ZIC1 modulerer celle-cyklus fordelinger og cellevandring gennem regulering af sonisk pindsvin, PI
3K og MAPK signalveje i gastrisk kræft
Abstract
Baggrund
ZIC1, en vital transkriptionsfaktor med zinkfinger-domæner, er blevet impliceret i processen med neural udvikling. Vi har tidligere vist, at ZIC1 kan fungere som en tumorsuppressor i gastrointestinale cancere. Men den molekylære mekanisme underliggende ZIC1 deltagelse i tumor progression fortsat ukendt.
Metoder
rolle ZIC1 på celledeling og migration blev undersøgt. Reguleringen af sonisk pindsvin (Shh), phosphoinositid 3-kinase (PI 3K) og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signalveje efter ektopisk ekspression af ZIC1 i gastriske cancerceller blev evalueret.
Resultater
overekspression af ZIC1 bidrager til inhibering af celleproliferation migration og cellecyklus-fordelingen i gastrisk cancer. Gradueringen af G1 /S checkpoint ved ZIC1 hovedsageligt medieret gennem regulering af cyclinafhængige kinaser (p21 WAF1 /Cip1, p27 Kip1 og cyklin D1). Desuden kan ZIC1 inaktivere niveauet af phospholated Akt og Erk1 /2, og transkriptionelt regulere sonic hedgehog (Shh) signalering, hvilket således fører til at regulere ekspressionen af p21 WAF1 /Cip1 og cyclin D1. Endelig har vi systemisk identificeret ZIC1 downstream mål efter cDNA microarray analyse og viste, at 132 gener nedreguleres og 66 gener er opreguleret efter transfektion med ZIC1 i gastriske cancerceller.
Disse kandidatgener spiller kritiske roller i celleproliferation, cellecyklus og celle motilitet. Konklusioner
Overekspression af ZIC1 resultater i inaktivering af Shh, PI 3 K og MAPK signalveje, samt regulering af flere efterfølgende mål som er afgørende for udviklingen og progressionen af mavekræft. ZIC1 fungerer som et potentielt terapeutisk mål for mavekræft.
Nøgleord
ZIC1 Sonic pindsvin Celle cyklus Tumor suppressor Baggrund
ZIC1, en af fem Zic familiens gener, der er involveret i en række udviklingsprocesser, herunder neurogenese og myogenese [1, 2]. For nylig ZIC1 er blevet dokumenteret til at deltage i progressionen af humane tumorer, herunder medulloblastom, livmoderkræft, mesenchymale neoplasmer og liposarkom cancere [3-6]. Vi har tidligere vist, at ZIC1 genet betydeligt nedreguleret i gastrisk cancer væv og cellelinier sammenlignet med den af normale gastriske væv. Desuden ZIC1 potentielt tjener som en tumorsuppressor ved at hæmme celleproliferation i gastriske og colorektale cancerceller [7, 8]. Som en vigtig transskription faktor, ZIC1 er afgørende for reguleringen af Hedgehog signalering (Hh), Bone protein (BMP), og Notch signalveje i neural udvikling [2, 9]. Men lidt om hvordan ZIC1 regulerer signalveje og deres tilknyttede nedstrøms mål i kræft progression.
Mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [10, 11]. Hh signalering er en af de vigtigste onkogene signalveje, der er involveret i gastrisk carcinogenese [12, 13]. Sonic hedgehog (Shh), et medlem af pattedyr-Hh familien [14], har vist sig at være både opreguleret i gastrisk cancer væv ved in situ hybridiseringsassay og afgørende for udviklingen af gastrisk cancer [13, 15]. Hh signalvej aktiveres af Shh binding med Patched (ptch) - Smoothened (Smo) membran-receptorkomplekset [16]. Aktiveringen af Shh fremmer gastrisk cancer celledifferentiering og proliferation. Det er blevet rapporteret, at ZIC1 kunne reducere udtryk for PTCH1
og Shh
gener i neurale væv under forhjernen udvikling [17]. I modsætning hertil har beviser vist, at Shh undertrykker udtryk for ZIC1 under neuralrøret udvikling [18]. Ikke desto mindre indflydelse ZIC1 på Hh signalvejen i mavekræft er fortsat ukendt.
