Catecolamina up-regula MMP-7 expressão ativando AP-1 e STAT3 no câncer gástrico

Catecolamina up-regula MMP-7 expressão ativando AP-1 e STAT3 no câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
Estresse, ansiedade e depressão pode causar complexas alterações fisiológicas e neuroendócrinas, resultando em aumento do nível de hormônio do estresse relacionado catecolaminas, o que pode constituir um mecanismo primário pelo qual a expressão do gene fatores fisiológicos impacto nos tumores. No presente estudo, investigamos os efeitos da estimulação de catecolaminas na MMP-7 de expressão em células cancerosas gástricas e elucidaram os mecanismos moleculares da up-regulação da MMP-7 nível de catecolaminas através de uma via de sinalização adrenérgica.
Resultados
o aumento da expressão de MMP-7 foi identificada em ambos os níveis de proteína e ARNm em células gástricas cancerosas em resposta à estimulação de isoproterenol. β2-AR antigonist eficazmente revogada expressão induzido por isoproterenol MMP-7. A activação da STAT3 e AP-1 foi induzida por estimulação proeminente isoproterenol e AP-1 apresentou maior eficácia do que a STAT3 em MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol. A mutagénese de três sítios de ligação de STAT3 em MMP-7 promotor não conseguiram reprimir a transactivação de MMP-7 e o promotor da STAT3 silenciar a expressão não foi eficaz na prevenção de expressão induzido por isoproterenol MMP-7. No entanto, induzido por isoproterenol MMP-7 actividades promotoras foram completamente desaparecido quando o sítio AP-1 foi mutado. STAT3 e c-Jun pode interagir fisicamente e ligam-se a sítio AP-1, implicando que a interacção de ambos os factores de transcrição no local AP-1 é responsável para a MMP-7 de expressão estimulada por isoproterenol em células de cancro gástrico. A expressão de MMP-7 em tecidos de câncer gástrico foi encontrado para ser no local onde β2-AR foi overexpressed e os níveis de MMP-7 e β2-AR foram as mais altas no locus metastática do câncer gástrico.
Conclusões
Up-regulação da MMP 7-expressão através da via de sinalização β2-AR mediada está envolvido na invasão e metástase de câncer gástrico.
Fundo
o câncer gástrico é a segunda principal causa mais comum de morte por câncer relacionados, com cerca de 700 000 mortes por ano [1, 2]. Um dos fatores importantes na patogênese do câncer gástrico é a infecção crónica com Helicobacter pylori
[3]. No entanto, a maioria dos indivíduos infectados não desenvolvem doença maligna e o resultado da infecção é dependente hospedeira, do meio ambiente e outros factores [4]. Há evidências crescentes de apoiar o papel do estresse psicológico no aparecimento do câncer gástrico e desenvolvimento [5]. Vários estudos epidemiológicos têm demonstrado que fatores de estresse psicológicos ou comportamentais podem acelerar a progressão do cancro gástrico [6, 7]. No entanto, o mecanismo preciso pelo qual o stress psicológico actua na progressão do cancro gástrico é pouco claro.
Stress inicia uma resposta do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), resultando no aumento do nível de catecolaminas [8, 9]. Vários estudos têm demonstrado que a estimulação da catecolamina interferindo com bio-comportamentos de células tumorais directamente, principalmente através de receptores p2-adrenérgicos (β2-Ar) mediado por via de sinalização [10-14]. Observações recentes apontam para um mecanismo potencial para a progressão do ovário, os cancros da nasofaringe e pancreáticas indicam que catecolamina pode modular a expressão das metaloproteinases da matriz (MMP) -2 e MMP-9 por células do estroma e de tumor [15-17]. Isto levanta uma questão interessante que o stress psicológico pode desempenhar um papel no desenvolvimento e progressão do cancro gástrico, através da modulação da expressão de MMP-AR através β2 via de sinalização mediada.
