ZIC1 modula le distribuzioni del ciclo cellulare e la migrazione delle cellule attraverso la regolamentazione di sonic hedgehog, PI
3K e MAPK vie di segnalazione nel carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
ZIC1, un fattore di trascrizione vitale con domini zinc finger, ha stati implicati nel processo di sviluppo neurale. Abbiamo precedentemente dimostrato che ZIC1 può funzionare come un soppressore del tumore nei tumori gastrointestinali. Tuttavia, il meccanismo molecolare alla base la partecipazione ZIC1 nella progressione tumorale rimane sconosciuto.
Metodi
Il ruolo del ZIC1 sulla proliferazione cellulare e la migrazione è stato esaminato. Il regolamento di Sonic hedgehog (Shh), phosphoinositide 3-chinasi (PI 3K) e proteina chinasi mitogeno-attivata (MAPK) vie di segnalazione dopo l'espressione ectopica di ZIC1 in cellule di cancro gastrico sono stati valutati.
Risultati sovraespressione di ZIC1 contribuisce alla inibizione della migrazione proliferazione cellulare e la distribuzione del ciclo cellulare nel cancro gastrico. La modulazione di G1 /S checkpoint da ZIC1 è mediata principalmente attraverso la regolazione delle chinasi ciclina-dipendenti (p21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 e ciclina D1). Inoltre, ZIC1 può inattivare il livello di phospholated Akt e ERK1 /2, e trascrizionalmente regolare sonic hedgehog (Shh) di segnalazione, determinando in tal modo regolare l'espressione di p21 Waf1 /Cip1 e ciclina D1. Infine, abbiamo sistematicamente identificato ZIC1 bersagli a valle mediante analisi cDNA microarray e ha rivelato che 132 geni sono regolati verso il basso e 66 geni sono up-regolati dopo trasfezione con ZIC1 in cellule di cancro gastrico. Questi geni candidati giocano un ruolo critico nella proliferazione cellulare, ciclo cellulare e motilità cellulare.
Conclusioni
sovraespressione di ZIC1 risultati in inattivazione di Shh, PI 3K e MAPK vie di segnalazione, così come il regolamento di bersagli multipli a valle che sono essenziali per lo sviluppo e la progressione del cancro gastrico. ZIC1 serve come un potenziale bersaglio terapeutico per il cancro gastrico.
Parole
ZIC1 di Sonic hedgehog ciclo cellulare tumorale soppressore di sfondo
ZIC1, uno dei cinque geni della famiglia Zic, è coinvolto in una serie di processi di sviluppo, tra cui la neurogenesi e miogenesi [1, 2]. Recentemente, ZIC1 è stato documentato per partecipare alla progressione dei tumori umani, tra cui il medulloblastoma, tumori endometriali, neoplasie mesenchimali e tumori liposarcoma [3-6]. Abbiamo precedentemente dimostrato che ZIC1 gene è significativamente downregulated in gastrica tessuti tumorali e linee cellulari rispetto a quella dei normali tessuti gastrici. Inoltre, ZIC1 serve potenzialmente come un soppressore del tumore inibendo la proliferazione cellulare in cellule di cancro gastrico e del colon-retto [7, 8]. Come un importante fattore di trascrizione, ZIC1 è essenziale per la regolazione di Hedgehog (Hh), proteina morfogenetica (BMP) e Notch vie di segnalazione in sviluppo neurale [2, 9]. Tuttavia, poco si sa su come ZIC1 regola i percorsi di segnalazione e relativi relativi obiettivi a valle nella progressione del cancro.
Cancro gastrico è la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo [10, 11]. Hh segnalazione è una delle principali vie di segnalazione oncogeni coinvolti nella carcinogenesi gastrica [12, 13]. Sonic hedgehog (Shh), un membro della famiglia dei mammiferi Hh [14], è stato dimostrato di essere sia sovraregolati nei tessuti di cancro gastrico da in test situ ed essenziale per la progressione del cancro gastrico [13, 15]. Hh percorso di segnalazione si attiva con Shh legame con il rattoppato (Ptch) - Smoothened (Smo) membrana-recettore complesso [16]. L'attivazione di Shh promuove gastrica differenziazione delle cellule del cancro e la proliferazione. E 'stato riportato che ZIC1 potrebbe ridurre l'espressione di PTCH1
e Shh
geni nel tessuto neurale durante lo sviluppo prosencefalo [17]. Al contrario, prove hanno dimostrato che la Shh reprime l'espressione di ZIC1 durante lo sviluppo del tubo neurale [18]. Tuttavia, l'influenza del ZIC1 sul percorso di segnalazione Hh nel carcinoma gastrico rimane sconosciuto.
