-eloszlás és a sejt migráció szabályozásán keresztül sonic hedgehog, PI 3K és a MAPK jelátviteli gyomorrákban katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa ZIC1, létfontosságú transzkripciós faktor cink-ujj domének, van szerepet játszik a folyamat a neurális fejlődés. Korábban kimutatták, hogy ZIC1 működhet, mint egy tumorszuppresszor gasztrointesztinális daganatok. Azonban a molekuláris mechanizmusa ZIC1 részvétel tumor progressziójának továbbra is ismeretlen.
Módszerek
A szerepe ZIC1 a sejtek proliferációját és migrációját vizsgáltuk. A szabályozás a Sonic hedgehog (Shh), foszfoinozitid-3-kináz (PI 3K) és a mitogén-aktivált protein-kináz (MAPK) jelátviteli után ektópiás expressziója ZIC1 gyomorkarcinómában sejteket értékeltük.
Eredmények
overexpressziója ZIC1 hozzájárul a sejtproliferáció migráció és sejtciklus eloszlása ​​gyomorrák. A moduláció a G1 /S ellenőrző pont által ZIC1 át közvetetten szabályozásán keresztül a ciklin-függő kinázok (p21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 és ciklin D1). Ezen túlmenően, ZIC1 képes inaktiválni a szint phospholated Akt és ERK1 /2, és transzkripció szabályozására Sonic hedgehog (Shh) jelző, ami így expresszióját szabályozzák P21 Waf1 /Cip1 és a ciklin D1. Végül már rendszerszinten azonosított ZIC1 downstream célpontok cDNS microarray és kiderült, hogy a 132 gének leszabályozott és 66 gének akár szabályozott transzfekció után ZIC1 gyomorrákban sejtekben. Ezek a jelölt gének kritikus szerepet játszanak a sejtproliferációban, a sejtciklus és a sejt motilitást.
Következtetések
túlexpressziója ZIC1 eredményezi inaktiválását Shh, PI 3K és a MAPK jelátviteli utak, valamint a szabályozás több downstream célpontok amelyek elengedhetetlenek a kialakulásában és fejlődésében gyomorrák. ZIC1 szolgál, mint egy potenciális terápiás célpontot gyomorrák.
Kulcsszavak
ZIC1 Sonic hedgehog Sejtciklus Tumor szuppresszor alapon
ZIC1, egyike annak az öt ZIC családi gének, részt vesz a különböző fejlődési folyamatok, beleértve a neurogenezis és izomképződés [1, 2]. Nemrégiben ZIC1 leírták, hogy részt vegyenek a progresszió humán tumorok, beleértve a medulloblasztóma, endometriális rákok, mesenchymalis neoplazmák és liposzarkóma rákok [3-6]. Korábban már kimutatták, hogy a ZIC1 gén jelentősen downregulált gyomorkarcinómában szövetekben és sejtvonalakban összehasonlítva a normál gyomor szövetekben. Ezen túlmenően, ZIC1 potenciálisan szolgál, mint a tumor szuppresszor gátlásával sejtproliferáció gyomor- és colorectalis rák sejtek [7, 8]. Ennek egyik fontos transzkripciós faktor, ZIC1 elengedhetetlen a szabályozás Hedgehog jelátviteli (Hh), csont morfogenetikus protein (BMP), és Notch jelátviteli utak idegi fejlődés [2, 9]. Azonban keveset tudunk arról, hogyan ZIC1 szabályozza szignálútvonalak és a hozzájuk kapcsolódó downstream célpontok a daganatos progresszió.
Gyomorrák a második vezető oka a rák okozta halál világszerte [10, 11]. Hh jelátvitel egyik legfontosabb onkogén jelátviteli utak részt gyomor karcinogenezis [12, 13]. Sonic hedgehog (Shh), tagja az emlős Hh család [14], Kimutatták, hogy mind a felülszabályozott gyomorrák szövetekben in situ hibridizációs vizsgálat és elengedhetetlen az progresszióját gyomorrák [13, 15]. Hh jelátviteli útvonal aktiválódik Shh kötődés a kötegelt (PTCH) - smoothened (SMO) membrán-receptor komplex [16]. Az aktiválás Csitt elősegíti gyomorrák sejtek differenciálódását és proliferációját. Leírták, hogy ZIC1 csökkentheti a kifejeződését PTCH1
és Shh
gének idegszövetben során előagy fejlesztés [17]. Ezzel szemben a bizonyítékok azt mutatják, hogy a Csitt elnyomja a kifejezés ZIC1 során velőcső fejlesztés [18]. Mindazonáltal befolyása ZIC1 a Hh jelátviteli gyomorrákban továbbra is ismeretlen.