ZIC1 regulerer også talrige mål, herunder cyclin D1, p27, Wnt1 og Wnt7a under neural udvikling i Xenopus ektodermale eksplantater og mutant musemodeller [9, 19, 20]. Vi er især interesserede i celle-cyklus regulatorer vigtige for kræft celledeling og differentiering. Vi har tidligere vist, at overekspression af ZIC1 kan ændre G1 /S overgangen i gastriske cancerceller [8]. Adskillige mekanismer cyclinafhængige kinaser (CDK'er) er involveret i reguleringen af G1 /S checkpoint i humane kræftformer [21]. Under overgangen fra G1 til S-fasen, cyclin D, som danner aktive komplekser med CDK4 opreguleres i gastrisk cancer [22, 23]. Tab af cyclinafhængige kinase inhibitorer, såsom p21 WAF1 /Cip1 og p27 Kip en fremme CDK2-aktivitet og regulere G1 /S overgang [12, 24]. Nylige undersøgelser har vist, at mutant ZIC1 eller force overekspression af ZIC1 regulerer ekspressionen af p27 Kip 1 hos mus cerebellare væv og liposarkom celler [3, 20]. Interessant nok Shh signalvejen negativt regulerer p21 WAF1 /Cip1 og cyclin D1 i en GLI1-afhængig måde [16, 25]. Men hvorvidt ZIC1 kan samspil med Shh pathway i reguleringen af cellecyklus distributioner er ikke blevet defineret,. Belysning af denne signalering netværk kan give yderligere indsigt i rollen som ZIC1 i mavekræft.
I vores nuværende studie, vi viser, at overekspression af ZIC1 undertrykker mavekræft celle migration og invasion, samt ændrer celle-cyklus distributioner. ZIC1 kan transkriptionelt nedregulere Shh signalering og undertrykke niveauet af phospholated Akt og Erk, hvilket fører til regulering af celle-cyklus regulator kinaser p21 WAF1 /Cip1, p27 Kip1 og cyklin D1 i gastriske kræftceller. Vi identificerede også flere vigtige ZIC1 downstream mål i gastriske kræftceller ved cDNA microarray analyse.
Resultater
ZIC1 hæmmer proliferation, migration og invasion af gastriske kræftceller
at bestemme virkningen af ZIC1 på celleproliferation, udførte vi cellelevedygtighed analyse ved MTS-assays i gastriske cancerceller. Mavekræft cellelinjer (AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901) blev transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 tom vektor. Transfektionseffektiviteten blev bekræftet ved RT-PCR og Western blot (figur 1A). Resultaterne viste, at antallet af levedygtige celler blev signifikant undertrykt ved ektopisk ekspression af ZIC1 i en 5-dages observation i BGC823 celler (Figur 1B). Undertrykkelsen af celleproliferation med ZIC1 var i overensstemmelse med vores tidligere observationer i AGS og MKN28 gastrisk cancerceller, samt coloncancerceller [7, 8]. Figur 1 ZIC1 undertrykker celleproliferation og migration i mavekræft. (A) mavekræft cellelinjer (AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901) blev stabilt transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 tom vektor. Ekspressionsniveauerne af ZIC1 mRNA og protein blev udført ved RT-PCR (øvre diagram) og Western blot (lav diagram). GAPDH og β-actin blev anvendt som interne kontroller. (B) Cellelevedygtigheden af gastrisk cancercellelinie (BGC823) blev bestemt ved MTS celleproliferationsassay. Stjernen angiver statistisk signifikans (** p < 0 01). (C) Cell migration blev bestemt ved modificeret Boyden Transwell kamre assays efter inkubation i 16 timer. Celler, som migrerede til bunden af membranen blev farvet med DAPI. (D) Antallet af synlige migrerende celler (gennemsnit ± standardafvigelse) blev estimeret ved at tælle fem tilfældige høj effekt felter (× 400 forstørrelse). Disse forsøg blev udført tre gange. vises De repræsentative data. Stjernen angiver statistisk signifikans (*** p < 0,001).
