| Stomach Health > magen Helse >  > Stomach Knowledges > undersøkelser

ZIC1 modulerer cellesyklusfordeling og cellemigrasjon gjennom regulering av Sonic pinnsvin, PI3K og MAPK signalveier i magekreft

ZIC1 modulerer cellesyklusfordeling og cellemigrasjon gjennom regulering av Sonic pinnsvin, PI 3K og MAPK signalveier i magekreft
Abstract
Bakgrunn
ZIC1, en vital transkripsjonsfaktor med sink finger domener, har vært implisert i prosessen med neural utvikling. Vi har tidligere vist at ZIC1 kan fungere som en tumor suppressor i gastrointestinal kreft. Men fortsatt ukjent molekylære mekanismen underliggende ZIC1 deltakelse i tumorprogresjon.
Metoder
rolle ZIC1 på celleproliferasjon og migrasjon ble undersøkt. Reguleringen av Sonic pinnsvin (Shh), phosphoinositide 3-kinase (PI 3K) og mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) signalveier etter ektopisk uttrykk for ZIC1 i magekreftceller ble evaluert.
Resultater
overekspresjon av ZIC1 bidrar til inhibering av celleproliferasjon og migrasjon cellesyklusfordelingen i magekreft. Modulering av G1 /S sjekkpunkt ved ZIC1 er hovedsakelig mediert gjennom regulering av cyclin-avhengige kinaser (p21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 og cyclin D1). I tillegg kan ZIC1 inaktivere nivået av phospholated Akt og ERK1 /2, og transkripsjonelt regulere sonisk hedgehog (Shh) signalering, og dermed fører til å regulere ekspresjonen av p21 Waf1 /Cip1 og cyklin D1. Endelig har vi systematisk identifisert ZIC1 nedstrøms mål av cDNA microarray analyse og avslørte at 132 gener er nedregulert og 66 gener er oppregulert etter transfeksjon med ZIC1 i mage kreftceller. Disse kandidat gener spiller avgjørende roller i celleproliferasjon, cellesyklus og cellemotilitet.
Konklusjoner
Overuttrykte ZIC1 resultater i inaktivering av Shh, PI 3K og MAPK signalveier, samt regulering av flere nedstrøms mål som er avgjørende for utvikling og progresjon av magekreft. ZIC1 fungerer som en potensiell terapeutisk mål for magekreft.
Nøkkelord
ZIC1 Sonic pinnsvinet Cellesyklus Tumor suppressor Bakgrunn
ZIC1, en av fem ZIC familie gener, er involvert i en rekke utviklingsprosesser, inkludert neurogenesis og myogenese [1, 2]. Nylig ZIC1 er dokumentert til å delta i utviklingen av humane tumorer inkludert medulloblastoma, livmorkreft, mesenchymale svulster og liposarkom kreft [3-6]. Vi har tidligere vist at ZIC1 gen er betydelig nedregulert i gastrisk kreft vev og cellelinjer sammenlignet med den for normal gastrisk vev. I tillegg ZIC1 tjener potensielt som en tumor suppressor ved å hemme celleproliferasjon i mage og kolorektal kreft celler [7, 8]. Som et viktig transkripsjonsfaktor, er ZIC1 vesentlig for regulering av pinnsvin signalering (Hh), benmorfogenetisk protein (BMP), og Notch signalveier i neural utvikling [2, 9]. Men lite er kjent om hvordan ZIC1 regulerer signalveier og deres tilhørende nedstrøms mål i kreft progresjon.
Magekreft er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [10, 11]. Hh signalering er en av de viktigste onkogene signaliseringsreaksjonsveier som er involvert i mave karsinogenese [12, 13]. Sonic hedgehog (Shh), et medlem av pattedyr Hh familien [14], har vist seg å være både oppregulert i magekreft vev ved in situ hybridiseringsanalyse og essensiell for utviklingen av magekreft [13, 15]. Hh signalveien aktiveres ved Shh binding med Lappet (ptch) - glattet (Smo) membran-reseptor-komplekset [16]. Aktivering av Shh fremmer magekreft celledifferensiering og spredning. Det har blitt rapportert at ZIC1 kan redusere uttrykket av PTCH1 Hotell og Shh
gener i nervevev under brain utvikling [17]. I motsetning til dette, har bevis vist at Shh undertrykker ekspresjonen av ZIC1 under Nevralrøret utvikling [18]. Likevel, påvirkning av ZIC1 på Hh signalveien i magekreft er ukjent.
