Catecholamine up-regulerer MMP-7 uttrykk ved å aktivere AP-1 og STAT3 i magekreft

Catecholamine up-regulerer MMP-7 uttrykk ved å aktivere AP-1 og STAT3 i magekreft
Abstract
Bakgrunn
Stress, angst og depresjon kan føre til komplekse fysiologiske og nevroendokrine endringer, noe som resulterer i økt nivå av stress relatert hormon katekolamin, som kan utgjøre en primær mekanisme ved hvilken fysiologiske faktorer innvirkning genekspresjon i tumorer. I den foreliggende studien undersøkte vi effekten av katekolamin stimulering på MMP-7-ekspresjon i magekreftceller og belyst de molekylære mekanismer av oppregulering av MMP-7 nivå av katekolaminer gjennom en adrenerg signalveien.
Resultater
Økt MMP-7-ekspresjon ble identifisert ved både mRNA og proteinnivåene i magekreftcellene som respons på isoproterenol stimuleringen. β2-AR antigonist effektivt avskaffet isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk. Aktiveringen av STAT3 og AP-1 ble fremtredende indusert ved isoproterenol stimuleringen og AP-1 viste en større effekt enn STAT3 i isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk. Mutagenese av tre Stat3 bindingsseter i MMP-7 arrangøren ikke klarte å undertrykke den trans av MMP-7 promoter og stanse STAT3 uttrykk var ikke effektive i å forebygge isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk. Men isoproterenol-indusert MMP-7 promoter aktiviteter ble helt borte når AP-1 området ble mutert. STAT3 og c-Jun kunne fysisk samhandle og binde til AP-1 område, impliserer at samspillet mellom begge transkripsjonsfaktorer på AP-1 nettsted er ansvarlig for isoproterenol stimulert MMP-7 uttrykk i magekreftceller. Uttrykket av MMP-7 i mage kreft vev ble funnet å være på stedet der β2-AR ble overexpressed og nivåene av MMP-7 og β2-AR var den høyeste i metastatisk locus av magekreft.
Konklusjoner
Up-regulering av MMP-7 uttrykk gjennom β2-AR-mediert signalveien er involvert i invasjon og metastasering av magekreft.
Bakgrunn
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste ledende årsak til kreft dødsfall, med rundt 700 000 dødsfall hvert år [1, 2]. En av de viktigste faktorene i patogenesen av magekreft er kronisk infeksjon med Helicobacter pylori product: [3]. Men, de fleste smittede personer ikke utvikle kreft og utfallet av infeksjonen er avhengig av verten, miljømessige og andre faktorer [4]. Det er økende bevis som støtter rollen som psykologisk stress i magekreft utbruddet og utvikling [5]. Flere epidemiologiske studier har vist at psykologiske eller atferdsmessige stressfaktorer kan fremskynde utviklingen av magekreft [6, 7]. Imidlertid er uklart nøyaktig mekanismen som psykologisk stress opptrer i magekreft progresjon.
Stress utløser en reaksjon av hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen (HPA), noe som resulterer i økt catecholamine nivå [8, 9]. Flere studier har vist at stimulering av katekolaminer forstyrrer bio-atferd av tumorceller direkte, hovedsakelig gjennom p2-adrenerge reseptorer (β2-AR) -mediert signalveien [10-14]. Nyere observasjoner som peker til en mulig mekanisme for utviklingen av eggstokkreft, nasofaryngeale og bukspyttkjertel kreft tyder på at katekolaminer kan modulere uttrykk for matriksmetalloproteinase (MMP) -2 og MMP-9 av stroma og kreftceller [15-17]. Det reiser et interessant spørsmål som psykologisk stress kan spille en rolle i utvikling og progresjon av magekreft ved å modulere uttrykk for MMP gjennom β2-AR-mediert signalveien.
Akkumulerte bevislinjer viser at MMP-7 er involvert i invasjon og metastaser av magekreft [18-24]. MMP-7 er den minste kjent medlem av familien MMP og besitter den høyeste ekstracellulære matriks (ECM) -degradative aktivitet mot en rekke ECM-komponenter, inkludert elastin, gelatin, type IV kollagen, fibronektin, vitronektin, laminin, entactin, aggrecan og proteoglykaner blant de MMP'er [25, 26]. Det er også i stand til å utløse aktivering av en MMP kaskade [27]. En unik egenskap ved MMP-7 er den begrensede ekspresjon, hovedsakelig epitelceller i kjertelvevet, inkludert normalt brystepitel, lever, bukspyttkjertel, prostata og peribronchial kjertler [28].