ZIC1 is szabályozza számos cél, beleértve a ciklin D1, p27, Wnt1 és Wnt7a során idegi fejlődés Xenopusban ectodermalis explantátumok és mutáns egerek modellek [9, 19, 20]. Különösen érdekes számunkra sejtciklus szabályozó fontos a rákos sejtek proliferációját és differenciálódását. Korábban már kimutatták, hogy a túlzott mértékű expressziója ZIC1 megváltoztathatja G1 /S átmenetet a gyomorrák-sejtek [8]. Számos mechanizmus a ciklinfüggő kinázok (CDK-k) részt vesznek a szabályozás a G1 /S ellenőrző pont a humán rákok [21]. Áttérés során a G1 S fázis ciklin D képező aktív komplexek a CDK4 akár szabályozott gyomorrákban [22, 23]. Elvesztése ciklinfüggő kináz inhibitorok, mint például a p21 Waf1 /Cip1 és p27 Kip 1 elősegítik CDK2 aktivitás és szabályozza a G1 /S átmenetet [12, 24]. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a mutáns ZIC1 vagy vis overexpressziója ZIC1 expresszióját szabályozza p27 Kip 1 egerekben kisagyi szövetekben és liposzarkóma sejtek [3, 20]. Érdekes, hogy a Shh jelátviteli negatívan szabályozza a P21 Waf1 /Cip1 és ciklin D1 egy GLI1-függő módon [16, 25]. Azt azonban, hogy ZIC1 lehet kölcsönhatásait Csitt útvonal a sejtciklus szabályozásában disztribúciók nem került meghatározásra. Felderítése ez a jelátviteli hálózat további betekintést a szerepét ZIC1 gyomorrákban.
A mi jelen tanulmányban azt bizonyítják, hogy túltermelése ZIC1 elnyomja gyomorrák sejtek migrációját és invázióját, valamint megváltoztatja a sejt-ciklus eloszlások. ZIC1 lehet a transzkripció downregulate a Csitt jelző- és elnyomja a szint phospholated Akt és Erk, így vezet a szabályozás sejtciklus-szabályozó kinázok p21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 és ciklin D1 gyomorrákban sejtekben. Mi is azonosítottak több fontos ZIC1 downstream célpontok gyomorrák sejtek cDNS microarray.
Eredménye
ZIC1 gátolja a proliferációt, migrációt és invázió gyomorrák sejtek
hatásának meghatározására ZIC1 sejtproliferációra végeztünk a sejtek életképességét elemzés MTS vizsgálatokban a gyomorrák sejtek. A gyomor rákos sejtvonalak (AGS, MKN28, BGC823 és SGC7901) transzfektáltunk pCDNA3.1-ZIC1 vagy pCDNA3.1 üres vektor. A transzfekciós hatékonyság igazoltuk RT-PCR és Western blot volt (1A ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy az életképes sejtek számát szignifikánsan elnyomja ektópiás expressziója ZIC1 egy 5 napos megfigyelés BGC823 sejtekben (1B ábra). Elnyomása sejtproliferáció által ZIC1 összhangban volt a korábbi megfigyelések AGS és MKN28 gyomor rákos sejteket, valamint a vastagbél rákos sejteket [7, 8]. 1. ábra ZIC1 elnyomja sejtek proliferációját és migrációját a gyomorrák. (A) A gyomor rákos sejtvonalak (AGS, MKN28, BGC823 és SGC7901) stabilan transzfektáltunk pCDNA3.1-ZIC1 vagy pCDNA3.1 üres vektor. Az expressziós szintek ZIC1 mRNS és fehérje végeztük RT-PCR (felső diagram) és Western-blot (alacsony ábrát). GAPDH és β-aktin használtunk belső kontrollként. (B) a sejt életképességét gyomorrák sejtvonal (BGC823) úgy határoztuk meg, MTS sejt proliferációs vizsgálati eljárásban. A csillag azt jelzi, a statisztikai szignifikancia (** P < 0. 01). (C) A sejtmigrációt értékelte módosított Boyden Transwell kamrák assay inkubálás után 16 órán át. A sejteket, amelyek vándorolt ​​az alján a membrán megfestettük DAPI. (D) A számú látható vándorló sejtek (átlag ± S.D) számolásával állapítottuk öt random nagyteljesítményű mezők (× 400-szoros nagyítás). Ezeket a kísérleteket három párhuzamosban végeztük. A reprezentatív adatok jelennek meg. A csillag azt jelzi, a statisztikai szignifikancia (*** p < 0,001).