Desuden bestemmes vi rolle ZIC1 i celle migration og invasion i mavekræft. Cellemigration og invasion-assays blev udført i Transwell migration og Matrigelcoatede invasion assaysystemer hhv. Vi observerede, at re-ekspressionen af ZIC1 betydeligt undertrykt celle migration i AGS, BGC823 og SGC7901 mavekræft cellelinjer (p < 0,001) (Figur 1C, D). Desuden re-ekspressionen af ZIC1 viste en signifikant lavere aktivitet af cellulære invasion i forhold til de tomme vektor transfektanter i AGS celler (p < 0,05) (Ekstra fil 1: Figur S1). Disse data tyder på, at ektopisk udtryk for ZIC1 undertrykker mavekræft celle migration og invasion.
ZIC1 ændrer celle-cyklus distributioner og regulerer ekspressionen af cyclin-afhængige kinaser i gastrisk kræftceller
For yderligere at forstå mekanismerne bag hæmning af celledeling ved overekspression af ZIC1, vi evalueret celle-cyklus fordelinger i mavens kræftceller. Vi observerede en højere andel af celler i G1-fasen i AGS (42.74%) og SGC7901 (54.03%) cellelinier efter overekspression af ZIC1. Men i cellerne transficeret med en kontrolvektor blev andelen faldet både i AGS (32.66%) og SGC7901 (47.00%) og andelen af celler i S-fase blev relativt forøget (figur 2A). Det er godt accepteret, at p21 (også kendt som p21 WAF1 /Cip1) og p27 (også kendt som p27 KIP1), to vigtigste cyclinafhængige kinase hæmmere, er nødvendige for ophør under posten til S-fasen [26]. Aktiveringen af cyclin D1, dog primært er ansvarlig for regulering af G1-S faseovergangen [23]. Vi viste, at ekspressionsniveauet af cyclin D1-protein blev reduceret, mens p21 og p27 markant blev induceret i gastrisk cancer celler transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 sammenlignet med disse pCDNA3.1 tom vektor transfektanter (figur 2B). Vi evaluerede også celleapoptosen udlodninger i pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 vektor transfektanter i AGS og MKN28 celler, men ingen tydelige forskelle i celle apoptose blev observeret (Yderligere fil 2: Figur S2). Derfor understøtter disse resultater at overekspression af ZIC1 ændrer cellecyklus distributioner gennem regulering af cyclin-afhængige kinaser p21, p27 samt cyclin D1 i gastriske cancerceller. Figur 2 ZIC1 ændrer celle-cyklus udlodninger regulering af p21, p27 og cyklin D1 i gastriske kræftceller. (A) cellecyklus fordelinger blev detekteret ved flowcytometrianalyse i AGS og SGC7901 celler efter transient transfektion med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 tom vektor i 24 timer. (B) Ekspressionsniveauerne for p21, p27 og cyclin D1 blev bestemt ved Western blot. β-actin blev detekteret som en loading kontrol. Densitometri værdier er udtrykt som fold ændring i forhold til pCDNA3.1 vektor kontrolværdier normaliseret til 1. (C) De ekspressionsniveauerne af phospholated Akt og Erk1 /2, samt total Akt og Erk1 /2 blev undersøgt ved Western blot.
MAPK og PI 3K veje spiller afgørende roller i reguleringen af celle-cyklus kinaser. Vi evaluerede udtryk for vigtigste nedstrømseffektorer af disse to veje, Erk1 /2 og Akt, efter stabilt indføre pCDNA3.1-ZIC1 til AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901 gastriske kræftceller (figur 1A). Vi fandt, at phosphoryleringsniveauerne af ERK1 /2-og Akt dramatisk blev undertrykt ved overekspression af ZIC1 i alle testede ovenfor cellelinier (figur 2C). Disse resultater antydede, at reguleringen af celle-cylce fordeling af ZIC1 kan medieres via PI 3 K og MAPK veje og deres nedstrøms cyclinafhængige kinaser p21, p27 og cyklin D1 i mavekræft.