Det er funnet at MMP-7 er overuttrykt i invasive kreft i fordøyelsesorganer, så som øsofageal [29], gastrisk [30], bukspyttkjertel [31, 32], kolorektal [33-35], lever [36] og andre organer. Ekspresjonsnivået av MMP-7 er signifikant assosiert med transformasjon av tumorceller, fenotyper av aggressive kreftformer og fasen av tumorprogresjon [37], spesielt i tumorer i mage- og tarmkanalen. Overekspresjon av MMP-7 blir ofte identifisert i premaligne gastriske lesjoner og mest gastrisk karsinom [18-21, 24, 38]. En positiv korrelasjon av MMP-7 nivå med svulst invasjonen av mage veggen, lymfeknutemetastase, peritoneal spredning og overlevelse av magekreftpasienter har blitt dokumentert i flere studier [23]. MMP-7 har blitt anerkjent som en viktig formidler av kreft progresjon og regnes som en uavhengig prognostisk markør for primær magekreft. Men de mulige molekylære mekanismer for MMP-7 overekspresjon i magekreft er fortsatt stort sett uutforsket.
I denne studien undersøkte vi effekten av katekolaminer stimulering på MMP-7 uttrykk i magekreft cellelinjer og belyst de molekylære mekanismer opp-regulering av MMP-7 nivå av katekolaminer gjennom en adrenerg signalveien.
Resultater
Isoproterenol stimulering opp-regulerer ekspresjonen av MMP-7
det ble vist at ekspresjonen av MMP-9 i ovarie kreft ble betydelig forbedret i tumorassosierte makrofager i pasienter med forhøyet depressive symptomer [15] og katekolamin forsterkes LPS-indusert ekspresjon av MMP'er i humane monocytter [39]. For å undersøke hvorvidt katekolaminer forbinder med ekspresjon av MMP-7 i magekreftceller, vi først undersøkt virkningene av β-AR-agonist isoproterenol på transkripsjonen av MMP-7-genet i magecancercellelinjer HGC-27 og MGC-803 . Dosene av katekolamin anvendt i denne studien ble valgt for å reflektere de fysiologiske betingelsene for dette hormonet i tumorer [40, 41]. Semi-kvantitativ og real-time PCR-analyser viste at MMP-7 uttrykk på transkripsjonsnivået var lavt i mage kreft cellelinjer. Når cellene ble eksponert for 10 uM av isoproterenol i serum-fritt medium i 12 timer, ble MMP-7 mRNA-nivåer merkbart øket i begge cellelinjer (Fig. 1A og 1B). For å avgjøre om økt nivå av MMP-7 mRNA fører til en tilsvarende økning i proteinproduksjon, MMP-7 uttrykk i HGC-27 og MGC-803 celler ble analysert ved Western blot. Som vist på fig. 1C, isoproterenol stimulering resulterte i en betydelig oppregulering av MMP-7-ekspresjon i HGC-27 og MGC-803-celler. β2-AR, som formidler de fleste effektene av katekolamin, er blitt identifisert i bryst- og eggstokk-kreft celler [11, 13]. For å klargjøre rollen til β2-AR-mediert signalisering i MMP-7 uttrykk, benyttet vi en β-AR antagonist propranolol og selektiv β2-AR antagonist ICI-118 551 for å teste om effekten av isoproterenol på MMP-7 ekspresjon kan bli hemmet. Våre data viser at behandling med propranolol og ICI-118551 effektivt blokkert isoproterenol-stimulert MMP-7 ekspresjon (Fig. 1D, øvre panel). Vi undersøkte om β2-AR er uttrykt i magekreftceller. Dataene viste at ekspresjonen av β2-AR var detekterbar i tre magecancercellelinjer inkludert HGC-27, MGC-803 og MKN-45 (fig. 1D, nedre panel). Disse data indikerte at isoproterenol stimulerte produksjon av MMP-7 i magekreftcellelinjer, og at den opp-regulering av MMP-7-ekspresjon ved isoproterenol ble hovedsakelig utløst av β2-AR-mediert signalisering. Figur 1 Isoproterenol stimulering opp-regulerer ekspresjonen av MMP-7. A og B, HGC-27 og MGC-803-celler ble inkubert over natten i serumfritt medium og deretter behandlet med 2 eller 10 uM isoproterenol, respektivt. Ekspresjonen av MMP-7 mRNA ble analysert ved RT-PCR (A) og real-time PCR (B). C, HGC-27 celler ble stimulert med 0, 1 eller 2 mikrometer isoproterenol og MGC-803 celler med 0, 5 og 10 mikrometer isoproterenol etter serum sult. Ekspresjonen av MMP-7-protein ble analysert ved hjelp av Western blot. D, MGC-803-celler ble behandlet med 10 uM propranolol eller 1 uM ICI-118551 i 1 time og deretter med 10 uM isoproterenol. MMP-7-ekspresjon ble analysert ved hjelp av Western blot (øvre panel); uttrykket av β2-AR i MGC-803, MKN-45 og HGC-27 celler ble oppdaget av Western blot (nedre panel).