Ezen túlmenően meghatároztuk a szerepe ZIC1 a sejt migrációt és inváziót gyomorrák. Sejtvándorlásban és invázióban vizsgálatokat végeztünk Transwell migrációs és Matrigel-bevonatú inváziós vizsgálati rendszerek, ill. Megfigyeltük, hogy re-expresszálásához ZIC1 jelentősen elnyomja sejt migráció AGS, BGC823 és SGC7901 gyomor rákos sejtvonalat (p < 0,001) (1C, D). Ezen túlmenően, re-expresszálásához ZIC1 megjelenített egy lényegesen alacsonyabb aktivitása celluláris invázió képest az üres vektor transzfektánsok AGS sejtekben (p < 0,05) (Plusz fájl 1: ábra S1). Ezek az adatok azt sugallják, hogy a méhen kívüli expressziója ZIC1 elnyomja gyomorrák sejt migrációt és inváziót.
ZIC1 megváltoztatja sejtciklus-eloszlások és expresszióját szabályozza a ciklin-függő kinázok gyomor rákos sejtekben
további megérteni a mechanizmusok mögöttes gátlása sejtproliferáció túlexpressziója ZIC1 értékeltük sejtciklus eloszlások a gyomor rákos sejtekben. Megfigyeltük nagyobb arányban a sejtek G1 fázisban AGS (42,74%) és a SGC7901 (54,03%) sejtvonalak után overexpressziója ZIC1. Azonban a transzfektált sejtek a kontroll vektorral, az arány egyaránt csökkent AGS (32.66%) és SGC7901 (47,00%) és az aránya a sejtek az S fázist viszonylag növekedett (2A ábra). Általánosan elfogadott, hogy a P21 (vagy más néven p21 Waf1 /Cip1) és p27 (más néven p27 KIP1), két fő ciklinfüggő kináz inhibitorok, szükséges beszüntetése során a bejegyzést S-fázis [26]. Az aktiválás a cyclin D1, azonban elsősorban felelős szabályozó G1-S fázis átmenet [23]. Kimutattuk, hogy az expressziós szint a ciklin D1 fehérje csökkent, míg a p21 és p27 markánsan indukált gyomorrák transzfektált sejtekben pCDNA3.1-ZIC1 képest azok pCDNA3.1 üres vektor transzfektánsok (2b ábra). Azt is értékelték a sejt apoptózis eloszlások PCDNA3.1-ZIC1 vagy pCDNA3.1 vektor transzfektánsok AGS és MKN28 sejteket, de nem nyilvánvaló különbségek apoptózis észleltek (Plusz fájl 2: S2 kép). Ezért ezek az eredmények alátámasztják, hogy overexpressziója ZIC1 megváltoztatja a sejtciklus eloszlások keresztül szabályozás a ciklin-függő kinázok p21, p27 valamint cyclin D1 gyomor rákos sejtekben. 2. ábra ZIC1 megváltoztatja a sejtciklus felosztott szabályozása p21, p27 és ciklin D1 gyomorrákban sejtekben. (A) Sejtciklus eloszlások detektáltunk áramlási citometriával elemzés AGS és SGC7901 sejtek után tranziens transzfekciót pCDNA3.1-ZIC1 vagy pCDNA3.1 üres vektort 24 órán át. (B) Az expressziós szintet a p21, p27 és ciklin D1 határoztuk meg Western-blottal. β-aktin volt kimutatható, mint egy terhelési kontrollként. Denzitometriát értékek formájában fejezzük ki szoros változást képest pCDNA3.1 vektor kontroll értékeket normalizáltuk 1. (C) Az expressziós szintjei phospholated Akt és ERK1 /2, valamint a teljes Akt és ERK1 /2 vizsgáltuk Western-blottal.
MAPK és a PI 3K utak létfontosságú szerepet játszanak a szabályozásában sejtciklus-kinázok. Értékeltük a kifejezés fő downstream hatások a két utat, Erk1 /2 és az Akt, miután stabil bevitelére pCDNA3.1-ZIC1 AGS, MKN28, BGC823 és SGC7901 gyomorrák sejtek (1A). Azt találtuk, hogy a foszforiláció szintje az ERK1 /2 és az Akt drámaian elfojtott túlexpressziója ZIC1 valamennyi fent vizsgált sejtvonalban (2C ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a szabályozás a sejt-Ebben a ciklusban eloszlás által ZIC1 lehet közvetített PI 3K és MAPK útvonalak és azok downstream ciklin-dependens kinázok P21, p27 és ciklin D1 gyomorrákban.