Linhas de evidências acumuladas mostram que a MMP-7 está envolvido na invasão e metástases de câncer gástrico [18-24]. MMP-7 é a mais pequena membro conhecido da família de MMP e possui a mais elevada de matriz extracelular (ECM) -degradative actividade contra uma variedade de componentes da matriz extracelular, incluindo a elastina, gelatina, colagénio tipo IV, f ibronectina, vitronectina, laminina, entactina, agrecano e proteoglicanos , entre as MMPs [25, 26]. Ela também é capaz de desencadear a activação de uma cascata de MMP [27]. Uma característica única da MMP-7 é a sua expressão restrita predominantemente em células epiteliais do tecido glandular incluindo mamário normal, fígado, pâncreas, próstata e as glândulas peribrônquicas [28].
Verificou-se que a MMP-7 é sobre-expresso no invasiva cancros dos órgãos digestivos, tais como esofágica [29], gástrica [30], pancreático [31, 32], colo-rectal [33-35], fígado [36] e outros órgãos. O nível de expressão de MMP-7 está significativamente associado com a transformação de células tumorais, fenótipos de cancros agressivos e fase de progressão tumoral [37], especialmente em tumores do tracto gastrointestinal. A sobre-expressão de MMP-7 é frequentemente identificado em lesões gástricas pré-malignas e carcinomas mais gástricas [18-21, 24, 38]. Uma correlação positiva de MMP-7 nível com a invasão do tumor na parede gástrica, metástase linfonodal, disseminação peritoneal e sobrevivência de pacientes com câncer gástrico tem sido documentado em vários estudos [23]. MMP-7 tem sido reconhecido como um importante mediador da progressão do cancro e considerado como um marcador prognóstico para cancro gástrico independente primária. No entanto, os mecanismos moleculares possíveis de MMP-7 superexpressão em câncer gástrico ainda são largamente inexplorado.
No presente estudo, investigamos os efeitos da estimulação de catecolaminas na MMP-7 expressão em linhas celulares de cancro gástrico e elucidou os mecanismos moleculares de a regulação da MMP-7 por nível de catecolaminas através de uma via de sinalização adrenérgico.

resultados da estimulação isoproterenol-regula a expressão de MMP-7
foi mostrado que a expressão de MMP-9 em ovário câncer foi significativamente melhorada no tumor macrófagos associados nos pacientes com sintomas depressivos elevados [15] e catecolaminas potenciado expressão induzida por LPS de MMPs em monócitos humanos [39]. A fim de investigar se associados de catecolamina com a expressão de MMP-7 em células de cancro gástrico, que inspeccionado em primeiro lugar os efeitos de β-AR agonista isoproterenol na transcrição do gene de MMP-7 em linhas celulares de cancro gástrico HGC-27 e MGC-803 . Foram seleccionadas as doses de catecolaminas utilizadas no presente estudo para reflectir as condições fisiológicas desta hormona em tumores [40, 41]. A análise de PCR semi-quantitativa e em tempo real mostraram que a MMP-7 de expressão a nível da transcrição foi baixa em linhas celulares de cancro gástrico. Quando as células foram expostas a 10? M de isoproterenol no meio isento de soro durante 12 h, a MMP-7 níveis de ARNm foram notavelmente aumentada em ambas as linhas celulares (Fig. 1A e 1B). Para determinar se o aumento do nível de ARNm de MMP-7 leva a uma aumento semelhante na produção de proteína, a expressão de MMP-7 em HGC-27 e MGC-803 células foi analisada por Western blot. Como mostrado na Fig. 1C, a estimulação isoproterenol resultou num significativo aumento da regulação da MMP-7 de expressão em HGC-27 e MGC-803 células. β2-AR, que medeia a maioria dos efeitos de catecolaminas, foi identificado no cancro da mama e cancro do ovário células [11, 13]. Para esclarecer o papel da