ZIC1 regola anche numerosi obiettivi, tra cui la ciclina D1, p27, Wnt1 e Wnt7a durante lo sviluppo neuronale in espianti ectodermica Xenopus e modelli di topi mutanti [9, 19, 20]. Siamo particolarmente interessati a regolatori del ciclo cellulare importanti per la proliferazione delle cellule tumorali e la differenziazione. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'iperespressione di ZIC1 può alterare transizione G1 /S in cellule di cancro gastrico [8]. Diversi meccanismi di chinasi ciclina dipendente (CDK) sono coinvolti nella regolazione della G1 /S checkpoint nei tumori umani [21]. Durante la transizione da G1 a fase S, la ciclina D che forma complessi attivi con CDK4 è up-regolato in cancro gastrico [22, 23]. Perdita di ciclina inibitori della chinasi dipendenti, come p21 Waf1 /Cip1 e P27 Kip 1 promuovere l'attività CDK2 e regolare la transizione G1 /S [12, 24]. Recenti studi hanno dimostrato che il mutante ZIC1 o la forza sovraespressione del ZIC1 regola l'espressione di p27 Kip 1 nei topi tessuti cerebellari e cellule liposarcoma [3, 20]. È interessante notare che la via di segnalazione Shh regola negativamente p21 Waf1 /Cip1 e ciclina D1 in modo Gli1-dipendente [16, 25]. Tuttavia, se ZIC1 può interazione con pathway Shh nella regolazione della distribuzione del ciclo cellulare non è stato definito. Il chiarimento di questa rete di segnalazione può fornire ulteriori indicazioni circa il ruolo di ZIC1 nel carcinoma gastrico.
Nel nostro studio attuale, abbiamo dimostrato che l'iperespressione di ZIC1 sopprime la migrazione delle cellule di cancro gastrico e l'invasione, così come altera la distribuzione del ciclo cellulare. ZIC1 può trascrizionalmente downregulate la segnalazione Shh e sopprimere il livello di phospholated Akt e Erk, porta quindi alla regolazione del regolatore del ciclo cellulare chinasi p21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 e ciclina D1 nelle cellule di cancro gastrico. Abbiamo anche individuato bersagli multipli a valle importante ZIC1 in cellule di cancro gastrico mediante l'analisi cDNA microarray
. Risultati
ZIC1 inibisce la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro gastrico
Per determinare l'effetto di ZIC1 sulla proliferazione cellulare, abbiamo eseguito analisi vitalità cellulare mediante saggi MTS in cellule di cancro gastrico. linee cellulari di cancro gastrico (AGS, MKN28, BGC823 e SGC7901) sono state trasfettate con pcDNA3.1-ZIC1 o pcDNA3.1 vettore vuoto. L'efficienza di trasfezione è stata confermata rispettivamente RT-PCR e western blot (Figura 1A). I risultati hanno mostrato che il numero di cellule vitali è stata significativamente soppressa mediante espressione ectopica di ZIC1 nell'osservazione 5 giorni in BGC823 cellule (Figura 1B). La soppressione della proliferazione cellulare mediante ZIC1 era coerente con le precedenti osservazioni AGS e cellule tumorali gastrica MKN28, così come le cellule tumorali del colon [7, 8]. Figura 1 ZIC1 sopprime la proliferazione cellulare e la migrazione nel cancro gastrico. (A) gastrici linee cellulari tumorali (AGS, MKN28, BGC823 e SGC7901) sono stati stabilmente trasfettate con pcDNA3.1-ZIC1 o pcDNA3.1 vettore vuoto. I livelli di espressione di mRNA e proteine ZIC1 sono state eseguite mediante RT-PCR (figura in alto) e Western blot (basso diagramma). GAPDH e β-actina sono stati utilizzati come controlli interni. (B) La vitalità delle cellule della linea di cellule gastriche cancro (BGC823) è stata determinata mediante saggio di proliferazione delle cellule MTS. L'asterisco indica la significatività statistica (** p < 0. 01). (C) la migrazione delle cellule è stata valutata mediante modificato Boyden Transwell camere di test dopo incubazione per 16 ore. Le cellule che migrati al fondo della membrana sono state colorate con DAPI. (D) Il numero di celle migratori visibili (media ± S.D) è stato stimato contando cinque campi ad alta potenza casuale (× 400 ingrandimenti). Questi esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. I dati rappresentativi sono mostrati. L'asterisco indica la significatività statistica (p *** < 0,001).