ZIC1 elnyomja az expresszióját Sonic hedgehog (Shh) a gyomorrák-sejtek
molekuláris jellemzése azt mutatta, hogy ZIC1
van cink-ujj domének és lehetne ellensúlyozni a GLI1 kötődve GC-gazdag szekvenciákat [2]. GLI1 downstream célpontja a sündisznó (hh) jelátviteli, amely elengedhetetlen a gyomorrák kialakulásában és progressziójában [9, 27]. Feltételeztük, hogy a Hh jelátviteli útvonal is be lehet vonni a ZIC1 szabályozásában gyomorrák sejt-ciklus és a sejtek migrációját. Ennek a kérdésnek, kifejeződését vizsgáltuk a Sonic hedgehog (Shh), egyik legfontosabb tagja Hh család, a gyomorrák sejtek után túltermelése ZIC1. Azt találtuk, hogy re-expresszálásához ZIC1 hatékonyan csökkenti Shh expresszió BGC823 és SGC7901 sejtvonalak Western-blot-analízis (3A ábra). Ezen túlmenően, az RT-PCR elemzés azt mutatta, hogy a transzkriptum szintje Shh is jelentősen downregulált gyomorkarcinómában transzfektált sejtekben ZIC1 viszonyított üres vektor transzfektánsok (p < 0,01) (3B ábra). (Plusz fájl 3: ábra S3) . Összegezve, eredményeink arra utalnak, hogy ZIC1 lehet a transzkripció expresszióját szabályozzák Pszt a gyomor rákos sejteket. 3. ábra ZIC1 gátolja kifejezése Sonic hedgehog (Shh). (A) A kifejezés a Shh protein analizáltuk Western-blot-ban BGC823 és SGC7901 stabilan transzfektált sejteket pCDNA3.1-ZIC1 vagy pCDNA3.1 üres vektor. (B) Az expressziós szintjének Shh mRNS határoztuk meg valós idejű kvantitatív RT-PCR-analízis. A relatív expressziós szint fejeztük szeres változást (átlag ± SEM) képest pCDNA3.1 üres vektorral normalizáltuk 1.
sündisznó (hh) jelátviteli útvonal részt vesz a ZIC1 szabályozás a sejt-ciklus és a sejtmigráció gyomorrákban sejtek katalógusa Annak meghatározására, hogy a Pszt a sejtciklus-eloszlás törekedtünk arra, hogy vizsgálja meg a hatását farmakológiai inhibitor Hh jelátvitel a kifejezés a p21 és ciklin D1. AGS, BGC823 és SGC7901 gyomor rákos sejtvonalakban kezeltük ciklopaminnal (10 uM), egy szteroid alkaloid, amely közvetlen kölcsönhatásban SMO, hogy gátolják a Hh jelátviteli [28], vagy DMSO-kontroll 24 órán át. Megfigyeltük, hogy az expressziós szint a p21 volt jelentősen up-szabályozott, míg a ciklin D1 alulszabályozott után a tumor sejteket kezeltünk ciklopaminnal (4a ábra). Említésre, blokkolja a Shh jelátviteli beadásával ciklopamin nem befolyásolja az expressziós szintek ZIC1 mRNS BGC823 és SGC7901 sejtek RT-PCR vizsgálati eljárások (4b ábra). A jelen, vagy alacsony expressziója ZIC1 mRNS gyomor rákos sejtek elsősorban meditáltál által promoter DNS-metiláció, ahogy a korábban ismertetett [8]. 4. ábra Hh jelátviteli útvonal részt vesz a kifejezés a p21, a ciklin D1 és szabályozása sejtek migrációját. AGS, BGC823 és SGC7901 gyomorrák sejteket kezeltünk ciklopaminnal (10 uM), egy szteroid alkaloid, amely közvetlen kölcsönhatásban SMO, hogy gátolják a Hh jelátviteli, vagy DMSO-kontroll 24 órán át. (A) Az expressziós szinteket a p21 és ciklin D1 határoztuk meg Western-blot-AGS, BGC823 és SGC7901 sejteket. (B) Az expressziós szintjének ZIC1 mRNS vizsgáltuk keresztül hagyományos RT-PCR-rel. (C) A sejtmigrációt értékelte módosított Boyden transzwell kamrák vizsgálatokban. A sejteket, amelyek vándorolt ​​az alján a membrán megfestettük DAPI. (D) Az átlagos száma látható vándorló sejtek (átlag ± S.D) számítottuk öt random nagyteljesítményű mezők (× 400). A csillag azt jelzi, a statisztikai szignifikancia (*** p < 0,001).