sinalização β2-AR mediada por MMP-7 de expressão, utilizou-se um propranolol antagonista β-AR e antagonista β2-AR selectivo ICI-118551 para testar se o efeito de isoproterenol sobre a MMP-7 de expressão pode ser inibida. Os nossos dados mostraram que o tratamento com propranolol e ICI-118551 bloqueou eficientemente a expressão de MMP-7 estimulada por isoproterenol (Fig. 1D, painel superior). Em seguida, examinou se β2-AR é expresso em células de cancro gástrico. Os dados mostraram que a expressão de β2-AR era detectável em três linhas de células de cancro gástrico incluindo HGC-27, MGC-803 e MKN-45 (Fig. 1D, painel inferior). Estes dados indicaram que o isoproterenol estimulou a produção de MMP-7 em linhas celulares de cancro gástrico e que a sobre-regulação da MMP-7 de expressão por isoproterenol foi provocado principalmente por uma sinalização mediada β2-AR. Figura estimulação um Isoproterenol-regula a expressão de MMP-7. A e células B, HGC-27 e MGC-803 foram incubadas durante a noite em meio isento de soro e depois tratou-se com 2 ou 10? M de isoproterenol, respectivamente. A expressão da MMP-7 mRNA foi analisada por RT-PCR (A) e PCR em tempo real (B). C, células HGC-27 foram estimuladas com células isoproterenol 0, 1 ou 2 ^ M e MGC-803 com 0, 5 e 10? M de isoproterenol, após privação de soro. A expressão da proteína MMP-7 foi analisado por Western blot. D, células MGC-803 foram tratadas com 10? M de propranolol ou 1 uM ICI-118551 durante 1 h e, em seguida, com 10? M de isoproterenol. MMP-7 de expressão foi analisada por Western blot (painel superior); a expressão de β2-AR em MGC-803, MKN-45 e HGC-27 células foi detectada por transferência de Western (painel inferior).
Isoproterenol-regula a actividade do promotor da MMP-7 e activa STAT3 e AP-1
Para explorar os mecanismos moleculares pelos quais catecolamina up-regula MMP-7 de expressão, determinou-se em primeiro lugar se a estimulação isoproterenol pode afetar diretamente a atividade do promotor de MMP-7. Construiu-se um plasmídeo PMMP-7 contendo um gene repórter de luciferase dirigido por uma 340 pb de MMP-7 fragmento do promotor (-296 - 44) (Fig. 2A). células MGC-803 foram transfectadas com PMMP-7 e o efeito de isoproterenol na MMP-7, a actividade do promotor foi avaliada por ensaios de luciferase. Como mostrado na Fig. 2B, após a estimulação de isoproterenol durante 1 h, as actividades da luciferase e começou a subir gradualmente aumentada. Às 6 horas após a exposição, MMP-7 actividades promotoras mostraram um aumento ao longo dupla em comparação com as células de controlo não estimuladas, o que sugere que a estimulação de isoproterenol podia induzir directamente a transactivação do promotor de MMP-7. Figura 2 Isoproterenol-regula a actividade do promotor da MMP-7 e activa STAT3 e AP-1. A, representação esquemática do plasmídeo PMMP-7 contendo um gene repórter de luciferase dirigido por uma 340 pb de MMP-7 fragmento do promotor. SBE, local STAT3; ABE, AP-1 site. B, células MGC-803 foram co-transfectadas com PMMP-7 e pRL-TK. Depois de transfecção durante 48 h, as células foram incubadas em meio isento de soro durante mais 24 h e em seguida estimuladas com 10? M de isoproterenol, durante 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 horas, respectivamente. MMP-7 actividades promotoras foram avaliadas por ensaios de luciferase. C e D, células MGC-803 foram tratadas com 10? M de propranolol durante 1 h e, em seguida, com 10? M de isoproterenol, durante 0, 15, 30, 60, 120 ou 180 minutos, respectivamente. A fosforilação da STAT3 e c-Jun foi analisado por Western blot com anticorpos anti-STAT3-fósforo e anticorpos policlonais-fósforo-c-jun anti-coelho. ISO, isoproterenol.
