Katecholamín up-reguluje MMP-7 expresie aktiváciou AP-1 a STAT3 v žalúdku cancer

katecholamín up-reguluje MMP-7 expresie aktiváciou AP-1 a STAT3 u karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
stres, úzkosť a depresie môžu spôsobiť komplexné fyziologické a neuroendokrinné zmeny, vedúce k zvýšenej úrovni stresu hormónov katecholamínov, čo môže predstavovať primárny mechanizmus, ktorým gén fyziologické faktory majú vplyv výraz v nádoroch. V tejto štúdii sme skúmali účinky katecholamínov stimulácie na MMP-7 expresie v nádorových bunkách žalúdočnej a objasnené molekulárne mechanizmy na up-reguláciu MMP-7 úrovni katecholamínov prostredníctvom adrenergnej signalizačné dráhe.
Výsledky
Zvýšená expresia MMP-7 bol identifikovaný na úrovni mRNA a hladiny proteínov v rakovinových bunkách žalúdka v odozve na stimuláciu izoproterenol. β2-AR antigonist účinne zrušená izoproterenol vyvolanej MMP-7 expresie. Aktivácia STAT3 a AP-1 bola výrazne indukovaná stimuláciou izoproterenol a AP-1 vykazoval vyššiu účinnosť ako STAT3 v izoproterenol vyvolanej MMP-7 expresie. Mutagenéza z troch väzobných miest STAT3 v MMP-7 a promótor sa nepodarilo potlačiť transaktivaci MMP-7, promótor a umlčanie STAT3 expresie nebola účinná v prevencii izoproterenol vyvolanej MMP-7 expresie. Avšak, izoproterenol vyvolané MMP-7 promočnej aktivity boli úplne zmizli, keď bol pozemok AP-1 mutantného. STAT3 a c-Jun mohli fyzicky interagovať a viazať sa na miesta AP-1, zapletať, že súhra oboch transkripčných faktorov na mieste AP-1 je zodpovedná za izoproterenol stimulovaná MMP-7 expresie v nádorových bunkách žalúdka. Bolo zistené, že expresia MMP-7 v žalúdočných rakovinových tkanivách, že na mieste, kde bol nadmerne exprimovaný β2-AR a hladín MMP-7 a p2-AR boli najvyššie v metastatického miesta výskytu karcinómu žalúdka.
Závery
Up-regulácia MMP-7 expresie cez β2-AR-sprostredkované signálne dráhy sa podieľa na inváziu a metastázy rakoviny žalúdka.
pozadí
žalúdočné rakovina je druhou najčastejšou najčastejšou príčinou smrti na rakovinu súvisiace s okolo 700 000 úmrtí ročne [1, 2]. Jedným z dôležitých faktorov v patogenéze rakoviny žalúdka, je chronická infekcia Helicobacter pylori
[3]. Avšak, väčšina z infikovaných jedincov sa nevyvíjajú malignity a výsledok infekcie závisí na hostiteľovi, na životné prostredie a ďalšie faktory, [4]. Existuje stále viac dôkazov posilnenie úlohy psychického stresu v žalúdočnej nástupu rakoviny a vývoj [5]. Niektoré epidemiologické štúdie preukázali, že psychologické alebo správanie stresové faktory môžu urýchliť progresiu rakoviny žalúdka [6, 7]. Avšak presný mechanizmus, ktorým psychická záťaž pôsobí na progresiu rakoviny žalúdka, je nejasný.
Stres vyvolá odozvu na hypotalamus-hypofýza-nadobličky osi (HPA), čo vedie k zvýšeniu hladiny katecholamínov [8, 9]. Niekoľko štúdií preukázalo, že stimulácia katecholamínov zasahuje do bio-správanie nádorových buniek priamo, a to najmä prostredníctvom p2-adrenergné receptory (β2-AR) signálne dráhy sprostredkované [10-14]. Nedávna pozorovanie ukazuje na potenciálny mechanizmus pre progresiu vaječníkov, nosohltanu a pankreatické rakoviny ukazujú, že katecholamín môžu modulovať expresiu matrix metaloproteinázy (MMP) -2 a MMP-9 podľa strómy a nádorovými bunkami [15-17]. Vznáša zaujímavú otázku, že psychický stres môže hrať úlohu v rozvoji a progresii karcinómu žalúdka moduláciou expresie MMP prostredníctvom β2-AR sprostredkované signálne dráhy.