Is értékeltük hatását Shh jelzést gyomorrák sejtek migrációját. Amint a 4. ábrán látható C és D, AGS, BGC823 és SGC7901 gyomorrák sejtvonalakon mutatott szignifikáns csökkenést a celluláris migrációt a beadás után, a ciklopaminnal (10 uM) 24 órán át (p < 0,01). Együttesen ezek az eredmények azt mutatják, hogy ZICI modulálhatja a sejtciklus-szabályozók és sejtmigrációt keresztül Shh jelátviteli gyomor rákos sejtekben.
Génexpressziós profiljának változik ektópiás expressziója ZIC1 katalógusa, hogy szisztematikusan meghatározásához downstream célpontjai ZIC1, végeztünk egy affymatrix oligonukleotid microarray in MKN28 gyomor rákos sejtek vagy anélkül pCDNA3.1-ZIC1. Egy cut-off > 1,5-szeres a statisztikai szignifikancia egy microarray kiderült, hogy 132 gének alulszabályozott míg 66 gének up-regulációját exogén expressziója ZIC1 (reprezentatív gének ábrán látható 5A). Sok gén leírták, hogy kritikus szerepet játszanak a sejtproliferációban, a sejtciklus és a sejtmigráció szerinti gén funkcionális elemzés (http: //www. Genecards. Org) (5B, ábra). Például két kulcsfontosságú sejtciklus-szabályozó TP53INPI katalógusa és CDKN2B katalógusa állapítanak meg szabályozatlan a MKN28 sejtek transzfektált a pCDNA3.1-ZIC1. Eredményeink azt mutatják, hogy ZIC1 potenciálisan szabályozza több downstream gének gyomor tumorogenezisben. 5. ábra génexpressziós profil változás után méhen kívüli kifejezése ZIC1. (A) A génexpressziós profilokat a pcDNA3.1-ZIC1 vagy üres pCDNA3.1 vektor stabil transzfektánsokat analizáltuk cDNS microarray a MKN28 sejtekben. Reprezentatív gének szemlélteti a jobb oldalon, a hőtérkép képet egy cut-off > 1,5 vagy < -1,5 Hajtásra szignifikáns különbség ,. (B) részt vevő gének a sejtciklus, a sejtproliferáció és sejtmigráció szerinti gén funkcionális elemzés (http: //www. Genecards. Org) mutatjuk be. Relatív szeres változást fejezik aránya pCDNA3.1-ZIC1 versus pCDNA3.1 ellenőrzés. (C) A szisztémás megértése útvonalakat ZIC1 szabályozása jelző- és célgének kialakulásának és progressziójának a gyomorrák. Katalógusa Vita katalógusa Egyre több bizonyíték azt mutatja, hogy ZIC1 részt vesz a progresszió számos daganat [3-8] . Úgy tűnik, hogy ZIC1 van abnormálisan expresszált bizonyos típusú rák és differenciálisán működik, mint egy tumorszuppresszor vagy onkogén gént. Például ZIC1 kifejezés jelentették, hogy alacsony vagy hiányzik a gasztrointesztinális és a tüdőrák sejtvonalak, és azt találtuk, hogy elnyomja gasztrointesztinális rák sejtek proliferációját [7, 8, 29]. Ezzel szemben a túlzott expressziója ZIC1 a liposzarkóma találták, hogy támogassák sejtproliferáció és invázió [3]. Mi és mások kimutatták, hogy a epigenetikai modulációk beleértve a DNS-metiláció és hiszton remodelling, és genetikai mutációk hozzájárulhat a differenciális expressziós mintázatok közé rákok [3, 4, 7, 8]. Egyre világosabbá válik, hogy a cink-ujj transzkripciós faktor, ZIC1 modulálhatja több downstream gének idegszövet, kolorektális rák és liposzarkóma sejtek [2, 3, 7, 9]. Azonban keveset tudunk a mechanizmus alapjául ZIC1 funkció a fejlesztés és progressziójában gyomorrák. Hangsúlyozva a legfontosabb utakat és a későbbi célok szabályozzák ZIC1 megkönnyítheti megértése annak szerepét a tumorok. Itt azt igazolták, hogy overexpressziója ZIC1 eredményez szignifikáns gátlását a sejtek túlélését és károsodott sejtek migrációját. ZIC1 elnyomja a Csitt, PI3K és a MAPK jelátviteli utak, amelyek kritikusak a szabályozás sejtciklus-eloszlás és a sejt migráció gyomorrákban. Sőt, ZIC1 gátolja a sejtciklust szabályozó kinázok, p21, p27 és ciklin D1, és így a G1 /S sejtciklus tranzit gyomor rákos sejtekben. ZIC1 elnyomja az Shh jelátviteli útvonalat, amely kritikus a szabályozás a sejt-ciklus eloszlások és a sejtmigrációt gyomorrákban.