Isoproterenol opp-regulerer MMP-7 promoter aktivitet og aktiverer STAT3 og AP-1
For å utforske de molekylære mekanismer som catecholamine opp-regulerer MMP-7 uttrykk, må vi først bestemt om isoproterenol stimulering kan direkte påvirke MMP-7 promoter aktivitet. Vi har konstruert et plasmid PMMP-7 som inneholdt et luciferase reporter-gen drevet av en 340 bp MMP-7-promotor-fragmentet (-296 til 44) (fig 2A.). MGC-803-celler ble transfektert med PMMP-7 og virkningen av isoproterenol på MMP-7-promotor-aktivitet ble bedømt ved luciferase-analyser. Som vist på fig. 2B, etter isoproterenol stimulering i 1 time, luciferase aktivitet begynte å stige og gradvis forbedret. Ved 6 timer etter eksponering, viste MMP-7 promoter-aktivitet i løpet av en fordobling i forhold til de ikke-stimulerte kontrollcellene, noe som tyder på at isoproterenol stimuleringen kunne direkte indusere transaktivering av MMP-7-promoteren. Figur 2 Isoproterenol opp-regulerer MMP-7-promoteraktivitet og aktiverer STAT3 og AP-1. En skjematisk representasjon av plasmid PMMP-7 som inneholdt et luciferase reporter-gen drevet av en 340 bp MMP-7-promotor-fragment. SBE, STAT3 nettstedet; ABE, AP-1 området. B, MGC-803 celler ble ko-transfektert med PMMP-7 og PRL-TK. Etter transfeksjon i 48 timer, ble cellene inkubert i serumfritt medium i ytterligere 24 timer og deretter stimulert med 10 pM isoproterenol for 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer, henholdsvis. MMP-7-promotor aktiviteter ble vurdert ved luciferase-analyser. C og D, MGC-803-celler ble behandlet med 10 uM propranolol i 1 time og deretter med 10 uM isoproterenol etter 0, 15, 30, 60, 120 eller 180 minutter, respektivt. Fosforyleringen av STAT3 og c-Jun ble analysert ved hjelp av Western blot med anti-fosfor-STAT3 og anti-fosfor-c-Jun kanin polyklonale antistoffer. ISO, isoproterenol.