ZIC1 regulerer også mange mål inkludert cyclin D1, p27, Wnt1 og Wnt7a under neural utvikling i Xenopus ectodermal explants og mutante mus modeller [9, 19, 20]. Vi er spesielt interessert i celle-syklus regulatorer viktige for kreftcelle spredning og differensiering. Vi har tidligere vist at overekspresjon av ZIC1 kan endre G1 /S overgang i magekreftceller [8]. Flere mekanismer av cyclin avhengige kinaser (CDK) er involvert i reguleringen av G1 /S sjekkpunkt i kreft hos mennesker [21]. Under overgang fra G1 til S-fasen, cyklin D som danner aktive komplekser med CDK4 er oppregulert i magekreft [22, 23]. Tap av cyclin avhengige kinase hemmere som p21 Waf1 /Cip1 og p27 Kip en fremme CDK2 aktivitet og regulerer G1 /S overgang [12, 24]. Nyere studier har vist at mutant ZIC1 eller kraft overekspresjon av ZIC1 regulerer uttrykket av p27 Kip 1 i mus lillehjernen vev og liposarkom celler [3, 20]. Interessant, Shh signalveien regulerer p21 negativt Waf1 /Cip1 og cyclin D1 i en GLI1 avhengig måte [16, 25]. Men om ZIC1 kan samspillet med Shh sti i regulering av cellesyklus distribusjoner er ikke definert. Opplysning av dette signalnettet kan gi ytterligere innsikt i rollen som ZIC1 i magekreft.
I vår nåværende studie, viser vi at overekspresjon av ZIC1 undertrykker magekreft celle migrasjon og invasjon, samt endrer celle-syklus distribusjoner. ZIC1 kan transcriptionally nedregulere Shh signalering og undertrykke nivået av phospholated Akt og Erk, og dermed fører til regulering av cellesyklus regulator kinaser p21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 og cyclin D1 i magekreftceller. Vi har også identifisert flere viktige ZIC1 nedstrøms mål i mage kreftceller ved cDNA microarray analyse
. Resultater
ZIC1 hemmer spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller
å bestemme effekten av ZIC1 på celleproliferasjon, vi utførte celleviabilitet analyse av MTS-analyser i mage kreftceller. Gastric kreft cellelinjer (AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901) ble transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 tom vektor. Transfeksjonseffektiviteten ble bekreftet ved henholdsvis RT-PCR og western blot (figur 1A). Resultatene viste at antallet levedyktige celler ble signifikant undertrykt av ektopisk ekspresjon av ZIC1 i en 5-dagers observasjon i BGC823 celler (figur 1B). Undertrykkelsen av celleproliferasjon ved ZIC1 var i overensstemmelse med våre tidligere observasjoner i AGS og MKN28 magekreftceller, så vel som tykktarmskreftceller [7, 8]. Figur 1 ZIC1 undertrykker celleproliferasjon og migrasjon i magekreft. (A) magekreft cellelinjer (AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901) ble stabilt transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 tom vektor. Uttrykket nivåer av ZIC1 mRNA og protein ble utført ved hjelp av RT-PCR (øvre diagram) og Western blot (lav diagram). GAPDH og β-aktin ble benyttet som intern kontroll. (B) Et cellelevedyktighet magekreft cellelinje (BGC823) ble bestemt ved MTS-celleproliferasjonsanalyse. Stjernen indikerer statistisk signifikans (** p < 0. 01). (C) Cellemigrering ble vurdert ved modifisert Boyden kammere Transwell-analyser etter inkubering i 16 timer. Celler som migrerte til bunnen av membranen ble farget med DAPI. (D) Et antall synlige trekkende celler (gjennomsnitt ± S.D) ble beregnet ved å telle fem tilfeldige høye kraftfeltene (400 x forstørrelse). Disse eksperimentene ble utført i tre eksemplarer. De representative data er vist. Stjernen indikerer statistisk signifikans (*** p < 0,001).