MAPK és a PI 3K utak kritikus szerepet játszanak a sejt-proliferáció, a differenciálódás, és progressziója a különböző humán rákok [30]. Újabban arról is beszámoltak, hogy az aktiválás mindkét útban elengedhetetlen indukálására sejtciklus belépési [30, 31]. E folyamat során, a ciklin-függő kináz inhibitorok p21, p27 és ciklin D /E részt vesznek a szabályozás a p53 indukálta sejtciklus letartóztatása [24, 32]. A MAPK és downstream kináz-Erk nem csak akkor vezet az indukciós a ciklin D1 és áthaladjon G1 /S ellenőrző pont, hanem a felhalmozódása a p21, amely gátolja a ciklin E /CDK2 komplexeket, hogy blokkolja az S-fázisú belépési [30] . PI 3K /Akt útvonal lehetett inaktiválják a GSK3-β és FOXO transzkripciós faktorok, így gátolja a ciklin D1 míg indukál a p27 és p21 szabályozásában sejtciklus belépési [31]. Kimutattuk, hogy a re-expresszálásához ZIC1 hatékonyan inaktiválják a foszforilált Akt és ERK1 /2 AGS, MKN28, BGC823 és SGC7901 gyomorrák sejtvonalakon. Ebben a tekintetben, a CDK1 inhibitor p21 aktiválásra került, míg a ciklin D1 inaktivált, miután túlexpressziója ZIC1 a gyomor rákos sejtekben. Bár az eredményeket el kell érvényesíteni a jövőbeli vizsgálatokban, a miroarray adatok azt mutatták, hogy más kulcsfontosságú összetevője sejtciklus kináz szabályozó beleértve TP53INPI katalógusa és CDKN2B katalógusa, szabályozatlan erőltetett expressziója ZIC1 az egyedi MKN28 gyomorrák sejt vonal (5. ábra A és B). Ezért azt javasoljuk, hogy ZIC1 szabályozza G1 /S tranzit elsősorban PI 3K és MAPK útvonalak és a downstream a sejtciklus szabályozó kinázok gyomorrák sejtek.
Másik fő elváltozás a jelen tanulmány, amely a transzkripció ZIC1 szabályozza Sonic hedgehog (Csitt) jelző a gyomorrák sejtek. Eltekintve attól, hogy központi szerepet szabályozására gyomor mirigy morfogenezis humán gyomorban, Shh jelátviteli is részt vesz a patogenezisében gyomorrák [16, 33]. Shh gyakran aktiválódik előrehaladott gyomorrák adenocarcinoma és társított agresszívebb viselkedésű tumort [13, 15, 33]. Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy az Shh jelátviteli elősegíti a motilitás és invazivitását gyomorrák-sejtek révén TGF-β-ALK5-Smad3 útvonal [34]. Shh jelátviteli is expresszióját szabályozzák p21 és ciklin D1 egy Gli-függő útvonal [16, 25]. Megfigyeltük, hogy gátolja a Shh jelátviteli beadásával a ciklopaminnal elnyomja AGS, BGC823 és SGC7901 gyomorrák sejtmigrációt, és szabályozza a kifejezés a p21 és ciklin D1 (4. ábra). Ezek az eredmények összhangban vannak a korábban közölt tanulmányok [25, 34]. Így már kiderült, hogy ZIC1 fontos szerepet játszik a gyomorrák előrehaladásának szabályozása Csitt jelátviteli.
ZIC1 szabályozhatják target gének mindkét szekvencia-specifikus és független módon, [9]. ZIC1 lehetne szabályozni a transzkripciós kifejezése cél, beleértve a ciklin D1, p27, Wnt1 és Wnt7a, és modulálják Notch és BMP utak idegi fejlődés [2, 9]. ZIC1 ellensúlyozhatja GLI kötődve GC-gazdag szekvenciákat, és elnyomják az expresszióját GLI-kötő szekvencia irányított riporter-gének [9, 35]. Mi szerint számos ZIC potenciális célgének gyomorrák sejtek microarray. Ezen célkitűzések szorosan kapcsolódik a sejtciklus, sejt proliferációját és migrációját (5B). Az egyesület között ZIC és a downstream célpontok lehetnek egy nyom megértéséhez potenciális szempontjából ZIC fehérjék a progresszió gyomorrák.