Nahromadené línií dôkazov ukazuje, že MMP-7 je zapojený do invázie a metastázy rakoviny žalúdka [18-24]. MMP-7 je najmenší známy člen rodiny MMP a má najvyššiu extracelulárnej matrix (ECM) -degradative aktivitu proti rôznym ECM zložky, vrátane elastín, želatína, kolagén typu IV, fibronektín, vitronektin, laminínu, entaktin, agrekanu a proteoglykány , medzi MMP [25, 26]. Je tiež schopný spustiť aktiváciu MMP kaskády [27]. Jedinečnou vlastnosťou MMP-7, je jeho obmedzené expresiu prevažne v epitelových bunkách žľazovej tkanivá vrátane normálnych prsných žliaz, pečene, pankreasu, prostaty a peribronchiolárním žliaz [28].
Zistilo sa, že MMP-7 je nadmerne exprimovaný v invazívne rakoviny tráviaceho ústrojenstva, ako je napríklad pažeráka [29], žalúdočné [30], pankreasu [31, 32], kolorektálny [33-35], pečeň [36] a iné orgány. Úroveň expresie MMP-7, je významne spojená s transformáciou nádorových buniek, fenotypmi agresívnych nádorov a stupni progresiu nádorov [37], a to najmä u nádorov gastrointestinálneho traktu. Zvýšená expresia MMP-7 je často identifikovaný v premalígnych žalúdočných lézií a najviac žalúdočných karcinómov [18 až 21, 24, 38]. Pozitívna korelácia medzi MMP-7 úrovni nádorové invázie do steny žalúdka, lymfatických uzlín, peritoneálnej šírenie a prežívanie pacientov s rakovinou žalúdka bola dokumentovaná v niekoľkých štúdiách [23]. MMP-7 bol uznaný ako dôležitý sprostredkovateľ progresia rakoviny a považovaný za nezávislý prognostický marker pre primárnu rakoviny žalúdka. Avšak, možné molekulárne mechanizmy MMP-7 nadmernú expresiu v karcinómu žalúdka sú stále do značnej miery bez prehliadky.
V tejto štúdii sme skúmali účinky katecholamínov stimulácie na MMP-7 expresie v žalúdočnej rakovinových bunkových línií a objasnené molekulárne mechanizmy v up-regulácia MMP-7 úrovni tým, že katecholamínov prostredníctvom adrenergnej signálnej dráhy.
Výsledky
izoproterenol stimulácia up-reguluje expresiu MMP-7
bolo preukázané, že expresia MMP-9 vo vaječníku rakovina bola významne zvýšená v asociovaných s nádorom makrofágoch u pacientov so zvýšenými depresívnych symptómov [15] a katecholamínov zosilnený LPS-indukovanú expresiu MMP v ľudských monocytov [39]. S cieľom zistiť, či Katecholamínové asociuje s expresiou MMP-7 v nádorových bunkách žalúdka, sme sa prvýkrát prezrel účinky β-AR agonistu izoproterenol prepis MMP-7 génu v žalúdku nádorových bunkových línií HGC-27 a MGC-803 , Dávky katecholamínov použité v tejto štúdii boli vybrané tak, aby odrážali fyziologických podmienok tohto hormónu v nádoroch [40, 41]. Semi-kvantitatívne real-time PCR analýzy ukázali, že MMP-7 expresie na transkripčný úrovni, bola nízka v žalúdočných nádorových bunkových línií. Keď boli bunky vystavené 10 uM izoproterenol v bezsérovém médiu po dobu 12 hodín, MMP-7 mRNA boli výrazne zvýšila v oboch bunkových líniách (Obr. 1A a 1B). Na určenie, či zvýšená hladina MMP-7 mRNA vedie k podobnej zvýšeniu produkcie proteínu, MMP-7 expresie v HGC-27 a MGC-803 buniek bol analyzovaný pomocou Western Blot. Ako je znázornené na Obr. 1C, izoproterenol stimulácia viedla k výraznému up-regulácia MMP-7 expresie v HGC-27 a MGC-803 buniek. β2-AR, ktorý sprostredkováva väčšinu účinkov katecholamínov, bol identifikovaný v ovariálnych nádorových buniek [11, 13] a prsníka. Na objasnenie role β2-AR-sprostredkovanej signalizácie v MMP-7 expresie sme použili antagonista propranolol β-AR a selektívne antagonistu β2-AR ICI-118551 otestovať, či je účinok izoproterenol na MMP-7 expresie môže byť inhibovaná. Naše dáta ukázali, že podávanie propranololu a ICI-118,551 účinne blokovaná izoproterenol stimulovaná MMP-7 expresie (obr. 1D, horný panel). Potom sme skúmali, či β2-AR je exprimovaný v rakovinových bunkách žalúdka. Dáta ukázali, že expresia p2-AR bola zaznamenaná u troch bunkových línií karcinómu žalúdka, vrátane HGC-27, MGC-803 a MKN-45 (obr. 1D, spodný panel). Tieto dáta ukázali, že izoproterenol stimuloval produkciu MMP-7 v žalúdočných rakovinových bunkových línií a že up-regulácia MMP-7 expresie izoproterenol bola vyvolaná predovšetkým β2-AR sprostredkovanej signalizácie. Obrázok 1 izoproterenol stimulácia up-reguluje expresiu MMP-7. A a B, HGC-27 a MGC-803 bunky boli inkubované cez noc v médiu bez séra a potom zmieša s 2 až 10 uM izoproterenol, resp. Expresie MMP-7 a mRNA bola analyzovaná RT-PCR (A) a real-time PCR (B). C, bunky HGC-27 boli stimulované 0, 1 alebo 2 uM izoproterenol a MGC-803 bunkách s 0, 5 a 10 uM izoproterenol po sérového hladovania. Expresie MMP-7 proteínu bola analyzovaná pomocou Western Blot. D, MGC-803 bunky boli ošetrené 10 uM propranolol alebo 1 uM ICI-118,551 po dobu 1 hodiny a potom sa 10 uM izoproterenol. MMP-7 expresie bola analyzovaná pomocou Western blot (horný panel); expresie p2-AR v MGC-803, MKN-45 a 27 HGC-buniek bola detekovaná Western Blot (dolný panel).