I tillegg fant vi ut hvilken rolle ZIC1 i celle migrasjon og invasjon i magekreft. Celle migrering og invasjon analyser ble utført i transwell migrasjon og Matrigel-belagte invasjon bestemmelsessystemer, henholdsvis. Vi observerte at re-uttrykk for ZIC1 undertrykte betydelig celle migrasjon i AGS, BGC823 og SGC7901 mage kreft cellelinjer (p < 0,001) (figur 1C, D). I tillegg vises gjen uttrykk for ZIC1 en betydelig lavere aktivitet av cellulær invasjon i forhold til de tomme vektor transfektanter i AGS celler (p < 0,05) (tilleggsfiler 1: Figur S1). Disse data tyder på at ektopisk uttrykk for ZIC1 undertrykker magekreft celle migrasjon og invasjon.
ZIC1 endrer celle-syklus distribusjoner og regulerer uttrykket av cyclin-avhengige kinaser i mage kreftceller
For ytterligere å forstå mekanismene bak hemming av celleproliferasjon ved overekspresjon av ZIC1, evaluert vi celle-syklus utdelinger i mage kreftceller. Vi har observert en høyere andel av celler i G1 fase i AGS (42,74%) og SGC7901 (54,03%) cellelinjer etter at overekspresjon av ZIC1. Men i cellene transfektert med en kontrollvektor, ble andelen redusert både i AGS (32,66%) og SGC7901 (47,00%), og den andel av celler i S-fasen er relativt øket (figur 2A). Det er vel akseptert at p21 (også kjent som p21 Waf1 /Cip1) og p27 (også kjent som p27 KIP1), to hoved cyclin-avhengige kinaser, er nødvendig for opphør under oppføring i S-fase [26]. Aktiveringen av Cyclin D1, men er først og fremst ansvarlig for regulering av G1-S-fase overgang [23]. Vi demonstrerte at ekspresjonsnivået av cyclin D1-protein ble redusert mens p21 og p27 ble markert indusert i magekreftceller transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 når sammenlignet med de pcDNA3.1 tom vektor transfektanter (figur 2B). Vi vurderte også celle apoptose utdelinger i pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 vektor transfektanter i AGS og MKN28 celler, men ingen åpenbare forskjeller i celle apoptose ble observert (tilleggsfiler 2: Figur S2). Derfor er disse resultatene støtter at overekspresjon av ZIC1 endrer cellesyklus distribusjoner gjennom regulering av cyclin-avhengige kinaser p21, p27 samt cyclin D1 i magekreftceller. Figur 2 ZIC1 endrer celle-syklus distribusjoner ved regulering av p21, p27 og cyclin D1 i magekreftceller. (A) Cell cycle fordelinger ble detektert ved strømningscytometri-analyse i AGS og SGC7901 celler etter transient transfeksjon med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 tom vektor i 24 timer. (B) Et uttrykk nivåer av p21, p27 og cyklin D1 ble bestemt ved Western blot. β-actin ble oppdaget som en lasting kontroll. Tetthetsverdiene er uttrykt som gangers endring i forhold til kontrollverdiene pcDNA3.1 vektor normalisert til 1. (C) med uttrykket nivåene av phospholated Akt og ERK1 /2, så vel som total Akt og ERK1 /2 ble undersøkt ved Western blot.
MAPK og PI 3K trasé spille viktige roller i reguleringen av cellesyklus kinaser. Vi evaluerte uttrykk for hoved nedstrøms effektorer av disse to banene, ERK1 /2 og Akt, etter stabilt innføre pcDNA3.1-ZIC1 til AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901 mage kreftceller (Figur 1a). Vi fant at fosforyleringen nivåene av ERK1 /2 og Akt ble dramatisk undertrykket ved overekspresjon av ZIC1 i alle ovennevnte cellelinjene som ble testet (figur 2C). Disse resultatene antydet at reguleringen av celle cylce fordeling av ZIC1 kan være mediert gjennom PI 3K og MAPK trasé og deres nedstrøms cyklin-avhengige kinaser p21, p27 og cyklin D1 i magekreft.