I vår forrige undersøkelse [42, 43], identifiserte vi en AP-en bindingssetet i posisjonen -67 til -61 og tre STAT3 bindingsseter på posisjonene -137 til -122, -168 til -159 og -255 til -245 i MMP-7-promoteren (fig. 2A). Vi demonstrerte også at AP-1 og STAT3 bundet til AP-1 og en av de STAT3 (-137 til -122) områder, positivt regulerer MMP-7 transkripsjon. En fersk studie viste at catecholamine har potensial til å aktivere STAT3. For å undersøke om catecholamine stimulerer MMP-7 transkripsjon via aktivering av STAT3 og AP-1, analyserte vi fosforylering av STAT3 og c-juni Fig. 2C viste at isoproterenol forårsaket fosforyleringen av STAT3 etter 30 min stimulering, og nådde en topp på 2 timer. Selv om aktivering av c-Jun var langsom, initiert ved 60 min ble en maksimal fosforylering oppnådd 2 h også (fig. 2D). Det tilkjennegitt at isoproterenol stimuleringen produserte en β2-AR-mediert signal som utløses aktiveringen av STAT3 og AP-1. Det er ikke nødvendig, og STAT3 ikke tilstrekkelig for isoproterenol-indusert MMP-7 ekspresjon
STAT3 element i MMP-7-promoteren
for å finne ut om de Stat3 elementene er funksjonelle i isoproterenol-indusert MMP-7 gentranskripsjon, vi først foretok mutagenese av tre Stat3 sider via mutere kjerne-sekvenser av Stat3 nettsteder basert på PMMP-7 (fig. 3A) og konstruerte plasmid PMMP-7ms. Plasmidet ble transfektert inn i MGC-803-celler. Etter transfeksjon i 48 timer, ble cellene inkubert i serumfritt medium over natten og deretter stimulert med 10 pM av isoproterenol i 6 timer. Vi har lagt merke til, overraskende, at mutasjonen av alle tre STAT3 bindingsseter ikke hadde noen fremtredende virkning på transaktivering av MMP-7-promoteren. Som vist på fig. 3B, luciferase aktiviteter ble gradvis økt og nærmet seg en topp ved 6 timer etter eksponering. Resultatet var meget lik den som er observert i celler transfektert med villtype MMP-7-promoteren. Å identifisere hvilken rolle STAT3 i denne hendelsen, ble HGC-27 og MGC-803 celler transfektert med pGeneSuppressor uttrykker shRNA targeting STAT3 og HGC-27 /STAT3-sh og MGC-803 /Stat3-sh celler etablert. Fig. 3C viste at ekspresjonen av STAT3 ble effektivt undertrykt i begge celler. I samsvar med ovennevnte data, isoproterenol-indusert MMP-7 promoter aktiviteter syntes ikke å være betydelig svekket i MGC-803 /Stat3-sh celler (Fig. 3D). Videre isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk både mRNA og proteinnivåer ble ikke viktigere påvirket av stanse STAT3 uttrykk som demonstrert ved RT-PCR, real-time PCR og Western blot (Fig. 3E, F og 3G). Resultatene antydet at STAT3 element i MMP-7-promoteren ikke er nødvendig, og STAT3 ikke tilstrekkelig for isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk. Figur 3 STAT3 element i MMP-7-promotor er ikke nødvendig, og STAT3 ikke tilstrekkelig for isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk. En skjematisk representasjon av plasmid PMMP-7ms inneholdende tre muterte STAT3 områder på posisjonene -255 til -245, -168 til -159 og -137 til -122. B, MGC-803-celler ble ko-transfektert med PMMP-7ms og PRL-TK, sultet, og deretter stimulert med 10 pM isoproterenol for 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer, henholdsvis. MMP-7-promotor aktiviteter ble vurdert ved luciferase-analyser. C, HGC-27 og MGC-803 celler ble stabilt transfektert med pGeneSuppressor uttrykker STAT3 shRNA. Uttrykket av STAT3 ble analysert ved Western blot i HGC-27 /STAT3-sh og MGC-803 /Stat3-sh celler. D, MMP-7 promoter-aktivitet ble analysert i MGC-803 /sh STAT3-celler etter stimulering med 10 uM isoproterenol for 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer, henholdsvis. E til G, HGC-27 /STAT3-sh og MGC-803 /STAT3-sh celler ble stimulert med 2 mikrometer eller 10 mm isoproterenol, henholdsvis. Ekspresjonen av MMP-7 ble analysert ved RT-PCR (E), real-time PCR (F) og Western blot (G).