izoproterenol up-reguluje MMP-7 aktivitu promótorom a aktivuje STAT3 a AP-1
Ak chcete preskúmať molekulárne mechanizmy, ktorými katecholamín up-reguluje MMP-7 expresie, najprv stanovené, či izoproterenol stimulácia môže priamo ovplyvniť MMP-7 promotorovou aktivitu. konštruované sme plazmid PMMP-7, ktorý obsahuje luciferázový reportéri gén riadený 340 bp MMP-7 fragment promotora (-296 - 44) na (obr 2A.). MGC-803 bunky boli transfekovány PMMP-7 a účinok izoproterenol na MMP-7 promotorové aktivity bola hodnotená luciferázové testy. Ako je znázornené na Obr. 2B, po izoproterenol stimulácii po dobu 1 hodiny, luciferázy činnosti začala stúpať, a postupne sa zvyšuje. 6 hodín po expozícii, MMP-7 promotorové aktivity vykázali nad dvojnásobné zvýšenie v porovnaní s nestimulovaných kontrolných bunkách, čo naznačuje, že by mohol izoproterenol stimulácia priamo indukovať transaktivaci MMP-7 promótorom. Obrázok 2 izoproterenol up-reguluje MMP-7 aktivitu promótorom a aktivuje STAT3 a AP-1. A, schematické znázornenie plazmidu PMMP-7, ktorý obsahuje luciferázový reportéri gén riadený 340 bp MMP-7 promótorom fragmentu. SBE, STAT3 stránkam; ABE, AP-1 miesto. B, MGC-803 bunky boli ko-transfekovány PMMP-7 a prl-TK. Po transfekciu po dobu 48 hodín, boli bunky inkubované v médiu bez séra po dobu ďalších 24 hodín a potom stimulované 10 uM izoproterenol na 0, 1, 2, 3, 6 alebo 9 hodín, v danom poradí. MMP-7 promotorové aktivity boli hodnotené luciferázové testy. C a D, MGC-803 bunky boli ošetrené 10 uM propranolol po dobu 1 hodiny a potom sa 10 uM izoproterenol za 0, 15, 30, 60, 120 alebo 180 minút, v danom poradí. Fosforylácie STAT3 a c-Jun bola analyzovaná pomocou Western Blot s anti-fosfor-STAT3 a anti-fosfor-c-Jun králičie polyklonálne protilátky. ISO, izoproterenol.
V našej predchádzajúcej štúdii [42, 43], sme identifikovali AP-1 väzobné miesto na pozíciu -67 až -61 a tri STAT3 väzobné miesta na pozíciách -137 až -122, -168 až -159 a -255 do -245 v MMP-7 promótorom (obr. 2A). Tiež sme preukázali, že AP-1 a STAT3 viaže na AP-1 a jedného z STAT3 (-137 do -122) miest, pozitívny regulácia MMP-7 transkripciu. Nedávna štúdia ukázala, že katecholamín má potenciál pre aktiváciu STAT3. Pre zistenie, či je katecholamín stimuluje MMP-7 transkripciu cestou aktivácie STAT3 a AP-1, sme analyzovali fosforyláciu STAT3 a c-Jun. Obr. 2C ukazuje, že izoproterenol spôsobili fosforyláciu STAT3 po 30 minútach stimulácie, dosahuje vrchol na 2 hodiny. Aj keď sa aktivácia c-Jun bol pomalý, zahájená 60 minút, maximálna fosforylácie sa dosiahol po 2 hodinách, ako (obr. 2D). To znamenalo, že izoproterenol stimulácia produkoval β2-AR-sprostredkovaný signál, ktorý spúšťa aktiváciu STAT3 a AP-1.