ZIC1 undertrykker ekspresjon av Sonic pinnsvin (Shh) i magekreftceller
molekylær karakterisering har vist at ZIC1
har sink-finger domener og kan motvirke med GLI1 ved å binde seg til GC-rike sekvenser [2]. GLI1 er et nedstrøms mål for pinnsvin (tt) signalveien som er avgjørende for magekreft utvikling og progresjon [9, 27]. Vi antok at Hh signalveien kan være involvert i reguleringen av ZIC1 magekreft cellesyklus og cellemigrasjon. For å løse dette problemet, undersøkte vi uttrykket av Sonic pinnsvin (Shh), et sentralt medlem av Hh familien, i magekreftceller etter overekspresjon av ZIC1. Vi fant at re-uttrykk for ZIC1 reduserer effektivt Shh uttrykk i BGC823 og SGC7901 cellelinjer av western blot analyse (figur 3A). I tillegg RT-PCR-analyse viste at transkripsjon nivået av Shh er også betydelig nedregulert i magekreftceller transfektert med ZIC1 forhold til tom vektor transfektanter (p 0,01) (figur 3B) (Tilleggs fil 3: Fig S3). . Til sammen våre resultater tyder på at ZIC1 kan transcriptionally regulere uttrykket av Shh i mage kreftceller. Figur 3 ZIC1 hemmer uttrykk for Sonic pinnsvin (Shh). (A) Ekspresjon av Shh protein ble analysert ved hjelp av Western blot i BGC823 og SGC7901 celler stabilt transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 tom vektor. (B) Ekspresjonsnivået av Shh mRNA ble bestemt ved sanntids kvantitativ RT-PCR-analyse. Den relative uttrykk nivået ble uttrykt som ganger endring (gjennomsnitt ± SEM) i forhold til pcDNA3.1 tom vektor normalisert til 1.
pinnsvin (Hh) signalveien er involvert i ZIC1 reguleringen av cellesyklusen og cellemigrasjon i magekreft celler
å bestemme effekten av Shh på celle-syklus distribusjoner, søkte vi å undersøke effekten av farmakologisk hemmer av Hh signale på uttrykk for p21 og cyclin D1. AGS, BGC823 og SGC7901 gastrisk cancer cellelinjer ble behandlet med cyclopamine (10 pM), en steroidal alkaloid som kommuniserer direkte med Smo å inhibere Hh signalering [28], eller DMSO kontroll i 24 timer. Vi har observert at uttrykket nivået av p21 var markert oppregulert, mens cyklin D1 nedregulert etter tumorceller ble behandlet med cyclopamine (figur 4A). Av notatet, blokkerer Shh signalveien ved administrasjon av cyclopamine påvirker ikke uttrykket nivåer av ZIC1 mRNA i BGC823 og SGC7901 celler ved RT-PCR-analyser (figur 4B). Den fraværende eller lav uttrykk for ZIC1 mRNA i magekreftceller ble hovedsakelig mediterte av promoter DNA metylering som vi beskrev tidligere [8]. Figur 4 Hh signalveien er involvert i ekspresjonen av p21, cyklin D1 og regulering av cellemigrering. AGS, BGC823 og SGC7901 magekreftceller ble behandlet med cyclopamine (10 pM), en steroidal alkaloid som kommuniserer direkte med Smo å hemme Hh signalisering, eller DMSO kontroll i 24 timer. (A) Et uttrykk nivåer av p21 og Cyclin D1 ble bestemt ved western blot i AGS, BGC823 og SGC7901 celler. (B) Ekspresjonsnivået av ZIC1 mRNA ble undersøkt ved hjelp av konvensjonell RT-PCR. (C) Cellemigrering ble vurdert ved modifisert Boyden Transwell kamre analyser. Celler som migrerte til bunnen av membranen ble farget med DAPI. (D) Det gjennomsnittlige antall synlige trekkende celler (gjennomsnitt ± S.D) ble beregnet i fem tilfeldige høy effekt felt (x 400). Stjernen indikerer statistisk signifikans (*** p < 0,001).