AP-1 spiller en avgjørende rolle i isoproterenol-indusert MMP-7 ekspresjon
oven~~POS=TRUNC data var uventet, siden STAT3 kunne aktiveres av isoproterenol stimulering. I tillegg, i vårt tidligere studium [42, 43], demonstrerte vi at STAT3 og AP-1 deltok i å regulere Her2 signale-mediert MMP-7-ekspresjon i brystkreftceller. Vi ønsket å undersøke om AP-1 påvirker isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk. MGC-803 celler ble transfektert med plasmid PMMP-7mA inneholder en mutert AP-1 stedet ved posisjon -67 til -61 i MMP-7 promoter og luciferase aktiviteter måles (fig. 4A). Overraskende, isoproterenol-indusert MMP-7 promoter aktiviteter ble helt borte ved alle tidspunkter (Fig. 4B), noe som tyder på at AP-1 området var avgjørende i isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk. Figur 4 AP-1 spiller en avgjørende rolle i isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk. En skjematisk representasjon av plasmid PMMP-7mA inneholdende et mutert AP-1-sete ved posisjon -67 til -61. B, MGC-803-celler ble ko-transfektert med PMMP-7mA og PRL-TK, sultet og deretter stimulert med 10 pM isoproterenol for 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer, henholdsvis. MMP-7-promotor aktiviteter ble vurdert ved luciferase-analyser. C, MGC-803 celler co-transfektert med TAM67, PMMP-7 og PRL-TK ble indusert med 10 mikrometer isoproterenol. MMP-7-promotor aktiviteter ble analysert ved hjelp av luciferase-analyser. D, MGC-803-celler som stabilt uttrykker shRNA targeting c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) ble etablert og c-Jun uttrykk ble analysert ved Western blot. E, MMP-7 promoter-aktivitet ble analysert i MGC-803 /c-Jun-SH-celler etter stimulering med 10 uM isoproterenol for 0, 1, 2, 3, 6 eller 9 timer, henholdsvis. F, MMP-7 uttrykk ble analysert i MGC-803 /c-Jun-sh celler etter stimulering med 0, 2 eller 10 mm isoproterenol, henholdsvis. G, plasmidene uttrykker c-Jun og STAT3C ble transfektert inn MGC-803 /c-Jun-sh celler, henholdsvis. MMP-7-promotor aktiviteter ble analysert ved hjelp av luciferase-analyser.
For å bekrefte isoproterenol-indusert MMP-7 ekspresjon blir kontrollert av AP-1, så undersøkte vi hvorvidt transaktivering av MMP-7-promoteren indusert av isoproterenol kunne inhiberes ved en dominerende negativ c-Jun mutant TAM67, som mangler c-Jun 5'-transaktivedomene men besitter en funksjonell c-Jun leucine glidelås og DNA-bindende domene. Etter transient transfeksjon med TAM67 inn MGC-803 celler, ble isoproterenol-indusert trans av MMP-7 promoter analysert av luciferase analyser. Som vist på fig. 4C, uttrykk for den dominerende negativ c-Jun viste en påfallende dempende på MMP-7 promoter aktiviteter. Hvis du vil kontrollere den kritiske rollen AP-en videre, testet vi om å blokkere endogent uttrykt c-Jun kan hemme uttrykket av MMP-7. De MGC-803 /c-Jun-sh celler ble etablert (fig. 4D) og MMP-7 promoter aktiviteter analysert av luciferase analyser. Dataene i fig. 4E viste at aktivitetene til MMP-7 promoter ble påfallende redusert med knock-down av c-Jun uttrykk. Western blot-analyse viste også at isoprotereol-indusert MMP-7-ekspresjon ble betydelig redusert hos MGC-803 /c-Jun-SH-celler, mens en vesentlig større mengde av MMP-7-protein ble påvist i foreldrecellene etter isoproterenol stimuleringen (fig. 4F). Spesielt, overekspresjon av eksogene c-Jun dramatisk restaurert MMP-7 promoter aktiviteter i MGC-803 /c-Jun-sh celler, men konstitutivt aktivert STAT3 mutant STAT3C bare minimalt aktivert MMP-7 promoter når c-Jun uttrykk ble stille (Fig . 4G). Disse dataene viste at AP-en dominert isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk.
C-Jun og STAT3 synergi regulere MMP-7 uttrykk som svar på isoproterenol stimulering
Cooperation Stat3 og c-Jun i å regulere en rekke gentranskripsjon er blitt rapportert. Vår tidligere studie viser at aktivering av MMP-9-promoteren er avhengig av interaksjonen mellom Stat3 og AP-1 [44]. Som nevnt ovenfor, isoproterenol stimuleringen indusert aktivering av STAT3 og AP-1 samtidig. Vi har spekulert i at Stat3 og AP-1 kan synergistisk delta i reguleringen av isoproterenol-stimulert MMP-7 uttrykk. Det har blitt antydet at AP-1 samvirker med STAT3 i interleukin-6-indusert transaktivering av IL-6-responselement i fravær av direkte AP-1 DNA-binding [45]. Det fikk oss til å teste mulige samarbeids binding av AP-1 /STAT3 til AP-1 området.