Inoltre, abbiamo determinato il ruolo di ZIC1 nella migrazione cellulare e l'invasione nel cancro gastrico. saggi di migrazione cellulare e dell'invasione sono stati eseguiti in transwell migrazione e Matrigel rivestite sistemi di dosaggio invasione, rispettivamente. Abbiamo osservato che la ri-espressione di ZIC1 significativamente soppressa la migrazione delle cellule in AGS, BGC823 e SGC7901 linee di cellule di cancro gastrico (p < 0,001) (Figura 1C, D). Inoltre, ri-espressione di ZIC1 visualizzata un'attività significativamente inferiore di invasione cellulare rispetto a quelli transfettanti vuote vettore nelle cellule AGS (p < 0,05) (file aggiuntivo 1: Figura S1). Questi dati suggeriscono che l'espressione ectopica di ZIC1 sopprime la migrazione delle cellule cancro gastrico e l'invasione.
ZIC1 altera le distribuzioni del ciclo cellulare e regola l'espressione delle chinasi ciclina-dipendenti in cellule di cancro gastrico
Per capire meglio i meccanismi alla base l'inibizione la proliferazione delle cellule da sovraespressione di ZIC1, abbiamo valutato le distribuzioni del ciclo cellulare nelle cellule di cancro gastrico. Abbiamo osservato una maggiore percentuale di cellule in fase G1 a AGS (42.74%) e SGC7901 (54.03%) linee cellulari dopo sovraespressione di ZIC1. Tuttavia, nelle cellule trasfettate con un vettore di controllo, la percentuale è stata ridotta sia in AGS (32.66%) e SGC7901 (47,00%) e la percentuale di cellule in fase S è relativamente maggiore (Figura 2A). E 'ben noto che p21 (noto anche come p21 Waf1 /Cip1) e p27 (noto anche come p27 KIP1), due principali inibitori delle chinasi ciclina-dipendenti, sono necessari per la cessazione durante l'entrata di fase S [26]. L'attivazione della ciclina D1, tuttavia, è principalmente responsabile della regolazione della transizione di fase G1-S [23]. Abbiamo dimostrato che il livello di espressione della ciclina D1 proteine è stata ridotta mentre p21 e p27 sono state marcatamente indotte in cellule di cancro gastrico trasfettate con pcDNA3.1-ZIC1 rispetto a quelle pcDNA3.1 trasfettanti vuoto vettore (Figura 2B). Abbiamo valutato anche le distribuzioni apoptosi delle cellule in pcDNA3.1-ZIC1 o transfettanti pcDNA3.1 vettore nelle cellule AGS e MKN28, ma senza differenze evidenti di apoptosi delle cellule sono stati osservati (sui file 2: Figura S2). Pertanto, questi risultati supportano che la sovraespressione di ZIC1 altera le distribuzioni del ciclo cellulare attraverso la regolamentazione delle chinasi ciclina-dipendente p21, p27 e ciclina D1 nelle cellule di cancro gastrico. Figura 2 ZIC1 altera le distribuzioni del ciclo cellulare dalla regolazione di p21, p27 e ciclina D1 nelle cellule di cancro gastrico. (A) le distribuzioni del ciclo cellulare sono stati rilevati mediante citometria a flusso analisi AGS e SGC7901 cellule dopo trasfezione transiente con pcDNA3.1-ZIC1 o pcDNA3.1 vettore vuoto per 24 h. (B) I livelli di espressione di p21, p27 e ciclina D1 sono stati determinati mediante Western Blot. β-actina è stato rilevato come controllo di caricamento. I valori sono espressi come densitometria cambiamento volte rispetto ai valori pcDNA3.1 vettore di controllo normalizzato a 1. (C) I livelli di espressione di phospholated Akt e ERK1 /2, così come totale Akt e ERK1 /2 sono stati esaminati da Western Blot.
MAPK e PI 3K percorsi coinvolgimento è importante nella regolazione della chinasi del ciclo cellulare. Abbiamo valutato l'espressione di principali effettori a valle di questi due percorsi, ERK1 /2 e Akt, dopo aver introdotto stabilmente pcDNA3.1-ZIC1 di AGS, MKN28, BGC823 e SGC7901 cellule di cancro gastrico (Figura 1A). Abbiamo scoperto che i livelli di fosforilazione di ERK1 /2 e Akt sono stati drasticamente soppressi dalla sovraespressione di ZIC1 in tutte le linee cellulari testate sopra (Figura 2C). Questi risultati suggeriscono che la regolamentazione della distribuzione delle cellule-cylce da ZIC1 può essere mediata attraverso PI 3K e percorsi MAPK e la loro valle chinasi ciclina-dipendente p21, p27 e ciclina D1 nel cancro gastrico.