Vi vurderte også effekten av Shh signale på magekreft celle migrasjon. Som vist i figur 4 C og D, AGS, BGC823 og SGC7901 magecancercellelinjer viste signifikant reduksjon i cellemigrering etter administrering med cyclopamine (10 uM) i 24 timer (p 0,01). Sammen er disse resultatene viser at ZICI kan modulere celle-syklus regulatorer og cellemigrasjon gjennom Shh signalisering i magekreftceller.
Genekspresjon profilendringer ved ektopisk uttrykk for ZIC1
Å systematisk bestemme nedstrøms mål for ZIC1, gjennomførte vi en affymatrix oligonukleotid microarray i MKN28 magekreftceller med eller uten pcDNA3.1-ZIC1. Ved hjelp av en cut-off av > 1,5 ganger for statistisk signifikans, en microarray viste at 132 gener er nedregulert mens 66 gener er oppregulert ved eksogene uttrykk for ZIC1 (representative gener vist i figur 5A). Mange gener har blitt rapportert å spille kritiske roller i celleproliferasjon, cellesyklus og cellevandring i henhold til gen-funksjonell analyse (http:.. //Www genecards org) (figur 5B). For eksempel, to viktige cellesyklus regulatorer TP53INPI Kjøpe og CDKN2B
er funnet skal dereguleres i MKN28 celler transfekterte med pcDNA3.1-ZIC1. Våre resultater indikerer at ZIC1 potensielt regulerer flere nedstrøms gener involvert i mage tumorigenesis. Figur 5 genuttrykk profilendringer etter ektopisk uttrykk for ZIC1. (A) De genekspresjonsprofiler i pcDNA3.1-ZIC1 eller tom vektor pcDNA3.1 stabile transfektanter ble analysert ved hjelp av cDNA microarray i MKN28 celler. Representative gener er illustrert på høyre side av heatmap bildet ved hjelp av en cut-off > 1.5 eller < -1,5 Fold som en betydelig forskjell ,. (B) gener som er involvert i cellesyklus, celleproliferasjon og cellevandring i henhold til gen-funksjonell analyse (http:.. //Www genecards org) er presentert. Relativ ganger endring uttrykkes med forholdet av pcDNA3.1-ZIC1 versus kontroll pcDNA3.1. (C) Systemisk forståelse av trasé for ZIC1 regulering av alarm og målgener i utvikling og progresjon av magekreft.
Diskusjon
Økende bevis har vist at ZIC1 er involvert i utviklingen av flere svulster [3-8] . Det ser ut til at ZIC1 er abnormt uttrykt i visse typer kreft og differensielt fungerer som en tumor suppressor eller onkogene gen. For eksempel ble ZIC1 uttrykk rapportert å være lav eller fraværende i gastrointestinale og lungekreft cellelinjer, og ble funnet å undertrykke gastrointestinal cancer celleproliferasjon [7, 8, 29]. I motsetning til dette ble overekspresjon av ZIC1 i liposarkom funnet å fremme celleproliferasjon og invasjon [3]. Vi og andre har vist at den epigenetiske modulasjonene, inkludert DNA-metylering og histon ombygging, og genetiske mutasjoner kan bidra til dens differensial ekspresjonsmønstre i kreft [3, 4, 7, 8]. Det er klart at som et sink finger transkripsjonsfaktor, kan ZIC1 modulere multiple gener nedstrøms i neuralt vev, kolorektal kreft og liposarkom celler [2, 3, 7, 9]. Men lite er kjent om mekanismen underliggende ZIC1 funksjon i utvikling og progresjon av magekreft. Understreker de viktigste trasé og nedstrøms mål regulert av ZIC1 kan lette vår forståelse av sine roller i tumorigenesis. Her har vi vist at overekspresjon av ZIC1 resulterer i betydelig hemming av celleoverlevelse og svekkelse av cellemigrasjon. ZIC1 undertrykker Hysj, PI3K og MAPK signalveier som er kritiske for regulering av cellesyklus distribusjoner og cellemigrasjon i magekreft. Dessuten hemmer ZIC1 cellesyklusregulerende kinaser, p21, p27 og cyklin D1, og dermed fører til G1 /S cellesyklus transitt i magekreftceller. ZIC1 undertrykker Shh signalveien som er kritisk for regulering av cellesyklus-distribusjoner og cellemigrering i magekreft.