Em nosso estudo anterior [42, 43], identificamos um local de ligação AP-1 na posição -67 a -61 e três locais de ligação STAT3 nas posições -137 a -122, -168 a -159 e -255 a -245 no promotor da MMP-7 (Fig. 2A). Demonstramos ainda que a AP-1 e STAT3 obrigado a AP-1 e um do STAT3 (-137 a -122) locais, regulando positivamente a MMP-7 de transcrição. Um estudo recente mostrou que a catecolamina tem o potencial para activar a STAT3. Para investigar se a catecolamina estimula a MMP-7 de transcrição através da activação da STAT3 e AP-1, foi analisada a fosforilação da STAT3 e C-junho FIG. 2C mostraram que isoproterenol causou a fosforilação da STAT3 depois de 30 minutos de estimulação, atingindo um pico a 2 h. Embora a activação de c-Jun foi lento, iniciado em 60 min, uma fosforilação máxima foi alcançada em 2 h, bem como (Fig. 2D). Ela significou que a estimulação isoproterenol produziu um sinal β2-AR mediada que desencadeou a activação da STAT3 e AP-1.
Elemento STAT3 em MMP-7 promotor não é obrigatório e STAT3 não suficiente para a MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol
a fim de determinar se os elementos STAT3 são funcionais em MMP-7 transcrição do gene induzido por isoproterenol, que primeiro se comprometeu a mutagénese de três locais de STAT3 por meio de mutação do núcleo sequências de locais de STAT3 com base em PMMP-7 (Fig. 3A) e construído o plasmídeo PMMP-7ms. O plasmídeo foi transfectado em células MGC-803. Depois de transfecção durante 48 h, as células foram incubadas em meio isento de soro durante a noite e em seguida estimuladas com 10? M de isoproterenol, durante 6 h. Nós notado, surpreendentemente, que a mutação de todos os três sítios de ligação de STAT3 não teve nenhum efeito proeminente na transactivação de MMP-7 promotor. Como mostrado na Fig. 3b, as actividades da luciferase foram gradualmente aumentada e aproximou-se um pico em 6 h após a exposição. O resultado foi muito semelhante ao observado nas células transfectadas com o promotor de tipo selvagem a MMP-7. Para identificar o papel da STAT3 neste evento, HGC-27 e MGC-803 células foram transfectadas com pGeneSuppressor expressando shRNA alvo STAT3 e HGC-27 /STAT3-sh e MGC-803 /células STAT3-sh estabelecida. FIG. 3C mostram que a expressão da STAT3 foi eficientemente suprimidos em ambas as células. Coerentes com os dados acima, MMP-7 actividades promotoras induzida por isoproterenol pareceu não ser prejudicada significativamente em MGC-803 /células STAT3-sh (Fig. 3D). Além disso, a MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol em ambos os níveis de proteína e ARNm não foi afectada pelo silenciamento importante expressão STAT3, como demonstrado por RT-PCR, PCR em tempo real e Western blot (Fig. 3E, F e 3G). Os resultados sugeriram que a STAT3 no elemento de MMP-7 promotor não é obrigatório e STAT3 não suficiente para a MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol. Figura 3 elemento de STAT3 em MMP-7 promotor não é obrigatório e STAT3 não suficiente para a MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol. A, representação esquemática do plasmídeo PMMP-7ms contendo três locais mutados STAT3 nas posições -255 a -245, -168 a -159 e -137 a -122. B, células MGC-803 foram co-transfectadas com PMMP-7 ms e pRL-TK, fome, e em seguida estimuladas com 10? M de isoproterenol, durante 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 horas, respectivamente. MMP-7 actividades promotoras foram avaliadas por ensaios de luciferase. C, HGC-27 e MGC-803 células foram estavelmente transfectadas com pGeneSuppressor expressar STAT3 shRNA. A expressão de STAT3 foi analisada por Western blot no HGC-27 MGC-803 células /STAT3-sh /STAT3-sh e. D, MMP-7 actividades promotoras foram ensaiadas em MGC-803 células /STAT3-SH depois da estimulação com 10 uM de isoproterenol para 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 horas, respectivamente. E a G, HGC-27 /células /STAT3-SH-803 MGC STAT3-sh e foram estimuladas com 2 mM ou 10 mM isoproterenol, respectivamente. A expressão da MMP-7 foi analisado por RT-PCR (E), PCR em tempo real (F) e Western blot (L).