ZIC1 undertrykker udtryk for Sonic hedgehog (Shh) i gastriske cancerceller
Molekylær karakterisering har vist, at ZIC1
har zink-finger-domæner og kunne modvirke med GLI1 ved binding til GC-rige sekvenser [2]. GLI1 er en downstream mål for pindsvin (hh) signalvejen, som er afgørende for gastrisk udvikling kræft og progression [9, 27]. Vi antager, at Hh signalvejen kan være involveret i ZIC1 regulering af mavekræft celle-cyklus og celle migration. For at løse dette problem, vi undersøgte udtryk for Sonic pindsvin (Shh), et centralt medlem af Hh familien, i gastrisk kræftceller efter overekspression af ZIC1. Vi fandt, at re-ekspression af ZIC1 effektivt reducerer Shh-ekspression i BGC823 og SGC7901 cellelinjer ved western blot-analyse (figur 3A). Derudover RT-PCR-analyse viste, at transkriptet niveau af Shh også er betydeligt nedreguleret i gastrisk cancer celler transficeret med ZIC1 forhold til tom vektor transfektanter (p < 0,01) (figur 3B) (Supplerende fil 3: Figur S3). . Tilsammen tyder vore resultater, at ZIC1 transskriptionelt kan regulere ekspressionen af Shh i gastriske cancerceller. Figur 3 ZIC1 inhiberer ekspressionen af Sonic hedgehog (Shh). (A) Ekspressionen af Shh protein blev analyseret ved Western-blot i BGC823 og SGC7901 celler stabilt transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 tom vektor. (B) Ekspressionsniveauet af Shh-mRNA blev bestemt ved real-time kvantitativ RT-PCR-analyse. Den relative ekspressionsniveau blev udtrykt som gange ændring (middel ± SEM) sammenlignet med pCDNA3.1 tom vektor normaliseret til 1.
Hedgehog (Hh) signalvejen er involveret i ZIC1 regulering af celle-cyklus og cellevandring i gastrisk cancer celler
at bestemme virkningen af Shh på celle-cyklus distributioner, vi søgte at undersøge virkningerne af farmakologiske inhibitor af Hh-signalering på ekspressionen af p21 og cyklin D1. AGS, BGC823 og SGC7901 gastriske cancercellelinier blev behandlet med cyclopamin (10 uM), et steroidt alkaloid, der interagerer direkte med Smo at inhibere Hh-signalering [28], eller DMSO-kontrol i 24 timer. Vi observerede, at ekspressionsniveauet af p21 var markant opreguleret, mens cyclin D1 nedreguleres efter tumorceller blev behandlet med cyclopamin (figur 4A). Af note, blokerer Shh signalvejen ved indgivelse af cyclopamin ikke påvirker ekspressionsniveauerne af ZIC1 mRNA i BGC823 og SGC7901 celler ved RT-PCR-assays (figur 4B). Den fraværende eller lav ekspression af ZIC1 mRNA i gastriske cancerceller blev hovedsagelig mediteret ved promotor-DNA-methylering, som vi beskrev tidligere [8]. Figur 4 Hh signalvejen er involveret i ekspressionen af p21, cyclin D1 og regulering af cellemigrering. AGS, BGC823 og SGC7901 mavekræft celler blev behandlet med cyclopamin (10 uM), et steroidt alkaloid, der interagerer direkte med Smo at inhibere Hh-signalering, eller DMSO-kontrol i 24 timer. (A) Ekspressionsniveauerne for p21 og cyclin D1 blev bestemt ved western blot i AGS, BGC823 og SGC7901 celler. (B) Ekspressionsniveauet af ZIC1 mRNA blev undersøgt gennem konventionel RT-PCR. (C) Cell migration blev bestemt ved modificeret Boyden Transwell kamre assays. Celler, som migrerede til bunden af membranen blev farvet med DAPI. (D) Det gennemsnitlige antal synlige migrerende celler (gennemsnit ± standardafvigelse) blev beregnet i fem tilfældige højeffekt felter (× 400). Stjernen angiver statistisk signifikans (*** p < 0,001).
Vi evaluerede også virkningerne af Shh signalering på mavekræft cellemigrering. Som vist i figur 4 C og D, AGS, BGC823 og SGC7901 gastrisk cancer cellelinjer udviste signifikant fald i den cellulære migration efter administration med cyclopamin (10 uM) i 24 timer (p < 0,01). Kollektivt, disse resultater viser, at ZICI kan modulere celle-cyklus regulatorer og cellevandring gennem Shh signalering i gastriske kræftceller.