ZIC1 sopprime l'espressione di sonic hedgehog (Shh) in cellule di cancro gastrico
caratterizzazione molecolare ha dimostrato che ZIC1
ha domini zinc-finger e potrebbe contrastare con Gli1 legandosi a sequenze ricche di GC [2]. Gli1 è un obiettivo a valle del riccio (hh) via di segnalazione, che è essenziale per lo sviluppo del cancro gastrico e la progressione [9, 27]. Abbiamo ipotizzato che Hh percorso di segnalazione possono essere coinvolti nella regolazione ZIC1 di cancro gastrico del ciclo cellulare e la migrazione delle cellule. Per risolvere questo problema, abbiamo esaminato l'espressione di Sonic hedgehog (Shh), un membro chiave della famiglia Hh, in cellule di cancro gastrico dopo sovraespressione di ZIC1. Abbiamo scoperto che ri-espressione di ZIC1 riduce efficacemente Shh espressione in BGC823 e SGC7901 linee cellulari mediante analisi western blot (Figura 3A). Inoltre, l'analisi RT-PCR ha dimostrato che il livello trascrizione di Shh è anche significativamente downregulated in cellule di cancro gastrico trasfettate con ZIC1 relative al trasfettanti vuoto vettore (p < 0.01) (Figura 3B) (file complementare 3: Figura S3). . Nel loro insieme, i nostri risultati suggeriscono che ZIC1 può trascrizionalmente regolare l'espressione di Shh in cellule di cancro gastrico. Figura 3 ZIC1 inibisce l'espressione di Sonic hedgehog (Shh). (A) L'espressione della proteina Shh è stata analizzata mediante Western blot in BGC823 e SGC7901 cellule stabilmente trasfettate con pcDNA3.1-ZIC1 o pcDNA3.1 vettore vuoto. (B) il livello di espressione di mRNA Shh è stato determinato dal real-time quantitativa RT-PCR. Il livello di espressione relativa è stato espresso come variazione volte (media ± SEM) rispetto pcDNA3.1 vuoto vettore normalizzato a 1.
Hedgehog (Hh) via di segnalazione è coinvolto nella regolazione ZIC1 del ciclo cellulare e la migrazione delle cellule nel cancro gastrico cellule
per determinare l'effetto di Shh sulle distribuzioni del ciclo cellulare, abbiamo cercato di esaminare gli effetti di inibitore farmacologico di segnalazione Hh sull'espressione di p21 e ciclina D1. AGS, BGC823 e SGC7901 linee cellulari di cancro gastrico sono stati trattati con ciclopamina (10 micron), un alcaloide steroideo che interagisce direttamente con Smo per inibire Hh segnalazione [28], o il controllo DMSO per 24 h. Abbiamo osservato che il livello di espressione di p21 era decisamente up-regolati, mentre la ciclina D1 down-regolato dopo che le cellule tumorali sono state trattate con ciclopamina (Figura 4A). Da segnalare, bloccando la via di segnalazione Shh con la somministrazione di ciclopamina non influenza i livelli di espressione di mRNA ZIC1 in BGC823 e SGC7901 cellule mediante saggi di RT-PCR (Figura 4B). L'espressione assente o basso di ZIC1 mRNA in cellule di cancro gastrico è stato principalmente meditato dal promotore metilazione del DNA come abbiamo descritto in precedenza [8]. Figura 4 Hh percorso di segnalazione è coinvolto nella espressione di p21, ciclina D1 e la regolazione della migrazione delle cellule. AGS, BGC823 e SGC7901 cellule di cancro gastrico sono stati trattati con ciclopamina (10 micron), un alcaloide steroideo che interagisce direttamente con Smo per inibire la segnalazione Hh, o il controllo DMSO per 24 h. (A) I livelli di espressione di p21 e ciclina D1 sono state determinate mediante Western Blot in AGS, BGC823 e SGC7901 cellule. (B) il livello di espressione di mRNA ZIC1 è stata esaminata attraverso convenzionale RT-PCR. (C) la migrazione delle cellule è stata valutata mediante modificato Boyden transwell Chambers saggi. Le cellule che migrati al fondo della membrana sono state colorate con DAPI. (D) Il numero medio di cellule migratorie visibili (media ± S.D) è stata calcolata in cinque campi ad alta potenza casuali (× 400). L'asterisco indica la significatività statistica (p *** < 0,001).