AP-1 desempenha um papel crítico na MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol
Os dados acima foi inesperado, uma vez que STAT3 poderia ser ativada por estimulação isoproterenol. Além disso, no nosso estudo anterior [42, 43], foi demonstrado que a STAT3 e AP-1 participa na regulação do Her2 de sinalização mediada por expressão de MMP-7 em células de cancro da mama. Em seguida, procurou investigar se AP-1 influências isoproterenol induzida por MMP-7 de expressão. células MGC-803 foram transfectadas com o plasmídeo PMMP-7mA contendo uma mutação sítio AP-1 na posição -67 a -61 em actividades de MMP-7 e promotor de luciferase medida (Fig. 4A). Surpreendentemente, MMP-7 actividades promotoras induzido por isoproterenol foram desaparecido completamente em todos os pontos de tempo (Fig. 4B), sugerindo que o local de AP-1 foi crucial para a MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol. Figura 4 AP-1 desempenha um papel crítico na MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol. A, representação esquemática do plasmídeo PMMP-7mA contendo um local AP-1 mutado na posição -67 a -61. B, células MGC-803 foram co-transfectadas com PMMP-7mA e pRL-TK, fome e em seguida estimuladas com 10? M de isoproterenol, durante 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 horas, respectivamente. MMP-7 actividades promotoras foram avaliadas por ensaios de luciferase. C, células MGC-803 co-transfectadas com TAM67, PMMP-7 e pRL-TK foram induzidos com 10? M de isoproterenol. MMP-7 actividades promotoras foram analisados ​​por ensaios de luciferase. D, células MGC-803 que expressam estavelmente foram estabelecidos shRNA segmentação de c-Jun (MGC-803 /C-Jun-SH) e a expressão de c-Jun foi analisada por Western blot. E, MMP-7 actividades promotoras foram ensaiadas em MGC-803 células /c-Jun-SH depois da estimulação com 10 uM de isoproterenol para 0, 1, 2, 3, 6 ou 9 horas, respectivamente. F, MMP-7 de expressão foi analisada em MGC-803 células /c-Jun-SH depois da estimulação com 0, 2 ou 10? M de isoproterenol, respectivamente. L, os plasmídeos que expressam c-Jun e STAT3C foram transfectados em células MGC-803 /C-Jun-SH, respectivamente. MMP-7 actividades promotoras foram analisados ​​por ensaios de luciferase.