STAT3 prvku v MMP-7, promótor nie je nutná a STAT3 nie sú dostatočné pre izoproterenol indukované MMP-7 expresie
na určenie, či sú STAT3 prvky sú funkčné v izoproterenol vyvolanej MMP-7 a génovej transkripcie, najprv ujal mutagenéza troch STAT3 miest prostredníctvom mutácií k jadru sekvencie STAT3 miest na základe PMMP-7 (obr. 3A) a skonštruoval plazmid PMMP-7 ms. Plazmid bol transfekován do MGC-803 buniek. Po transfekciu po dobu 48 hodín, boli bunky inkubované v médiu bez séra cez noc a potom stimulované 10 uM izoproterenol po dobu 6 hodín. Zistili sme, prekvapivo, že mutácia všetkých troch STAT3 väzobných miest nemá žiadny významnejší účinok na transaktivace MMP-7 promótorom. Ako je znázornené na Obr. 3B, luciferázové aktivity sa postupne zvyšuje a blížil vrchol pri 6 h po expozícii. Výsledok bol veľmi podobný ako u buniek transfekciou divokého typu MMP-7 promótorom. Na identifikáciu role STAT3 v tomto prípade HGC-27 a MGC-803 bunky boli transfekovány pGeneSuppressor vyjadrovať zhrnie cielenie STAT3 a HGC-27 /STAT3-SH a MGC-803 /STAT3-sh bunky stanovená. Obr. 3C ukazuje, že expresia STAT3 bol účinne potlačený v oboch bunkách. V súlade s vyššie uvedených údajov, izoproterenol vyvolané MMP-7 promotorové aktivity sa, že nie je významne znížená v MGC-803 /STAT3-sh buniek (obr. 3D). Okrem toho, izoproterenol vyvolané MMP-7 expresie na úrovni mRNA a proteínovej úrovni nebolo dôležitejšie je ovplyvnené tlmenie hluku STAT3 expresiou ako bolo preukázané pomocou RT-PCR, real-time PCR a Western Blot (obr. 3E, F a 3G). Výsledky naznačujú, že nie je nutné STAT3 prvkom v MMP-7, promótor a STAT3 nestačí pre izoproterenol vyvolané MMP-7 expresie. nie je nutné obrázok 3 STAT3 prvkom MMP-7, promótor a STAT3 nestačí pre izoproterenol vyvolané MMP-7 expresie. A, schematické znázornenie plazmidu PMMP-7 ms, ktorý obsahuje tri mutované STAT3 miesta na pozíciách -255 až -245, -168 až -159 a -137 až -122. B, MGC-803 bunky boli ko-transfekovány PMMP-7 ms a prl-TK, hladovať a potom stimulované 10 uM izoproterenol na hodnotu 0, 1, 2, 3, 6 alebo 9 hodín, v danom poradí. MMP-7 promotorové aktivity boli hodnotené luciferázové testy. C, HGC-27 a MGC-803 bunky boli stabilne transfekovány pGeneSuppressor vyjadrovať STAT3 zhrnieme. Expresia STAT3 bola analyzovaná pomocou Western Blot v HGC-27 /STAT3-sh a MGC-803 /STAT3-sh bunky. D, MMP-7 promotorové aktivity boli testované v MGC-803 buniek /STAT3-sh po stimulácii s 10 uM izoproterenol na hodnotu 0, 1, 2, 3, 6 alebo 9 hodín, v danom poradí. E až G, HGC-27 /STAT3-sh a MGC-803 /STAT3-SH bunky boli stimulované s 2 uM alebo 10 uM izoproterenol, resp. Expresie MMP-7 bola analyzovaná RT-PCR (E), PCR v reálnom čase (F) a Western blot (G).