Abbiamo inoltre valutato gli effetti della segnalazione Shh sulla migrazione delle cellule del cancro gastrico. Come mostrato in figura 4 C e D, AGS, BGC823 e SGC7901 linee di cellule di cancro gastrico mostrato diminuzione significativa migrazione cellulare dopo somministrazione con cyclopamine (10 pM) per 24 h (p < 0.01). Collettivamente, questi risultati dimostrano che ZICI può modulare i regolatori del ciclo cellulare e la migrazione cellulare attraverso la segnalazione Shh in cellule di cancro gastrico.
Profilo di espressione genica cambiamenti di espressione ectopica di ZIC1
Per determinare in modo sistematico gli obiettivi a valle di ZIC1, abbiamo condotto un microarray affymatrix oligonucleotide in MKN28 cellule di cancro gastrico con o senza pcDNA3.1-ZIC1. Usando un cut-off di > 1,5 volte per la significatività statistica, un microarray ha rivelato che 132 geni sono down-regolati mentre il 66 geni sono up-regolati da espressione esogena di ZIC1 (geni rappresentativi mostrato nella Figura 5A). Molti geni sono stati segnalati a svolgere un ruolo critico nella proliferazione cellulare, ciclo cellulare e la migrazione delle cellule secondo l'analisi funzionale del gene (http:.. //Www GeneCards org) (Figura 5B). Per esempio, due importanti regolatori del ciclo cellulare TP53INPI
e CDKN2B
si trovano ad essere deregolamentati in MKN28 cellule tranfected con pcDNA3.1-ZIC1. I nostri risultati indicano che ZIC1 regola potenzialmente più geni a valle coinvolti nella tumorigenesi gastrica. Figura 5 Gene cambiamenti nel profilo di espressione dopo espressione ectopica di ZIC1. (A) I profili di espressione genica in pcDNA3.1-ZIC1 o pcDNA3.1 vettore trasfettanti stabili vuoti sono stati analizzati mediante cDNA microarray in MKN28 cellule. geni rappresentativi sono illustrate sul lato destro dell'immagine heatmap utilizzando un cut-off > 1.5 o < -1.5 Piegare come una differenza significativa ,. (B) geni coinvolti nel ciclo cellulare, la proliferazione cellulare e la migrazione delle cellule secondo l'analisi funzionale del gene (http:.. //Www GeneCards org) sono presentati. fold change relativa è espressa con rapporto di pcDNA3.1-ZIC1 contro controllo pcDNA3.1. (C) comprensione sistemica di percorsi per ZIC1 regolazione di segnalazione e geni bersaglio nello sviluppo e nella progressione del cancro gastrico.
Discussione
crescente evidenza ha dimostrato che ZIC1 è coinvolta nella progressione di diversi tumori [3-8] . Sembra che ZIC1 è aberrante espresso in alcuni tipi di cancro e di funzioni modo differenziale come un soppressore del tumore o gene oncogeno. Per esempio, l'espressione ZIC1 è stato segnalato per essere bassa o assente in linee cellulari gastrointestinali e cancro ai polmoni, ed è stato trovato per sopprimere gastrointestinale proliferazione delle cellule tumorali [7, 8, 29]. Al contrario, la sovraespressione di ZIC1 in liposarcoma è stato trovato per promuovere la proliferazione cellulare e l'invasione [3]. Noi e altri abbiamo dimostrato che le modulazioni epigenetiche tra metilazione del DNA e istoni rimodellamento, e mutazioni genetiche possono contribuire ai suoi modelli di espressione differenziale nei tumori [3, 4, 7, 8]. Sta diventando chiaro che come un fattore di trascrizione dito di zinco, ZIC1 può modulare più geni a valle nel tessuto neurale, il cancro del colon-retto e liposarcoma cellule [2, 3, 7, 9]. Tuttavia, poco si sa circa il meccanismo di funzionamento ZIC1 sottostante nello sviluppo e nella progressione del cancro gastrico. Sottolineando le vie principali e gli obiettivi a valle regolati da ZIC1 può facilitare la comprensione dei suoi ruoli nella tumorigenesi. Qui, abbiamo dimostrato che l'iperespressione di ZIC1 risultati in significativa inibizione della sopravvivenza cellulare e compromissione della migrazione delle cellule. ZIC1 sopprime le vie di segnalazione Shh, PI3K e MAPK che sono fondamentali per la regolazione della distribuzione del ciclo cellulare e la migrazione delle cellule nel cancro gastrico. Inoltre, ZIC1 inibisce ciclo cellulare chinasi normativi, p21, p27 e ciclina D1, determinando in tal modo G1 /S transito del ciclo cellulare in cellule di cancro gastrico. ZIC1 sopprime la via di segnalazione Shh che è fondamentale per la regolazione della distribuzione del ciclo cellulare e la migrazione delle cellule nel cancro gastrico.