Genekspressionsprofil ændringer ved ektopisk udtryk for ZIC1
Til systematisk bestemme nedstrøms mål for ZIC1, vi gennemførte en affymatrix oligonukleotid microarray i MKN28 gastriske kræftceller med eller uden pCDNA3.1-ZIC1. Ved hjælp af en cut-off af > 1,5 gange for statistisk signifikans, afslørede en microarray at 132 gener nedreguleret mens 66 gener er opreguleret ved eksogen udtryk for ZIC1 (repræsentative gener vist i figur 5A). Mange gener er blevet rapporteret at spille kritiske roller i celleproliferation, cellecyklus og cellemigration ifølge gen funktionel analyse (http:.. //Www genecards org) (figur 5B). For eksempel, at to centrale celle-cyklus regulatorer TP53INPI
og CDKN2B
findes dereguleres i MKN28 celler transfekteret med pCDNA3.1-ZIC1. Vores resultater viser, at ZIC1 potentielt regulerer multiple downstream gener involveret i gastrisk tumorigenese. Figur 5 genekspressionsprofil ændringer efter ektopisk ekspression af ZIC1. (A) genekspressionsprofilerne i pCDNA3.1-ZIC1 eller tomme pCDNA3.1 vektor stabile transfektanter blev analyseret ved cDNA microarray i MKN28 celler. Repræsentative gener er illustreret på højre side af Heatmap billedet ved hjælp af en cut-off > 1,5 eller < -1,5 Fold som en væsentlig forskel ,. (B) Gener involveret i cellecyklus, celleproliferation og cellemigrering ifølge gen funktionel analyse (http:.. //Www genecards org) er præsenteret. Relativ fold ændring udtrykkes med forholdet mellem pCDNA3.1-ZIC1 versus pCDNA3.1 kontrol. (C) Systemisk forståelse af veje til ZIC1 regulering af signalering og målgener i udviklingen og progressionen af mavekræft.
Diskussion
voksende beviser har vist, at ZIC1 er involveret i udviklingen af flere tumorer [3-8] . Det fremgår, at ZIC1 aberrant udtrykkes i visse former for kræft og differentielt fungerer som en tumorsuppressor eller onkogen gen. For eksempel blev ZIC1 ekspression rapporteret lav eller fraværende i gastrointestinale og lungekræft cellelinier, og viste sig at undertrykke gastrointestinal cancer celleproliferation [7, 8, 29]. I modsætning hertil blev der fundet overekspression af ZIC1 i liposarkom at fremme celleproliferation og invasion [3]. Vi og andre har vist, at de epigenetiske modulationer, herunder DNA methylering og histon remodeling, og genetiske mutationer kan bidrage til dens differential ekspressionsmønstre i kræft [3, 4, 7, 8]. Det bliver klart, at som en zink finger transskription faktor, kan ZIC1 modulere flere nedstrøms gener i nervevæv, kolorektal cancer og liposarkom celler [2, 3, 7, 9]. Men lidt om den mekanisme underliggende ZIC1 funktion i udviklingen og progressionen af mavekræft. Understreger den centrale veje og downstream mål reguleret af ZIC1 kan lette vores forståelse af sine roller i tumorigenese. Her har vi vist, at overekspression af ZIC1 resulterer i signifikant inhibering af celleoverlevelse og nedskrivning af cellemigrering. ZIC1 undertrykker Shh, PI3K og MAPK signalveje, som er kritiske for regulering af celle-cyklus distributioner og celle migration i mavekræft. Desuden ZIC1 hæmmer cellecyklusregulerende kinaser, p21, p27 og cyklin D1, hvilket fører til G1 /S transit cellecyklus i gastriske kræftceller. ZIC1 undertrykker Shh signalvejen, der er kritisk for regulering af celle-cyklus distributioner og celle migration i mavekræft.