AP-1 hrá dôležitú úlohu v izoproterenol-indukovanej expresie MMP-7
vyššie uvedené dáta bola neočakávaná, pretože STAT3 mohol byť aktivovaný izoproterenol stimuláciu. Okrem toho, v našej predchádzajúcej štúdie [42, 43], sme preukázali, že STAT3 a AP-1 sa zúčastnilo reguláciu HER2 signalizáciu sprostredkovanú MMP-7 expresie v bunkách rakoviny prsníka. Potom sme sa snažili zistiť, či AP-1 vplyvmi izoproterenol indukované MMP-7 expresie. MGC-803 bunky boli transfekovány plazmidom PMMP-7mA obsahujúci zmutovaný AP-1 miesto v polohe -67 až -61 v MMP-7 promótorom a luciferázové aktivity meranej (obr. 4A). Prekvapivo, izoproterenol vyvolané MMP-7 promotorové aktivity boli úplne zmizne vo všetkých časových bodoch (obr. 4B), čo naznačuje, že miesto AP-1 bolo veľmi dôležité v izoproterenol vyvolanej MMP-7 expresie. Obrázok 4 AP-1 hrá dôležitú úlohu v izoproterenol vyvolanej MMP-7 expresie. A, schematické znázornenie plazmidu PMMP-7mA obsahujúci zmutovaný AP-1 miesto v polohe -67 až -61. B, MGC-803 bunky boli ko-transfekovány PMMP-7 mA a prl-TK, hladovať a potom stimulované 10 uM izoproterenol na 0, 1, 2, 3, 6 alebo 9 hodín, v danom poradí. MMP-7 promotorové aktivity boli hodnotené luciferázové testy. C, MGC-803 bunky ko-transfekovány TAM67, PMMP-7 a PRL-TK boli indukované s 10 uM izoproterenol. MMP-7 promotorové aktivity boli analyzované luciferázové testy. D, MGC-803 bunky stabilne exprimujúce zhrnieme cielenie c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) boli stanovené a c-Jun expresie bola analyzovaná pomocou Western Blot. E, MMP-7 promotorové aktivity boli testované v MGC-803 /c-Jun-sh buniek po stimulácii s 10 uM izoproterenol na hodnotu 0, 1, 2, 3, 6 alebo 9 hodín, v danom poradí. F, MMP-7 expresie bola analyzovaná v MGC-803 /c-Jun-sh buniek po stimulácii s 0, 2 alebo 10 uM izoproterenol, resp. G, plazmidy exprimujúce c-Jun a STAT3C boli transfekovány do MGC-803 /c-Jun-sh buniek, v danom poradí. MMP-7 promotorové aktivity boli analyzované luciferázové testy.
Pre potvrdenie, izoproterenol vyvolané MMP-7 expresie je riadená AP-1, potom sme preskúmať, či transaktivace MMP-7 promótorom vyvolané izoproterenol by mohla byť inhibovaná dominantné negatívne c-Jun mutant TAM67, ktorý postráda c-Jun 5'-transaktivační doménu, ale má funkčný c-Jun leucín zips a DNA väzbovú doménu. Po prechodnej transfekciu sa TAM67 do MGC-803 buniek, izoproterenol indukované transaktivace MMP-7 promótorom bola analyzovaná luciferázové testy. Ako je znázornené na Obr. 4C, expresia dominantné negatívne c-Jun vykazovali jasné tlmila MMP-7 promotorové aktivity. Pre ďalšie overenie kritickú úlohu AP-1, sme testovali, či blokujúce endogénne exprimovaný c-Jun môže inhibovať expresiu MMP-7. V MGC-803 /c-Jun-SH bunky boli založené (obr. 4d) a MMP-7 promótor aktivity analyzované luciferázové testy. Dáta na Obr. 4E ukázal, že aktivity MMP-7 promótor boli nápadne znížené o knock-down c-Jun výrazu. Western blot analýza tiež ukázala, že isoprotereol indukovaná MMP-7 expresie bola v MGC-803 /c-Jun-sh buniek výrazne znížil, zatiaľ čo bol zistený v podstate veľké množstvo MMP-7 proteínu v rodičovských bunkách po izoproterenol stimulácii (Obr. 4F). Pozoruhodne, nadmerná expresia exogénneho c-Jun výrazne obnoviť MMP-7 promótorom aktivity v MGC-803 /c-Jun-sh buniek, ale konštitutívne aktivovaný STAT3 mutant STAT3C len minimálne aktivovanej MMP-7, promótor, kedy sa c-Jun expresie umlčané (obr . 4G). Tieto dáta ukázali, že AP-1 ovládaný izoproterenol indukovaná MMP-7 expresie.
C-Jun a STAT3 synergicky regulujú expresiu MMP-7, v odozve na stimuláciu izoproterenol
spoluprácu STAT3 a c-Jun pri regulácii rôznych transkripcie génov bola hlásená. Naše predchádzajúce štúdie ukazuje, že aktivácia MMP-9 promótorom závisí na interakciu STAT3 a AP-1 [44]. Ako bolo uvedené vyššie, izoproterenol stimulácia indukuje aktiváciu STAT3 a AP-1 súčasne. špekuluje sme, že STAT3 a AP-1 sa môže synergicky podieľať na regulácii izoproterenol stimulovanej MMP-7 expresie. Bolo uvedené, že AP-1 spolupracuje s STAT3 v interleukín 6-indukovanú transaktivaci odozvy prvku IL-6 v prípade absencie priameho AP-1 DNA väzby [45]. To nás viedlo k testovaniu možnej kooperatívny väzba AP-1 /STAT3 na stránke AP-1.