For å avgjøre om det STAT3 og AP-en kan bli rekruttert til AP-1 området i MMP-7 promoter in vivo , MGC-803-celler ble stimulert med 10 pM av isoproterenol til 0, 2,5 eller 4 timer, henholdsvis. Den kromatin DNA /kjernefysiske protein komplekser var forberedt og binding av STAT3 og c-Jun til AP-1 området ble analysert ved chip analyser. PCR-produktet som er valgt for forsterkning strekker seg fra -76 til 165 region huse AP-1 området i MMP-7 promoter. Den immunoutfelling med anti-STAT3 og anti-c-Jun-antistoffer etterfulgt av PCR ga en forventet 241 bp båndet fra fellings etter isoproterenol stimuleringen i 2,5 timer. Intensitetene av disse båndene ble svekket etter 4 timer. I motsetning til i ustimulerte kontrollceller ingen binding av STAT3 til dette området ble observert og binding av c-Jun knapt synlig. Ingen bånd ble amplifisert ved immunoutfelling under anvendelse av kanin-IgG (Fig. 5A). Dataene ble bekreftet ved sanntids-PCR (fig. 5B). Disse dataene viste at foreningen av STAT3 og c-Jun med MMP-7 promoter in vivo
var bestemt og at isoproterenol stimulering indusert binding av STAT3 /c-Jun til AP-1 element. Figur 5 c-Jun og STAT3 synergi regulere MMP-7 uttrykk. A og B, ble MGC-803-celler stimulert med 10 pM av isoproterenol til 0, 2,5 eller 4 timer, henholdsvis. Den kromatin DNA /atom protein komplekser var forberedt. Binding av STAT3 og c-Jun til AP-1-setet ble analysert ved immunoutfelling med anti-STAT3 og anti-AP-1-antistoffer, etterfulgt av PCR (A) og real-time PCR (B). C, MGC-803-celler ble behandlet med 10 uM isoproterenol for 0 eller 2,5 timer, henholdsvis. Atom ekstrakt ble utarbeidet med en kjernefysisk-cytosol Extraction Kit. β-tubulin og AP-2α ble analysert ved hjelp av Western blot for å undersøke separasjonen av cytoplasmiske og kjerneproteiner. C, cytosoliske proteiner; N, nukleære proteiner. D, 200 ug av de nukleære ekstrakter ble inkubert ved 4 ° C i 4 timer med biotinylerte oligonukleotider inneholdende AP-1-konsensussekvensen som tidligere koplet til Dynabeads M-280 i nærvær eller fravær av en, fem eller 15 gangers mengde av dobbelt -stranded oligonukleotid konkurrenter. Inkubasjon av de nukleære proteiner med dobbelt-trådede oligonukleotider inneholdende et mutert AP-1 området (Mut Oligo) eller ikke-spesifikke dobbelttrådede oligonukleotider (NS oligo) ble anvendt som kontroller. De protein /DNA-kompleksene ble separert med en Dynal magnet, og underkastet SDS-PAGE. STAT3 og c-Jun ble oppdaget av Western blot med anti-STAT3 og anti-c-Jun antistoffer. E og F, MGC-803 celler ble ko-transfektert med plasmidene PMMP-7mA og pcDNA3.1 /c-Jun eller STAT3C og luciferase aktiviteter ble analysert.