MAPK og PI 3K veje spiller kritiske roller i celledeling, differentiering og progression i en række forskellige humane cancere [30]. For nylig blev det også rapporteret, at aktiveringen af begge veje er afgørende for at inducere cellecyklus post [30, 31]. Under denne proces cyclin afhængige kinaseinhibitorer p21, p27 og cyclin D /E deltage i reguleringen af p53 induceret celle-cellecyklusstandsnings [24, 32]. Aktiveringen af MAPK og dets nedstrøms-kinase-Erk kunne ikke blot føre til induktion af cyclin D1 og passere gennem G1 /S checkpoint, men også ophobning af p21, som inhiberer cyclin E /CDK2-komplekser til at blokere S-fase entry [30] . PI 3K /Akt pathway kunne inaktivere GSK3-Ø og FOXO transkriptionsfaktorer, således hæmme cyklin D1 mens fremkalde p27 og p21 i reguleringen af entry-celle-cyklus [31]. Vi har vist, at re-ekspressionen af ZIC1 effektivt inaktiverer det phosphorylerede Akt og Erk1 /2 i AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901 mavekræft cellelinjer. I den forbindelse blev CDK1 inhibitor p21 aktiveret, mens cyclin D1 inaktiveret, efter overekspression af ZIC1 i gastriske cancerceller. Selvom resultaterne skal valideres i fremtidige undersøgelser, har vores miroarray data viste, at andre centrale elementer i cellecyklus kinase regulatorer herunder TP53INPI
og CDKN2B
, er dereguleret med tvungen udtryk for ZIC1 i en individuel MKN28 mavekræft celle line (figur 5 A og B). Foreslår derfor, vi, at ZIC1 regulerer G1 /S transit primært gennem PI 3K og MAPK veje og downstream celle-cyklus regulator kinaser i mavens kræftceller.
Anden væsentlig konklusion i vores nuværende undersøgelse, at ZIC1 transkriptionelt regulerer Sonic pindsvin (Shh) signalering i mavens kræftceller. Bortset fra sin centrale rolle om regulering gastrisk kirtel morfogenese i menneskelige mave, er Shh signalering også involveret i patogenesen af gastrisk kræft [16, 33]. Shh ofte aktiveres i avancerede gastriske adenokarcinomer og forbundet med aggressiv tumor adfærd [13, 15, 33]. Tidligere undersøgelser har vist, at Shh signalering fremmer motilitet og invasivitet af gastriske cancerceller gennem TGF-β-ALK5-Smad3 pathway [34]. Shh signalering kunne også regulere ekspressionen af p21 og cyclin D1 i en Gli-afhængige vej [16, 25]. Vi har observeret, at inhibering af Shh signalering ved administration med cyclopamin undertrykker AGS, BGC823 og SGC7901 gastrisk cancer cellemigrering, og regulerer ekspressionen af p21 og cyclin D1 (figur 4). Disse resultater stemmer overens med tidligere rapporterede undersøgelser [25, 34]. Vi har således vist, at ZIC1 spiller en vigtig rolle i gastrisk cancer progression ved regulering af Shh signalvejen.
ZIC1 kan regulere målgener i både sekvens-specifikke og uafhængige manerer [9]. ZIC1 kunne regulere transkriptionelle udtryk for mål, herunder cyklin D1, p27, Wnt1 og Wnt7a, og modulere Notch og BMP veje i neural udvikling [2, 9]. ZIC1 kunne modvirke GLI ved binding til GC-rige sekvenser, og undertrykke ekspressionen af GLI-bindende sekvens rettet reportergener [9, 35]. Vi identificerede adskillige Zic potentiel målgener i gastriske kræftceller ved microarray analyse. Disse mål er tæt relateret til cellecyklus, celleproliferation og migration (figur 5B). Sammenhængen mellem ZIC og nedstrøms mål kan være et fingerpeg for at forstå de potentielle perspektiv Zic proteiner i udviklingen af mavekræft.