Ak chcete zistiť, či je toto STAT3 a AP-1 môžu byť prijatí do miesta AP-1, MMP-7 promótor in vivo , MGC-803 bunky boli stimulované 10 uM izoproterenol na 0, 2,5 alebo 4 hodiny, v danom poradí. Chromatínu DNA /komplexy jadrových proteínov boli pripravené a viazanie STAT3 a c-Jun na miesto AP-1, bola analyzovaná čipom testy. PCR produkt vybraný pre amplifikáciu siaha od -76 do 165 oblasti nesúci miesto AP-1 v MMP-7 promótorom. Imunoprecipitáciou s anti-STAT3 a anti-c-Jun protilátky nasleduje PCR bol získaný očakávaný pás 241 bp zo zrážacích po izoproterenol stimulácii po dobu 2,5 hodiny. Intenzity týchto kapiel boli oslabené po 4 hodinách. Naproti tomu, v nestimulovaných kontrolných bunkách, nie je väzba STAT3 na tomto mieste bolo pozorované a väzba c-Jun ťažko detegovateľný. Žiadna skupina bola amplifikovaná pomocou Imunoprecipitácia s použitím králičie IgG (obr. 5A). Údaje boli potvrdené PCR v reálnom čase (viď obr. 5B). Tieto dáta ukázali, že spojenie STAT3 a c-Jun sa MMP-7 promótorom in vivo
bol špecifický a že izoproterenol stimulácia vyvolaná väzbou STAT3 /c-Jun na AP-1 prvku. Obrázok 5 c-Jun a STAT3 synergicky regulujú MMP-7 expresie. A a B, MGC-803 bunky boli stimulované 10 uM izoproterenol na 0, 2,5 alebo 4 hodiny, v danom poradí. Chromatínu DNA /boli pripravené komplexy jadrových proteínov. Väzba STAT3 a c-Jun na miesto AP-1, bola analyzovaná imunoprecipitáciou s anti-STAT3 a anti-AP-1 protilátky s následnou PCR (A) a real-time PCR (B). C, MGC-803 bunky boli ošetrené 10 uM izoproterenol na 0 alebo 2,5 hodiny, v danom poradí. Jadrový extrakt bol pripravený pomocou jadrových cytosolu Extraction Kit. β-tubulínu a AP-2α boli analyzované pomocou Western blot skúmať oddelenie cytoplazmatických a jadrových proteínov. C, cytosolické proteíny; N, jadrové proteíny. D, 200 ug z jadrových extraktov sa vyliahli pri teplote 4 ° C po dobu 4 hodín s biotinylovanými oligonukleotidy, ktoré obsahujú AP-1 konvenčné sekvencie už skôr v spojení s Dynabeads M-280 v prítomnosti alebo neprítomnosti jedného, ​​päť alebo 15 násobnom množstve dvojitý -stranded oligonukleotidové konkurentov. Inkubácia jadrovými proteíny s dvojvláknových oligonukleotidov, ktoré obsahujú mutovaný AP-1 miesto (Mut oligo) alebo nešpecifické dvouřetězcové oligonukleotidy (NS oligopróby) bol použitý ako kontrola. Komplexy DNA /proteín boli oddelené s Dynal magnetom, a podrobené SDS-PAGE. STAT3 a c-Jun boli detekované westernovým prenosom s anti-STAT3 a anti-c-Jun protilátok. E a F, MGC-803 bunky boli kotransfekovány plazmidy PMMP-7 mA a pCDNA3.1 /c-Jun alebo STAT3C a Luciferase aktivity boli testované.
Pre ďalšie charakterizáciu interakcie STAT3 /c-Jun s AP-1 site sme vykonali DNA afinita zrážok testu. Potom, čo bola MGC-803 buniek ošetrených izoproterenol po dobu 2,5 hodiny, jadrový extrakt bol pripravený a jeho kvalita bola stanovená (pozri obr. 5c). Biotinylizované oligonukleotidy zodpovedajúce -74 až -52 regiónu MMP-7 promótorom boli inkubované s 200 ug jadrových extraktov pre testy pull-down. Streptavidin potiahnutých magnetických guľôčok bolo použité k vyzrážaniu biotínom značené dvouřetězcové oligonukleotidy a pridružené viažuci DNA proteíny. Väzba jadrových proteínov na biotinylovaných oligonukleotidov bola analyzovaná v prítomnosti jedného, ​​päť, alebo 15 násobnom množstve dvouřetězcové oligonukleotidové konkurentov, ktoré obsahujú AP-1 konvenčné sekvencie. Inkubácia jadrovými proteíny s dvojvláknových oligonukleotidov, ktoré obsahujú mutovanú AP-1 stránky alebo nešpecifické dvouřetězcových oligonukleotidov bol použitý ako kontrola. Výsledné DNA-proteínové komplexy boli rozdelené pomocou SDS-PAGE a potom Western Blot s anti-c-Jun a anti-STAT3 protilátok. Združenie oboch transkripčných faktorov s oligonukleotidy, ktoré obsahujú AP-1 konvenčné sekvencie by mohlo byť jasne detekovaný v jadrových extraktov z buniek stimulovaných izoproterenol, ale nie z nestimulovaných buniek. Súťaž s pätnástimi množstvom násobným súťažiacich úplne zrušila tvorbu biotinylovaných DNA /proteínové komplexy (obr. 5d). Žiadna väzba c-Jun a STAT3 buď oligonukleotidy obsahujúce zmutovaný AP-1 stránky alebo nešpecifické oligonukleotidy bol detekovaný (obr. 5D). Tento experiment poskytuje in vitro dôkazy, ktoré potvrdzujú, že STAT3 a C-Jun pod katecholamínov stimulácie, môžu fyzicky interagovať a viazať sa na stránky AP-1, aby sa dosiahlo transaktivaci MMP-7 génu v rakovinových bunkách žalúdka.