For ytterligere å karakterisere samspillet STAT3 /c-Jun med AP-1 stedet, utførte vi en DNA tilhørighet nedbør analysen. Etter MGC-803-celler ble behandlet med isoproterenol i 2,5 timer ble den kjernefysiske ekstrakt fremstilt og dens kvalitet ble undersøkt (fig. 5C). De biotinylerte oligonukleotider tilsvarende -74 til -52 region av MMP-7 promoter ble inkubert med 200 mikrogram av atom ekstrakter for rullegardin analyser. Streptavidin belagte magnetiske kuler ble anvendt for å felle ut biotinmerkede dobbelt-trådede oligonukleotider og tilknyttede DNA-bindende proteiner. Bindingen av de nukleære proteiner til biotinylerte oligonukleotider ble analysert i nærvær av en, fem eller 15 gangers mengde av dobbelt-trådet oligonukleotid konkurrenter inneholdende AP-1-konsensussekvenser. Inkubasjon av de nukleære proteiner med dobbelt-trådede oligonukleotider inneholdende et mutert AP-1 stedet eller ikke-spesifikke dobbelt-trådede oligonukleotider ble anvendt som kontroller. De resulterende DNA-proteinkomplekser ble oppløst ved SDS-PAGE, fulgt av Western-blot med anti-c-Jun og anti-STAT3 antistoffer. Foreningen av begge transkripsjonelle faktorer med oligonukleotider inneholdende AP-1-konsensussekvenser kunne klart påvises i de nukleære ekstrakter fra isoproterenol-stimulerte celler, men ikke fra ikke-stimulerte celler. Konkurranse med femten gangers mengde av konkurrentene helt avskaffet dannelsen av de biotinylerte DNA /proteinkomplekser (fig. 5D). Ingen binding av c-Jun og STAT3 enten de oligonukleotider som inneholder en mutert AP-1 område eller uspesifikke oligonukleotider ble påvist (Fig. 5D). Dette eksperimentet gir in vitro bevis for å bekrefte at STAT3 og c-Jun under catecholamine stimulering, kan fysisk samhandle og binde til AP-1 området for å oppnå trans av MMP-7 genet i magekreftceller.
Vi viste at isoproterenol -indusert MMP-7-promoteren aktivering ble ikke forstyrret av mutagenese av kjerne-sekvensene til alle tre STAT3 områder, noe som tyder på at STAT3 elementene ikke kan opptre i isoproterenol-indusert MMP-7 gentranskripsjon i magekreftceller. For å bekrefte rollen AP-1 element videre, plasmidet PMMP-7mA var co-transfektert inn MGC-803 celler med enten pcDNA3.1 /c-Jun eller STAT3C hhv. Interessant, mutasjon av AP-1-bindingssete grundig blokkert aktivering av MMP-7-promoteren i transfekterte celler som overuttrykker enten c-Jun eller STAT3C (fig. 5E og 5F), noe som indikerer at AP-1-området er en viktig regulerende element og den synergis regulering av isoproterenol-indusert MMP-7 uttrykk ved STAT3 og AP-en er avhengig av dette elementet.
β2-AR og MMP-7 ble colocalized i magekreft vev
overekspresjon av MMP-7 var ofte ved invasiv foran human magekreft og direkte knyttet til prognosen hos pasienter med magekreft. For å studere sammenhengen av β2-AR nivå med MMP-7 uttrykk i menneskelig magekreft, samlet vi fem magekreft vevsprøver og analyserte uttrykk for β2-AR og MMP-7 av immunhistokjemiske merking. Interessant, den sterke ekspresjon av β2-AR og MMP-7 dukket opp på samme region av tumor vev (fig. 6A), noe som tyder på et nært forhold mellom MMP-7 og β2-AR. For ytterligere å undersøke rollen til MMP-7 og β2-AR i den metastasering av magekreft, analyserte vi uttrykket MMP-7 og p-ARS i kreft, peri-kreft og metastatiske vev fra en pasient med gastrisk kreft. Som vist på fig. 6B, uttrykk for β1-AR, β2-AR og MMP-7 proteinnivået var høyere i kreftvev enn i peri-kreftvevet. Imidlertid ble det høyeste uttrykk for dem funnet i metastatisk vev. Videre MMP-7 mRNA ble også overuttrykt i metastatisk vev (Fig. 6C). Disse dataene sterkt antyder en nær sammenheng mellom MMP-7, β2-AR og metastasering av magekreft. Figur 6 β2-AR og MMP-7 ble overexpressed i mage kreft vev. A, fem gastrisk kreft vevsprøver ble oppsamlet. Ekspresjonen av β2-AR og MMP-7 ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi. B, uttrykket av MMP-7, β1-AR og β2-AR i kreft, peri-kreft og metastatisk vev ble analysert ved Western blot. C, nivået av MMP-7 mRNA i kreft, peri-kreft og metastatisk vev ble analysert ved real-time PCR.