MAPK og PI 3K trasé spiller avgjørende roller i celleproliferasjon, differensiering og progresjon i en rekke humane cancere [30]. Nylig ble det også rapportert at aktiveringen av begge reaksjonsveier er nødvendig for å indusere cellesyklus oppføring [30, 31]. I løpet av denne prosessen, cyklinavhengig kinase inhibitorer p21, p27 og cyklin D /E deltar i regulering av p53-indusert cellesyklus-stans [24, 32]. Aktiveringen av MAPK og dens nedstrøms kinase-Erk kan ikke bare føre til induksjon av cyclin D1 og passerer gjennom G1 /S sjekkpunktet, men også akkumulering av p21 som hemmer cyklin E /CDK2-komplekser for å blokkere S-fase oppføring [30] . PI 3K /Akt sti kunne inaktivere GSK3p-p og FOXO transkripsjonsfaktorer, og således hemmer cyklin D1 mens indusere p27 og p21 i reguleringen av cellesyklusen oppføring [31]. Vi har vist at gjen uttrykk for ZIC1 effektivt inaktivere fosforylert Akt og ERK1 /2 i AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901 mage kreft cellelinjer. I denne forbindelse ble det CDK1 inhibitor p21 aktivert, mens cyklin D1 inaktivert, etter at overekspresjon av ZIC1 i magekreftceller. Selv om resultatene må være validert i fremtidige studier, har våre miroarray data viste at andre viktige komponenter i cellesyklus kinase regulatorer inkludert TP53INPI Hotell og CDKN2B
, er deregulert med tvungen uttrykk for ZIC1 i en individuell MKN28 magekreftcelle linje (Figur 5 A og B). Derfor foreslår vi at ZIC1 regulerer G1 /S transitt hovedsakelig gjennom PI 3K og MAPK trasé og nedstrøms celle-syklus regulator kinaser i mage kreftceller.
Annet stort funn i vår nåværende studien er at ZIC1 transcriptionally regulerer Sonic pinnsvin (Hysj) signalering i magekreftceller. Bortsett fra dens sentrale rolle i å regulere gastrisk kjertel morfogenese i magesekken hos mennesket, er Shh signale også involvert i patogenesen av magekreft [16, 33]. Shh ofte aktiveres i avanserte mage adenokarsinomer og assosiert med aggressiv svulst oppførsel [13, 15, 33]. Tidligere studier har vist at Shh signale fremmer motilitet og invasivitet av magekreftceller gjennom TGF-β-ALK5-Smad3 vei [34]. Shh signalering kan også regulere ekspresjonen av p21 og cyklin D1 i en Gli-avhengig reaksjonsvei [16, 25]. Vi har observert at hemming av Shh signalering av administrasjonen med cyclopamine undertrykker AGS, BGC823 og SGC7901 magekreft cellemigrasjon, og regulerer uttrykket av p21 og cyclin D1 (figur 4). Disse resultatene er i samsvar med tidligere rapporterte studier [25, 34]. Derfor har vi avdekket at ZIC1 spiller viktige roller i magekreft progresjon ved regulering av Hysj signalveien.
ZIC1 kan regulere målgener i begge sekvens-spesifikke og uavhengige oppførsel [9]. ZIC1 kunne regulere transkripsjonen uttrykk for mål inkludert cyclin D1, p27, Wnt1 og Wnt7a, og modulere Notch og BMP trasé i neural utvikling [2, 9]. ZIC1 kunne motvirke GLI ved å binde seg til GC-rike sekvenser, og undertrykke uttrykket av GLI-bindende sekvens rettet reporter gener [9, 35]. Vi identifiserte flere ZIC potensial målgener i mage kreftceller ved microarray analyse. Disse målene er nært relatert til cellesyklus, celleproliferasjon og migrasjon (figur 5B). Sammenhengen mellom ZIC og nedstrøms mål kan være et holdepunkt for å forstå potensialet perspektiv ZIC proteiner i utviklingen av magekreft.