Ukázali sme, že izoproterenol indukovaná aktivácia MMP-7 promótorom nebol narušený mutagenézou k jadru sekvencie všetkých troch STAT3 miestach, čo naznačuje, že STAT3 prvky nemusí jednať izoproterenol vyvolanej MMP-7 transkripcie génu v rakovinových bunkách žalúdka. Pre ďalšie overenie rolu AP-1 prvku, pričom plazmid PMMP-7 mA bolo kotransfekovány do MGC-803 buniek buď pCDNA3.1 /c-Jun alebo STAT3C, v danom poradí. Zaujímavé je, že mutácie AP-1 väzobné miesto dôkladne zablokoval aktivácia MMP-7 promótorom v transfekciou buniek s nadmernou expresiou buď c-Jun alebo STAT3C (obr. 5E a 5F), čo ukazuje, že miesto AP-1 je dôležitý regulačný úsek a synergické regulácia izoproterenol vyvolanej MMP-7 expresie STAT3 a AP-1 sa opiera o tento element.
β2-AR a MMP-7 boli colocalized v žalúdočných rakovinových tkanivách
zvýšená expresia MMP-7 bol často na invazívne prednej časti ľudského karcinómu žalúdka a priamo spojené s prognózou u pacientov s rakovinou žalúdka. Pre štúdium korelácie hladiny β2-AR s MMP-7 v bunkách ľudského karcinómu žalúdka, sa vybralo päť vzoriek tkaniva karcinómu žalúdka a analyzovali expresiu p2-AR a MMP-7 imunohistochemické značenie. Zaujímavé je, že silná expresia p2-AR a MMP-7 sa objavili v rovnakej oblasti nádorových tkanivách (Obr. 6A), čo naznačuje, intímny vzťah medzi MMP-7 a p2-AR. Ďalej skúmať úlohu MMP-7 a p2-AR v metastázy rakoviny žalúdka, sme analyzovali expresiu MMP-7 a p-ARS v rakovinových, peri-rakovinových a metastatických tkaniva od pacienta s rakovinou žalúdka. Ako je znázornené na Obr. 6B, expresia b1-AR, p2-AR a MMP-7, na úrovni proteínu bola v rakovinové tkanive vyššia ako v peri-rakovinové tkanivá. Avšak, najvyššia expresia z nich bola nájdená v metastatického tkanive. Okrem toho, MMP-7 mRNA bola tiež nadmerne exprimovaný v metastatických tkanivách (obr. 6C). Tieto údaje silne naznačujú úzku väzbu medzi MMP-7, β2-AR a metastázy rakoviny žalúdka. Obrázok 6 β2-AR a MMP-7 bol nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka tkanivách. A päť vzoriek rakoviny žalúdka tkaniva boli zhromaždené. Expresie p2-AR a MMP-7, bola analyzovaná pomocou imunohistochémia. B, expresia MMP-7, β1-AR a β2-AR v rakovinových, peri-rakovinových a metastatických tkaniva bola analyzovaná pomocou Western Blot. C, hladina MMP-7 mRNA v rakovinových, peri-rakovinových a metastatických tkaniva bola analyzovaná pomocou PCR v reálnom čase.