MAPK e PI 3K percorsi giocano un ruolo critico nella proliferazione cellulare, la differenziazione, e la progressione in una varietà di tumori umani [30]. Recentemente, è stato anche riportato che l'attivazione di entrambi i percorsi sono essenziali per indurre entrata ciclo cellulare [30, 31]. Durante questo processo, ciclina dipendente inibitori della chinasi p21, p27 e ciclina D /E partecipare nella regolazione di p53 indotta arresto del ciclo cellulare [24, 32]. L'attivazione di MAPK e la sua valle chinasi-Erk potrebbe non solo portare alla induzione di ciclina D1 e passare attraverso G1 /S checkpoint, ma anche l'accumulo di p21 che inibisce complessi ciclina E /CDK2 per bloccare l'ingresso S-fase [30] . PI percorso 3K /Akt potrebbe inattivare i fattori GSK3-beta e trascrizione FOXO, quindi inibire ciclina D1, mentre indurre p27 e p21 nella regolazione di entrata del ciclo cellulare [31]. Abbiamo dimostrato che ri-espressione di ZIC1 efficacemente inattivare il fosforilata Akt e ERK1 /2 in AGS, MKN28, BGC823 e SGC7901 linee cellulari di cancro gastrico. A questo proposito, il p21 inibitore CDK1 è stato attivato, mentre la ciclina D1 inattivato, dopo sovraespressione di ZIC1 in cellule di cancro gastrico. Anche se i risultati devono essere convalidati in studi futuri, i nostri dati miroarray hanno rivelato che altri componenti chiave dei regolatori del ciclo cellulare delle chinasi, tra cui TP53INPI
e CDKN2B
, sono deregolamentati con l'espressione forzata di ZIC1 in un individuo MKN28 cellule cancro gastrico riga (Figura 5 A e B). Pertanto, proponiamo che ZIC1 regola G1 transito /S principalmente attraverso PI 3K e MAPK percorsi e a valle del ciclo cellulare regolatore chinasi in cellule di cancro gastrico.
Un altro importante risultato nel nostro studio attuale è che ZIC1 regola trascrizionalmente Sonic hedgehog (Shh) di segnalazione in cellule di cancro gastrico. A parte il suo ruolo centrale sulla regolamentazione gastrica morfogenesi ghiandola nel stomaco umano, segnalazione Shh è anche coinvolto nella patogenesi del cancro gastrico [16, 33]. Shh è spesso attivato in adenocarcinomi gastrici avanzati e associata a un comportamento aggressivo tumore [13, 15, 33]. Studi precedenti hanno dimostrato che Shh segnalazione promuove la motilità e l'invasività delle cellule di cancro gastrico attraverso il percorso-Smad3 TGF-β-ALK5 [34]. Shh segnalazione potrebbe anche regolare l'espressione di p21 e ciclina D1 in un percorso Gli-dipendente [16, 25]. Abbiamo osservato che l'inibizione della segnalazione Shh dalla somministrazione con ciclopamina sopprime AGS, BGC823 e SGC7901 migrazione delle cellule del cancro gastrico, e regola l'espressione di p21 e ciclina D1 (Figura 4). Questi risultati sono coerenti con gli studi precedentemente riportati [25, 34]. Così, abbiamo rivelato che ZIC1 gioca un ruolo importante nella progressione del cancro gastrico mediante regolamento del percorso di segnalazione Shh.
ZIC1 possono regolare i geni bersaglio in entrambe le maniere sequenza-specifici ed indipendenti [9]. ZIC1 potrebbe regolare l'espressione trascrizionale di obiettivi, tra cui ciclina D1, p27, Wnt1 e Wnt7a, e modulare le vie Notch e BMP in sviluppo neurale [2, 9]. ZIC1 potrebbe contrastare GLI legandosi a sequenze ricche di GC, e sopprimere l'espressione di sequenza diretta geni reporter GLI vincolante [9, 35]. Abbiamo identificato diversi geni Zic potenziale bersaglio nelle cellule di cancro gastrico mediante l'analisi microarray. Questi obiettivi sono strettamente correlati al ciclo cellulare, la proliferazione cellulare e la migrazione (Figura 5B). L'associazione tra ZIC e target a valle potrebbe essere un indizio per comprendere il potenziale prospettiva di proteine Zic nella progressione del cancro gastrico.