Konklusioner
Summarisk foreslår vi en model, der repræsenterer de veje, hvorigennem ZIC1 bidrager til mavekræft progression (figur 5C). Overekspression af ZIC1 resultater i undertrykke Hedgehog (hh) signalering og dens downstream mål, herunder p21, p27 og cyklin D1. Som zinkfinger transkriptionsfaktor, ZIC1 også potentielt modulerer den transkriptionelle ekspression af målgener ved direkte binding til GC-rige sekvenser [2], og fungerer dermed som en tumorsuppressor ved inhibering af celleproliferation, cellemigration og invasion i gastrisk cancer.
Metoder
Celledyrkning og behandling
Den menneskelige gastrisk cancer cellelinier (AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901) blev opnået fra Riken Gene Bank (Japan) og American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og inkuberet ved 5% CO 2, 37 ° C og 95% fugtighed. Gastrisk cancer cellelinjer (AGS, BGC823, og SGC7901) blev behandlet med 10 pM af cyclopamin (Sigma, St. Louis, MO, USA) i DMSO i 24 timer. En tilsvarende koncentration af vehikel (DMSO) blev anvendt som kontrol.
Cell transfektion
AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901 celler blev dyrket i 24 timer i en 6-brønds plade og transficeret med pCDNA 3.1-ZIC1 eller pCDNA 3.1 tom vektor ved anvendelse Fugene HD (Roche) ifølge producentens instruktioner. Efter 48 timer blev transfektanterne kontinuerligt udvalgt i RPMI 1640-medium indeholdende G418 (200-400 pg /ml) (Merck, Tyskland) i 14 dage.
RT-PCR og kvantitativ realtids-PCR-analyse
Total RNA ( 1 ug) blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ved at følge producentens instruktioner og revers transkriberet til cDNA med M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan). Transcript niveauer af ZIC1 og Shh blev bestemt ved konventionel RT-PCR med TaKaRa Taq polymerase (Takara, Japan) eller kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) med SYBR Green Master Mix Kit (Takara, Japan) i et ABI 7500 PCR-system. Primere anvendt til ZIC1 var F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC og R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Shh var F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG og R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Glyceraldehyd-3-; phosohate dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern kontrol. Udskriften er udtrykt som 2 -ΔΔCt værdier og relativ udtryk fold ændring er normaliseret til GAPDH.
Cell levedygtighed assay
Cellelevedygtighed blev opdaget med en ikke-radioaktiv celleproliferationsassay med 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) reagenser (Promega, Madison, USA). Stabile transfekterede celler blev udpladet i 96 brønde (2000 celler /brønd) i 6 timer, 24 timer, 72 timer og 120 timer. Absorbansen blev målt ved 490 nm efter 1 times inkubering med CellTiter 96 Aqueous One Solution-reagens.
Cell-cyklus og celle apoptose analyse
cellecyklus fordelinger blev påvist ved flowcytometri analyse. Celler transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 tom vektor blev høstet og vasket med PBS. Cellulært DNA blev farvet med cellecyklus farvningsopløsning indeholdende propidiumiodid (PI) ved 4 ° C i mørke. Celle cyklus blev bestemt ved anvendelse af et FACS Calibur og analyseres med det ModFitLT software (Phoenix, USA).
Celle apoptose blev udført under anvendelse FITC Annexin V Apoptose Detection Kit II (BD Pharmingen) ved flowcytometri-analyse. Forbigående transficerede celler blev suspenderet i Annexin V Binding Buffer. Derefter FITC Annexin V og PI opløsninger blev tilsat i rækkefølge. Efter inkubation i 15 min, FACScan de farvede celler blev analyseret ved flow flowcytometri (Becton Dickinson, USA). Salg cellemigration og invasion assays Salg Cellemigrering vurderet ved modificeret Boyden Transwell kamre assay (Coring, USA). Kort fortalt blev celler dyrket i serum-frit medium i 24 timer og 5 × 10 4-celler blev udpladet til det øvre kammer i 300 pi medium indeholdende 5% FBS. Efter 16 timer inkubation blev ikke-migrerende celler i det øverste kammer forsigtigt fjernet med en vatpind. Migrerede Celler blev farvet med DAPI-farvningsopløsning. De celleantal blev tilfældigt talt i fem felter (× 400 forstørrelse).