Konklusjoner
Summarisk, foreslår vi en modell som representerer trasé gjennom hvilke ZIC1 bidrar til magekreft progresjon (figur 5C). Overekspresjon av ZIC1 resultater i å undertrykke Hedgehog (Hh) signal- og nedstrøms mål inkludert p21, p27 og cyclin D1. Som et sink finger transkripsjonsfaktor, ZIC1 også potensielt modulerer transkripsjonen ekspresjon av målgener ved direkte binding til GC-rike sekvenser [2], og dermed fungere som en tumor suppressor ved hemming av celleproliferasjon, cellemigrering og invasjon i magekreft.
Metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP og behandling Bedrifter Den menneskelige mage kreft cellelinjer (AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901) ble hentet fra Riken Genbank (Japan) og American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og inkubert ved 5% CO 2, 37 ° C og 95% luftfuktighet. Gastric kreft cellelinjer (AGS, BGC823, og SGC7901) ble behandlet med 10 mm av cyclopamine (Sigma, St. Louis, MO, USA) i DMSO i 24 timer. En ekvivalent konsentrasjon av bærer (DMSO) ble anvendt som kontroll.
Cell transfeksjon
AGS, MKN28, BGC823 og SGC7901 celler ble dyrket i 24 timer i en 6-brønns plate og transfektert med pcDNA 3.1-ZIC1 eller pcDNA 3,1 tom vektor bruker Fugene HD (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 48 timer ble transfektanter kontinuerlig valgt i RPMI 1640 medium inneholdende G418 (200-400 ug /ml) (Merck, Tyskland) i 14 dager.
RT-PCR og kvantitativ sanntid PCR-analyse
Totalt RNA ( 1 mikrogram) ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) etter produsentens anvisninger og revers transkribert til cDNA med M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan). De transkripsjonsnivåer av ZIC1 og Shh ble bestemt ved konvensjonell RT-PCR med Takara Taq polymerase (Takara, Japan) eller kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) med SYBR Grønn Master Mix Kit (Takara, Japan) i en ABI 7500 PCR-system. Primere som brukes til ZIC1 var F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC og R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Shh var F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG og R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Glyseraldehyd-3-; phosohate dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll. De transkripsjonsnivåer er uttrykt som 2 -ΔΔCt verdier og relative uttrykk ganger endring er normalisert til GAPDH.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble oppdaget med en ikke-radioaktivt celleproliferasjon analysen med 3- (4,5- dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) reagenser (Promega, Madison, USA). Stabile transfekterte celler ble sådd ut i 96-brønns (2000 celler /brønn) i 6 timer, 24 timer, 72 timer og 120 timer. Absorbansen ble målt ved 490 nm etter 1 timers inkubering med CellTiter 96 Aqueous One Solution reagens.
Cell-syklus og celle apoptose analyse
cellesyklus fordelinger ble detektert ved strømningscytometri-analyse. Celler transfektert med pcDNA3.1-ZIC1 eller pcDNA3.1 tom vektor ble høstet og vasket med PBS. Cellulær DNA ble farget med cellesyklus fargeløsning som inneholdt propidiumjodid (PI) ved 4 ° C i mørke. Cellesyklusen ble bestemt ved anvendelse av en FACS Calibur og analysert med ModFitLT programvare (Phoenix, USA).
Celle apoptose ble utført ved bruk av FITC Annexin V Apoptose Detection Kit II (BD Pharmingen) ved strømningscytometri-analyse. Forbigående transfekterte celler ble suspendert i Annexin V bindingsbuffer. Deretter FITC Annexin V og PI-løsningene ble tilsatt i rekkefølge. Etter inkubering i 15 minutter, FACScan de fargede celler ble analysert ved flow-flow-cytometri (Becton Dickinson, USA).