Conclusioni
Sommariamente, proponiamo un modello che rappresenta i percorsi attraverso i quali ZIC1 contribuisce a cancro gastrico progressione (Figura 5C). Sovraespressione di risultati ZIC1 a sopprimere Hedgehog (Hh) di segnalazione e dei suoi bersagli a valle, tra cui p21, p27 e ciclina D1. Come un fattore di trascrizione dito di zinco, ZIC1 anche modula potenzialmente l'espressione trascrizionale di geni bersaglio da direttamente vincolanti per le sequenze ricche di GC [2], quindi funziona come un soppressore del tumore inibendo la proliferazione cellulare, la migrazione delle cellule e l'invasione di cancro gastrico.
Metodi
coltura delle cellule e il trattamento
Le linee di cellule di cancro gastrico umano (AGS, MKN28, BGC823 e SGC7901) sono stati ottenuti da Riken Gene Bank (Giappone) e American Type culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). Tutte le linee di cellule sono state coltivate in RPMI 1640 medium (Invitrogen, CA, USA) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e incubate a 5% di CO 2, 37 ° C e 95% di umidità. linee cellulari di cancro gastrico (AGS, BGC823, e SGC7901) sono stati trattati con 10 mM di cyclopamine (Sigma, St Louis, MO, USA) in DMSO per 24 ore. Una concentrazione equivalente del veicolo (DMSO) è stato utilizzato come controllo.
Cellulare trasfezione
AGS, MKN28, BGC823 e SGC7901 cellule sono state coltivate per 24 ore in una piastra da 6 pozzetti e trasfettate con pCDNA 3.1-ZIC1 o pCDNA 3.1 vettore vuoto utilizzando Fugene HD (Roche) secondo le istruzioni del produttore. Dopo 48 ore, i transfettanti sono stati costantemente selezionati in RPMI 1640 medium contenente G418 (200-400 mg /ml) (Merck, Germania) per 14 giorni.
RT-PCR quantitativa in tempo reale PCR
RNA totale ( 1 mg) è stato estratto usando il reagente Trizol (Invitrogen) seguendo le istruzioni del produttore e invertire trascritto in cDNA con M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Giappone). I livelli di trascrizione di ZIC1 e Shh sono stati determinati dal convenzionale RT-PCR con Takara Taq polimerasi (Takara, Giappone) o quantitativa real-time PCR (qRT-PCR) con il kit SYBR Green Master Mix (Takara, Giappone) in un ABI 7500 sistema PCR. Primer utilizzati per ZIC1 erano F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC e R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Shh erano F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG e R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Gliceraldeide-3-; deidrogenasi phosohate (GAPDH) è stato utilizzato come controllo interno. I livelli di trascrizione sono espressi come 2 -ΔΔCt valori e variazione relativa espressione volte è normalizzata a GAPDH.
Test vitalità cellulare
vitalità cellulare è stato rilevato con un test di proliferazione cellulare non radioattivo con 3- (4,5- dimethylthiazol-2-il -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-solfofenil) -2 H-tetrazolio (MTS) reagenti (Promega, Madison, Stati Uniti d'America)). cellule trasfettate stabili sono state piastrate in 96 pozzetti (2000 cellule /pozzetto) per 6 ore, 24 ore, 72 ore e 120 ore. L'assorbanza è stata misurata a 490 nm dopo 1 ora di incubazione con CellTiter 96 acquosa reagente una soluzione.
Cell-ciclo e l'analisi apoptosi delle cellule
distribuzioni del ciclo cellulare sono stati rilevati dalla citometria a flusso di analisi. Le cellule trasfettate con pcDNA3.1-ZIC1 o pcDNA3.1 vettore vuoto sono state raccolte e lavate con PBS. Il DNA cellulare è stata trattata con ciclo cellulare soluzione colorante contenente ioduro di propidio (PI) a 4 ° C al buio. ciclo cellulare è stato determinato utilizzando un FACS Calibur e analizzati con il software ModFitLT (Phoenix, Stati Uniti d'America).
cellulare apoptosi è stata effettuata utilizzando FITC annessina V apoptosi Detection Kit II (BD Pharmingen) mediante citometria a flusso di analisi. cellule transitoriamente trasfettate sono state sospese in annessina V Binding Buffer. Poi si aggiunsero soluzioni FITC annessina V e PI in sequenza. Dopo incubazione per 15 minuti, le cellule colorate sono stati analizzati da flusso FACScan citometria a flusso (Becton Dickinson, Stati Uniti d'America).