Következtetések
Összegezve, javasoljuk egy modellt, amely képviseli az utakat, amelyeken keresztül ZIC1 hozzájárul gyomorrák progresszió (5C). Túlexpressziója ZIC1 eredmények visszaszorításában Hedgehog (Hh) jelzését és downstream célok, beleértve a p21, p27 és ciklin D1. Mint egy cink-ujj transzkripciós faktor, ZIC1 is potenciálisan modulálja a transzkripciós célgének expresszióját által közvetlenül kötődni GC-ben gazdag szekvenciák [2], így működik, mint egy tumorszuppresszor gátlásával sejtburjánzást, sejt migrációt és inváziót gyomorrák.
Methods
sejtek tenyésztése és kezelése
Az emberi gyomor rákos sejtvonalak (AGS, MKN28, BGC823 és SGC7901) szereztünk be a Riken Génbank (Japán) és az American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, amerikai Egyesült Államok ). Az összes sejtvonalat RPMI 1640 tápközegben (Invitrogen, CA, USA), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS) és inkubáljuk 5% CO 2, 37 ° C-on és 95% -os páratartalom mellett. A gyomor rákos sejtvonalak (AGS, BGC823, és SGC7901) kezeltünk 10 jiM ciklopamin (Sigma, St. Louis, MO, USA) DMSO-ban 24 órán át. Egy ekvivalens koncentráció a jármű (DMSO) alkalmazunk kontrollként.
Cell transzfekció
AGS, MKN28, BGC823 és SGC7901 sejteket tenyésztettünk 24 órán egy 6 mérőhelyes lemezre, és transzfektált pCDNA 3.1-ZIC1 vagy pCDNA 3.1 üres vektor Fugene HD (Roche) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. 48 óra eltelte után a transzfektánsokat folyamatosan kiválasztott RPMI 1640 közegben, amely G418-at (200-400 ng /ml) (Merck, Németország), 14 napig.
RT-PCR és kvantitatív valós idejű PCR-analízis
Az összes RNS-t ( 1 ug) extraháltuk Trizol reagens (Invitrogen) a gyártó utasításait követve, és reverz transzkripcióval cDNS-be az M-MLV RTáz cDNA Synthesis Kit (Takara, Japán). A transzkriptum szintje ZIC1 és Shh határoztuk meg hagyományos RT-PCR TaKaRa Taq polimeráz (Takara, Japán), vagy kvantitatív valós idejű PCR (QRT-PCR) a SYBR Green Master Mix Kit (Takara, Japán), egy ABI 7500 PCR System. Használt primereket ZIC1 voltak F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC és R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Pszt voltak F 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG és R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Glicerin-aldehid-3-; phosohate-dehidrogenáz (GAPDH) alkalmaztunk belső kontrollként. A transzkriptum szintje fejezzük 2 -ΔΔCt értékek és relatív expressziós szeres változást normalizáltuk GAPDH.
Életképesség teszt
sejtek életképességét detektáltuk egy nem radioaktív sejt-proliferációs vizsgálati 3- (4,5- dimetil-tiazol-2-il) -5- (3-karboxi-metoxi) -2- (4-szulfo-fenil) -2H-tetrazólium (MTS) reagensek (Promega, Madison, USA). Stabilan transzfektált sejteket 96 lyukú (2000 sejt /lyuk), 6 óra, 24 óra, 72 óra és 120 óra. Az abszorbanciát mérjük 490 nm-en, miután 1 óra inkubálás CellTiter 96 Aqueous One Solution reagens.
Sejtciklus és apoptózis elemzése
Sejtciklus eloszlást által érzékelt áramlási citometriás elemzést. A sejteket transzfektáltuk a pCDNA3.1-ZIC1 vagy pCDNA3.1 üres vektort összegyűjtöttük és PBS-sel mostuk. Celluláris DNS-oldattal megfestettük a sejtciklus festőoldattal tartalmazó propidium-jodid (Pl), 4 ° C-on sötétben. Sejtciklus alkalmazásával határoztuk meg FACS Calibur és elemzik a ModFitLT szoftver (Phoenix, USA).