Diskusjon
studien var basert på en hypotese om at psykososialt stress kan være en disponerende faktor i magekreft. Stress, angst og depresjon kan føre til komplekse fysiologiske og nevroendokrine endringer som påvirker flere systemer, inkludert fordøyelsessystemet. De kreftpasienter opplever ofte betydelig emosjonell støtte. Tilknytningen av fysiologisk stress med heving av mavesyresekresjon og magesmerter har lenge vært lagt merke til [46, 47]. Det har blitt rapportert at kronisk stress kan forverre magesår. I en fersk befolkningsbasert undersøkelse registrert 2014 personer ble stresset regnes som den mektigste risikofaktor i magekreft [48]. Resultatene fra eksperimentelle studier tyder på at økt aktivitet i det sympatiske nervesystemet kan utgjøre en primær mekanisme ved hvilken fysiologiske faktorer innvirkning genekspresjon i tumorer [49]. Til dags dato har de fleste studier som undersøker hvilke mekanismer som kobler stress og kreft progresjon vært knyttet til indirekte virkninger gjennom immunsuppresjon [8]. I flere nyere studier, ble stress relaterte proteiner og stier knyttet direkte til atferdsendring av ondartede celler [10-17]. Det er imidlertid en sparsommelige data opptegning de molekylære mekanismer som er involvert.
I den foreliggende undersøkelse har vi identifisert øket MMP-7-ekspresjon i magekreftcellelinjer som reaksjon på stimuleringen av stressrelatert hormon katekolaminer. Det er anslått at konsentrasjonen av katekolaminer kan være over 100 ganger høyere i svulsten mikromiljø enn i normalt vev og sirkulerende plasma. MMP-7 er unik i sin begrensede ekspresjon i tumorceller, noe som indikerer at MMP-7 uttrykk er i et tumor-assosiert måte. Vi la merke til at isoproterenol stimulering betydelig oppregulert MMP-7 uttrykk både mRNA og proteinnivåer i mage kreftceller. β2-AR antigonist effektivt opphevet isoproterenol-indusert MMP-7 ekspresjon oppregulering, noe som tyder på at β2-AR-mediert reaksjonsvei er involvert i prosessen.
MMP-7 uttrykk er kontrollert på nivået av transkripsjon. Vår tidligere studie viste at heregulin-β-indusert MMP-7 uttrykk ble regulert av HER2-mediert STAT3 og AP-en aktivering i humane brystkreftcellelinjer [42, 43]. Vi identifiserte også de funksjonelle AP-1 og STAT3 bindingssetene på den første 350 bp av transkripsjonsstartsetet i human MMP-7-promoteren [42, 43]. En annen studie viste at FGF-2 kan direkte oppregulere MMP-7-genekspresjon i humane tumorcellelinjer og umbilikalvene endotelceller via AP-1 og STAT3 [50]. Samle bevis støtter sterkt at STAT3 fungerer som et sentralt regulerings knutepunktet hvor flere onkogene signalveier konvergerer [51]. Avvikende aktivering av STAT3 har vist seg å spille en avgjørende rolle i magekreft utvikling [52, 53]. En fersk studie og våre data avdekket foreningen av catacholamine med STAT3 aktivering i eggstokkene og brystkreftceller [12, 13]. I denne studien, viste vi at isoproterenol stimulering fremtredende indusert aktivering av STAT3 i magekreftceller, impliserer at katekolaminer kan akselerere ondartet progresjon av magekreft. Vår upubliserte data viste seg også at isoproterenol stimulert ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 i magekreftceller hovedsakelig gjennom aktivering STAT3. Men i denne studien, har vi funnet at AP-1 viste en større effekt enn STAT3 i isoproterenol-indusert MMP-7 gentranskripsjon og STAT3 elementene var ikke-funksjonelle, som tie STAT3 ekspresjon var ikke effektive i å hindre isoproterenol-indusert MMP- 7 ekspresjon og mutagenese av tre STAT3 bindingssetene mislyktes i å undertrykke den transaktivering av MMP-7-promoteren som reaksjon på isoproterenol induksjon. I motsetning til dette, AP-1 stedet, og c-Jun reguleres denne prosessen. Interessant nok ble STAT3 og c-Jun funnet å binde til enkelt AP-1-området i MMP-7-promotor samtidig, impliserer at samspillet mellom begge transkripsjonelle faktorer i den ene bindingssete er ansvarlig for isoproterenol-stimulert MMP-7-ekspresjon i magekreft celler. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Proteomikk endring i gastic adenokarsinomer fra japansk patients
• En pasient med magekreft med peritoneal karsinomatose behandlet med intraperitoneal kjemoterapi som overlevde mer enn 5 år mottar gjentatte laparoskopiske undersøkelser: en sak report