Cell invasion blev udført i et Millipore 24 brønde overtrukket med BD Matrigel. Efter sult i serum-frit medium i 24 timer, 1 × 10 5-celler blev udpladet til det øvre kammer i 300 pi medium indeholdende 5% FBS, mens det nedre kammer blev fyldt med 600 pi kulturmedium med 15% FBS. Efter at være blevet inkuberet i 30 timer, blev membranerne inkuberet med Cell Stain Solution (Millorpore, USA). Farvestoffet Blandingen blev vasket ved ekstraktion puffer og overført til en 96-brønds til kolorimetrisk måling ved 560 nm.
Western blot-analyse
Total proteiner blev ekstraheret fra celler under anvendelse radio-immunpræcipitationsassay lyseringsbuffer suppleret med proteaseinhibitor. Lysater blev opløst på 6-12% SDS-PAGE minigeler og overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA). Membraner blev blokeret i 5% mælk med TBST og inkuberet i 4 ° C natten over med følgende antistoffer: ZIC1 (1: 500; Abcam), phospho-Akt (1: 1000; Cell Signaling), Akt (1: 500; Abcam), phospho-ERK1 /2-(1: 1000; Cell Signaling), Erk1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), p21 WAF1 /Cip1 (1: 1000; Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500, Epitomics), cyclin D1 (1: 1000; Cell Signaling) og Shh (1: 1000; Cell Signaling). Følgelig blev sekundære antistoffer koblet til peberrod peroxidise (HRP) visualiseret ved anvendelse af en kemiluminescens med Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japan). Massefylde proteiner blev kvantificeret med Image J. software og normaliseret for p-actin. (1: 2500, Multisciences Biotech)
cDNA microarray analyse
Totalt RNA blev isoleret fra MKN28 celler, som stabilt transficeret med pCDNA3.1 -ZIC1 eller pCDNA3.1 tom vektor, og blev revers transkriberet til cDNA. Mærkede prøver blev hybridiseret med Agilent hele menneskelige genom indeholder mere end 41.000 sonder (http:.....? //Www NCBI NLM NIH gov /geo /query /acc cgi acc = GSE38924). Mikroarrayet blev analyseret under anvendelse Agilent Feature Extraction software. Vi valgte en fold ændring ≥1.5 eller ≤ -1,5 som en signifikant forskel blev udført.
Statistisk analyse
Students t
test til at sammenligne to-uafhængige data, mens Chi-square eller Fisher eksakt test blev anvendt til analysere kategoriske variable. En afskæring af p < 0.05 blev anvendt for statistisk signifikans.
Notes
Jing Zhong, Shujie Chen bidraget ligeligt til dette arbejde.
Erklæringer
Kvittering
Projektet blev støttet af National Natural Science Foundation of China (30.900.676, 81071961), National Basic Research Program Kina (973 Program) (2012CB945004) og Videnskab og Teknologi Key projekt i Zhejiang-provinsen i Kina (2009 C03012-3). Forfatterne er taknemmelige for professor Tianhua Zhou og Prof. Lei Guo for nyttige forslag og diskussion;
Alkohol skader mikrobiomet i munden
Neil Bell udnævnt til Chief Development Officer for Avacta Life Sciences
Sådan styrkes dit immunsystem til at bekæmpe coronavirus
Flagende potentielle molekylære forudsigere for reaktion på biologiske terapier ved ulcerøs colitis
Oprettelse af et fysisk og genetisk kort over Cannabis sativa
Visse bakteriearter kan øge hiv -risikoen hos kvinder,
Mor-til-baby SARS-CoV-2-transmission under graviditet mulig, men sjælden,
siger undersøgelse Den igangværende pandemi af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) forårsaget af det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) skåner hverken mand eller kvinde.
Foranstaltninger til at forhindre SARS-CoV-2-transmission gennem spildevand i fattige regioner
Forskere verden over bestræber sig på at forstå, hvordan coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) og det nye patogen, der forårsager det-alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2)-spred
Nyfødt musemodel giver spor til årsag til ødelæggende tarmsygdom i anæmiske præemier
Læger har længe mistanke om, at transfusioner af røde blodlegemer givet til for tidligt fødte børn med anæmi kan bringe dem i fare for at udvikle nekrotiserende enterocolitis, eller NEC, en potentielt