Sejt apoptózis végeztünk FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit II (BD Pharmingen) áramlási citometriával elemzést. Tranziensen transzfektált sejteket Annexin V kötőpufferben. Ezután FITC Annexin V és a PI oldatokat adunk hozzá egymás után. Az inkubálás után 15 percig, a megfestett sejteket analizáltuk áramlási FACScan áramlási citométerrel (Becton Dickinson, USA).
-Migráció és inváziós vizsgálati eljárást
sejtmigrációt értékelte módosított Boyden Transwell kamrák assay (kötélvágó, USA). Röviden, a sejteket tenyésztettük szérummentes tápközegben, 24 H és 5 × 10 4 sejteket a felső kamrába 300 ul tápközegben, amely 5% FBS-t. Miután 16 óra inkubálás nem vándorló sejtek a felső kamrában óvatosan eltávolítjuk egy vattacsomót. A migrált sejteket megfestettük A DAPI-festés Solution. A sejtek számát véletlenszerűen megszámoltuk öt területen (× 400-szoros nagyítás).
Sejtek invázióját végeztük Millipore 24 lyukú bevont BD Matrigel. Miután éhezés szérummentes tápközegben, 24 órán át, 1 × 10 5 sejteket a felső kamrába 300 ul tápközegben, amely 5% FBS-t, míg az alsó kamra tele volt 600 pl táptalajt 15% FBS. Miután inkubáltuk 30 órán át, a membránokat Cell Stain Solution (Millorpore, USA). A színezék elegyet mostuk Extraction Buffer és átvisszük egy 96-lyukú kolorimetrikus mérés 560 nm-en.
Western-blot-analízis
extraháltuk az összfehérjét a sejtekből segítségével radio-immunprecipitáció assay lízispufferben kiegészített proteáz inhibitor. A lizátumokat megoldani 6-12% SDS-PAGE minigels és átvittük PVDF-membránokra (Millipore, Bedford, MA). A membránokat blokkoltuk 5% tejjel TBST-vel, és inkubáljuk 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át következő antitestek: ZIC1 (1: 500; ABCAM), foszfo-Akt (1: 1000; Cell Signaling), Akt (1: 500; ABCAM), foszfo-ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), P21 Waf1 /Cip1 (1: 1000; Cell Signaling), a p27 Kip1 (1: 500; Epitomics), a ciklin D1 (1: 1000; Cell Signaling) és az Shh (1: 1000; Cell Signaling). Ennek megfelelően, a másodlagos antitest torma peroxidise (HRP) tettük láthatóvá kemilumineszcenciás Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japán). A relatív sűrűsége fehérjéket mennyiségileg fényképek J. szoftver és a normalizált p-aktin (1: 2500, Multisciences Biotech).
CDNS microarray
Az összes RNS-t izoláltunk MKN28 sejtek stabilan transzfektált pCDNA3.1 -ZIC1 vagy pCDNA3.1 üres vektort volt, és reverz transzkripcióval cDNS-sé. Feliratú mintákat hibridizáltuk Agilent teljes emberi genom, amely több mint 41000 szondák (http: //www. NCBI. NLM. NIH. Gov /geo /lekérdezés /acc. Cgi? Acc = GSE38924). A microarray adatok segítségével elemeztük Agilent Feature Extraction szoftverrel. Azért választottuk a szeres változást ≥1.5 vagy ≤ -1,5 mint egy jelentős különbség. Katalógusa Statisztikai analízis katalógusa Student-féle t katalógusa tesztet végeztünk, hogy összehasonlítsuk a két független adatok, míg a Chi-négyzet vagy Fisher egzakt tesztet alkalmaztuk elemezni kategorikus változók. A cut-off p < 0,05 alkalmazták statisztikai jelentősége. Katalógusa Notes katalógusa Jing Zhong, Shujie Chen hozzájárult egyaránt ezt a munkát. Katalógusa nyilatkozatok katalógusa visszaigazolása
projektet támogatta Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (30900676, 81071961), Nemzeti Alap Research Program of China (973 program) (2012CB945004) és Science and Technology Key projekt Zhejiang tartomány Kínában (2009 C03012-3). A szerzők köszönetet mondanak Dr. Tianhua Zhou és Prof. Lei Guo számára hasznos javaslatokat és vita; és Thomas R. Austin kritikus felülvizsgálata és módosítása a kézirat.
  • gyomor cikk
    •   
  • A gyomor szerkezet
    •   
  • Gondoskodás a gyomor
    •   
  • kutatások

    • kutatások

    kutatások

    Other Languages

    gyomor egészség © https://www.stomachillness.com/hu