Migrazione cellulare e dell'invasione saggi
cellulare migrazione è stata valutata da modificata Boyden Transwell camere di dosaggio (carotaggio, Stati Uniti d'America). Brevemente, le cellule sono state coltivate in terreno privo di siero per 24 ore e 5 × 10 4 cellule sono state piastrate alla camera superiore in 300 microlitri mezzo contenente 5% FBS. Dopo 16 ore di incubazione, le cellule non-migratori in camera superiore sono stati accuratamente rimossi con un batuffolo di cotone. Le cellule migrate sono state colorate con colorazione DAPI Solution. Il numero di cellule sono state contate a caso in cinque campi (× 400 ingrandimenti).
Cellulare invasione è stata eseguita in un Millipore 24 pozzetti rivestiti con BD Matrigel. Dopo fame in mezzo privo di siero per 24 h, 1 × 10 5 cellule sono state piastrate alla camera superiore in 300 ml di mezzo contenente 5% FBS, mentre la camera inferiore è stato riempito con 600 ml di terreno di coltura con 15% FBS. Dopo essere stato incubato per 30 ore, le membrane sono state incubate con cellule Stain Solution (Millorpore, USA). La miscela colorante è stato lavato con tampone di estrazione e trasferito in un 96 pozzetti per la misurazione colorimetrica a 560 nm.
Analisi Western Blot
proteine totali sono stati estratti dalle cellule mediante radio-immunoprecipitazione tampone di lisi integrato con inibitore della proteasi. I lisati sono stati risolti su 6-12% minigels SDS-PAGE e trasferite su membrane di PVDF (Millipore, Bedford, MA). Le membrane sono state bloccate a 5% di latte con TBST e incubate a 4 ° C per una notte con i seguenti anticorpi: ZIC1 (1: 500; Abcam), fosfo-Akt (1: 1000; Cell Signaling), Akt (1: 500; Abcam), fosfo-ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), p21 Waf1 /Cip1 (1: 1000; Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500; Epitomics), ciclina D1 (1: 1000; Cell Signaling) e Shh (1: 1000; Cell Signaling). Di conseguenza, gli anticorpi secondari accoppiati a rafano perossidasi (HRP) sono stati visualizzati con un chemiluminescenza con Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Giappone). Le densità di proteine sono stati quantificati con software Image J. e normalizzati per beta-actina. (1: 2500, Multisciences Biotech)
cDNA microarray analisi
RNA totale è stato isolato da MKN28 cellule che stabilmente trasfettate con pcDNA3.1 -ZIC1 o pcDNA3.1 vettore vuoto, ed è stato inverso trascritto in cDNA. campioni etichettati sono stati ibridati con Agilent intero genoma umano contiene più di 41.000 sonde (http:.....? //www NCBI nlm NIH gov /geo /interrogazione /ACC cgi acc = GSE38924). I dati sono stati analizzati utilizzando microarray Agilent software Feature Extraction. Abbiamo scelto un fold change ≥1.5 o ≤ -1.5 come una differenza significativa analisi statistica
test t di Student
. È stata eseguita per confrontare i dati di due indipendenti, mentre chi-quadrato o test esatto di Fisher è stato utilizzato per analizzare le variabili categoriali. Un cut-off di p < 0.05 è stato applicato per la significatività statistica.
Note
Jing Zhong, Shujie Chen contribuito ugualmente a questo lavoro.
Dichiarazioni
Riconoscimento
Il progetto è stato sostenuto dal National Science Foundation naturale della Cina (30.900.676, 81071961), programma di ricerca di base nazionale della Cina (973 Program) (2012CB945004) e della Scienza e della Tecnologia progetto chiave della provincia di Zhejiang in Cina (2009 C03012-3). Gli autori sono grati al Prof. Tianhua Zhou e il Prof. Lei Guo per utili suggerimenti e discussione; . E Thomas R. Austin per la revisione critica e l'editing del manoscritto
materiale supplementare elettronica
12885_2011_3201_MOESM1_ESM.tiff sui file 1: Figura S1. GAPDH è stato utilizzato come controllo interno.
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