Diskusia
tejto štúdie bolo založené na predpoklade, že psychosociálne stres môže byť predisponujúce faktor u rakoviny žalúdka. Stres, úzkosť a depresia môžu viesť komplexné fyziologické a neuroendokrinné zmeny, ktoré majú vplyv na viac systémov, vrátane tráviaceho systému. Pacienti s rakovinou často stretávajú značnú emocionálne rozrušenie. Združenie fyziologickým stresom sa zvýšením sekrécie žalúdočnej kyseliny a brucha už dlho si všimol, [46, 47]. Bolo oznámené, že chronický stres môže zhoršiť žalúdočné vredy. V nedávnom prieskume populačnej zapísané 2014 subjektov, stres bol považovaný za najmocnejšieho rizikový faktor u rakoviny žalúdka [48]. Poznatky z experimentálnych štúdií naznačujú, že zvýšená aktivita sympatického nervového systému, môže predstavovať primárny mechanizmus, ktorým gén fyziologické faktory majú vplyv expresiu v nádoroch [49]. K dnešnému dňu, väčšina štúdie skúmajúce mechanizmy spojovacie stresu a rakoviny progresie je spojená s nepriamymi účinkami prostredníctvom imunosupresie [8]. V niekoľkých nedávnych štúdií, proteíny a cesty v dôsledku stresu boli priamo spojené s zmeny správania malígnych buniek [10-17]. Avšak, je tu nedostatok dát, ktorá vymedzuje molekulárne mechanizmy spojené.
V tejto štúdii sme identifikovali zvýšenej MMP-7 expresiu v rakovinové bunkové línie žalúdočných v reakcii na stimuláciu stresom hormónu katecholamínov. Odhaduje sa, že koncentrácia katecholamínov by mohol byť viac ako 100 krát vyššia v mikroprostredí nádoru ako v normálnej tkanive a cirkulujúce v plazme. MMP-7 je jedinečný vo svojej obmedzenej expresie v nádorových bunkách, čo naznačuje, že MMP-7 expresie je v móde nádorom. Zistili sme, že izoproterenol stimulácia významne up-regulovaný MMP-7 expresie na úrovni mRNA a nízka hladina bielkovín v nádorových bunkách žalúdka. β2-AR antigonist účinne zrušená izoproterenol vyvolanej MMP-7 expresie up-regulácia čo naznačuje, že β2-AR-sprostredkovanej dráhy je zapojená do procesu.
, MMP-7 expresie je prísne kontrolovaná na úrovni transkripcie. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že heregulin-β-indukovanej MMP-7 expresie bola regulovaná HER2-sprostredkovanú aktiváciu STAT3 a AP-1 v ľudských bunkových líniách rakoviny prsníka [42, 43]. Tiež sme identifikovali funkčné väzbové miesta AP-1 a STAT3 v prvej 350 bp počiatku transkripcie v ľudskej MMP-7 promótorom [42, 43]. Ďalšie štúdie ukázali, že FGF-2 by mohli byť priamo upregulate MMP-7, génovú expresiu v ľudských nádorových bunkových línií a pupočníkovej žily endotelových buniek cez AP-1 a STAT3 [50]. Hromadia sa dôkazy silne podporuje, že STAT3 slúži ako ústredného regulačného uzla, na ktorom niekoľko onkogénne signálne dráhy konvergujú [51]. Nenormálne aktivácia STAT3 bolo preukázané, hrá kľúčovú úlohu v rozvoji rakoviny žalúdka [52, 53]. Nedávna štúdia a naše dáta odkryl pridružení catacholamine s aktiváciou STAT3 v vaječníkov a prsníka rakovinových buniek [12, 13]. V tejto štúdii sme preukázali, že izoproterenol stimulácia výrazne indukovanej aktivácie STAT3 v buniek karcinómu žalúdka, zapletať že katecholamínov môže urýchliť malígny progresiu karcinómu žalúdka. Naše nepublikované údaje tiež preukázané, že izoproterenol stimulovali expresiu MMP-2 a MMP-9 vo buniek karcinómu žalúdka najmä prostredníctvom aktivácie STAT3. Avšak, v tejto štúdii sme zistili, že AP-1 vykazoval vyššiu účinnosť ako STAT3 v izoproterenol vyvolanej MMP-7 a génovej transkripcie a STAT3 prvky sú nefunkčné, ako umlčanie STAT3 expresie nebola účinná v prevencii izoproterenol vyvolanej MMP 7 expresie a mutagenéza z troch väzobných miest STAT3 nepodarilo potlačiť transaktivaci MMP-7 promótorom v reakcii na indukciu izoproterenol. Na rozdiel od toho miesto AP-1 a c-Jun riadi tento proces. Je zaujímavé, že sa zistilo, STAT3 a c-Jun sa viazať na jedinú AP-1 miesto v MMP-7 promótorom súčasne, zapletať, že súhra oboch transkripčných faktorov na jedno väzobné miesto, je zodpovedný za izoproterenol stimulovaná MMP-7 expresie v karcinómu žalúdka buniek. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Proteomický zmena v gastic adenokarcinómov u japonských pacientov
• Pacient s rakovinou žalúdka s peritoneálnej karcinosou liečených intraperitoneálne chemoterapiu, ktorá prežila viac ako 5 rokov dostáva opakované laparoskopickej vyšetrenia: prípad report