Cellemigrering og invasjons assays
Cellemigrering ble bestemt ved modifisert Boyden kammere Transwell-analyse (kjerneprøver, USA). I korthet ble cellene dyrket i serumfritt medium i 24 timer og 5 x 10 4-celler ble platet til det øvre kammer i 300 ul medium inneholdende 5% FBS. Etter 16 timers inkubasjon ble ikke-trekkende celler i det øvre kammeret fjernes forsiktig med en bomullspinne. Migrerte Cellene ble farget med DAPI Farging Solution. De celleantall ble tilfeldig tellet i fem felter (x 400 forstørrelse).
Celle invasjon ble utført på en Millipore 24-brønns belagt med BD Matrigel. Etter sult i serumfritt medium i 24 timer, 1 x 10 5-celler ble platet til det øvre kammer i 300 ul medium inneholdende 5% FBS, mens det nedre kammer ble fylt med 600 ul av kulturmedium med 15% FBS. Etter å ha blitt inkubert i 30 timer, ble membranene inkubert med celle Stain Solution (Millorpore, USA). Fargestoffet Blandingen ble vasket ved ekstraksjon buffer og overført til en 96-brønn for kolorimetri ved 560 nm.
Western blot-analyse
Totale proteiner ble ekstrahert fra cellene ved hjelp av radio-immunutfelling analyselyseringsbuffer supplert med protease inhibitor. Lysater ble løst på 6-12% SDS-PAGE Minigeler og overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA). Membraner ble blokkert i 5% melk med TBST og inkubert i 4 ° C over natten med følgende antistoffer: ZIC1 (1: 500; Abcam), fosfor-Akt (1: 1000, Cell Signaling), Akt (1: 500; Abcam), fosfor-ERK1 /2 (1: 1000, Cell Signaling), ERK1 /2 (1: 1000, Cell Signaling), p21 Waf1 /Cip1 (1: 1000, Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500; Epitomics), cyclin D1 (1: 1000, Cell Signaling) og Shh (1: 1000, Cell Signaling). Følgelig ble sekundære antistoffer koblet til pepperrot peroxidise (HRP) visualisert ved hjelp av en chemiluminescence med Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japan). De relative tettheter av proteiner ble kvantifisert med bilde J. programvare og normalisert til p-aktin. (1: 2500, Multisciences Biotech)
cDNA mikromatriseanalyse
Total RNA ble isolert fra MKN28 celler som er stabilt transfektert med pcDNA3.1 -ZIC1 eller pcDNA3.1 tom vektor, og ble reverstranskribert til cDNA. Merkede prøver ble hybridisert med Agilent hele menneskets genom inneholder mer enn 41.000 prober (http:.....? //Www NCBI NLM nih gov /geo /query /acc cgi acc = GSE38924). Microarray data ble analysert ved hjelp av Agilent Feature Extraction programvare. Vi valgte en fold endring ≥1.5 eller ≤ -1,5 som en betydelig forskjell.
Statistisk analyse
Student t
test ble utført for å sammenligne to uavhengige data, mens Chi-kvadrat eller fisker eksakte test ble brukt til å analysere kategoriske variabler. En cut-off av p < 0,05 ble brukt for statistisk signifikans.
Merknader
Jing Zhong, Shujie Chen bidratt likt til dette arbeidet.
Erklæringer
Erkjennelse
Prosjektet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (30900676, 81071961), National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB945004) og Science and Technology Key prosjekt i Zhejiang-provinsen i Kina (2009 C03012-3). Forfatterne er takknemlige for Prof. Tianhua Zhou og Prof. Lei Guo for nyttige forslag og diskusjon; . Og Thomas R. Austin for kritisk gjennomgang og redigering av manuskriptet
Electronic supplerende materiale
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff tilleggsfiler 1: Figur S1. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll.
  • magen Artikkel
    •   
  • gastric struktur
    •   
  • Vedlikehold av magen
    •   
  • undersøkelser

    • undersøkelser

    undersøkelser

    Other Languages

    magen Helse © https://www.stomachillness.com/no