Para confirmar a MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol é controlado por AP-1, que, em seguida examinado se a transactivação de MMP-7 promotor induzido por isoproterenol podia ser inibida por um dominante negativa mutante c-Jun TAM67, que não possui o domínio 5'-transactivação de c-Jun, mas possui um funcional fecho de leucina c-jun e domínio de ligação ao ADN. Após a transfecção transiente com TAM67 em células MGC-803, a transactivação induzida por isoproterenol de MMP-7 promotora foi analisada por ensaios de luciferase. Como mostrado na Fig. 4C, a expressão do dominante negativo de c-Jun apresentou um impacto de amortecimento visível sobre as actividades MMP-7 de promotor. Para verificar ainda mais o papel crítico de AP-1, testámos se a bloquear expresso endogenamente c-Jun pode inibir a expressão de MMP-7. As células MGC-803 /C-Jun-SH foram estabelecidos (Fig. 4D) e MMP-7 actividades promotoras analisados ​​por ensaios de luciferase. Os dados na Fig. 4E mostram que as actividades de MMP-7 promotor foram notavelmente reduzida por knock-down de expressão de c-junho A análise por Western blot demonstrou também que a MMP-7 de expressão induzida por isoprotereol foi marcadamente diminuída em MGC-803 células /c-Jun-SH, ao passo que uma substancialmente grande quantidade de proteína de MMP-7 foi detectada nas células parentais, após a estimulação de isoproterenol (fig. 4F). Notavelmente, a sobre-expressão de c-Jun exógena restaurado dramaticamente a MMP-7 actividades promotoras em 803 MGC células /c-Jun-SH, mas constitutivamente activada STAT3 STAT3C mutante única promotor minimamente activada MMP-7, quando a expressão de c-Jun foi silenciados (Fig . 4G). Estes dados revelou que a AP-1 dominada expressão induzido por isoproterenol MMP-7.
C-jun e STAT3 sinergicamente regular a expressão de MMP-7 em resposta à estimulação de isoproterenol
Cooperação da STAT3 e c-jun na regulação de uma variedade de a transcrição de genes foi relatada. O nosso estudo anterior demonstra que a activação de MMP-9 promotor é dependente da interacção da STAT3 e AP-1 [44]. Como mencionado acima, a estimulação induzida por isoproterenol a activação da STAT3 e AP-1 ao mesmo tempo. Especulamos que Stat3 e AP-1 pode sinergicamente participar na regulação da MMP-7 expressão estimulada por isoproterenol. Foi indicado que a AP-1 coopera com a STAT3 em interleucina transactivação induzida por 6 do elemento de resposta IL-6 na ausência de ADN directa de ligação de AP-1 [45]. Ele levou-nos a testar a possível ligação cooperativa de AP-1 /STAT3 ao site da AP-1.
Para determinar se que STAT3 e AP-1 pode ser recrutado para o site da AP-1 em MMP-7 promotor in vivo , células MGC-803 foram estimuladas com 10 pM de isoproterenol para 0, 2,5 ou 4 horas, respectivamente. O ADN da cromatina /complexos de proteínas nucleares foram preparados e ligação da STAT3 e de c-Jun ao sítio AP-1 foi analisada por ensaios de chip. O produto de PCR para a amplificação seleccionado estende-se desde -76 a 165 região de albergando o sítio AP-1 no promotor de MMP-7. A imunoprecipitação com anticorpos anti-STAT3 e anti-c-Jun anticorpos, seguido de PCR produziu uma banda de 241 pb esperado a partir dos precipitantes após estimulação isoproterenol durante 2,5 h. As intensidades dessas bandas foram enfraquecidos após 4 h. Em contraste, em células de controlo não estimuladas não ligação da STAT3 para este local foi observada e a ligação de c-Jun dificilmente detectável. Nenhuma banda foi amplificado por imunoprecipitação utilizando IgG de coelho (Fig. 5A). Os dados foram confirmados por PCR em tempo real (Fig. 5B). Estes dados demonstram que a associação da STAT3 e de c-Jun com MMP-7 in vivo promotor
foi específico e que a estimulação induzida por isoproterenol ligação da STAT3 /c-Jun ao elemento AP-1. A Figura 5 c-Jun e STAT3 sinergicamente regular a MMP-7 de expressão. A e B, células MGC-803 foram estimuladas com 10 pM de isoproterenol para 0, 2,5 ou 4 horas, respectivamente. /Foram preparados do DNA cromatina complexos de proteínas nucleares. A ligação de STAT3 e de c-Jun ao sítio AP-1 foi analisada por imunoprecipitação com o anti-STAT3 e AP-1 anti-anticorpos, seguido de RCP (A) e PCR em tempo real (B). C, células MGC-803 foram tratadas com 10? M de isoproterenol para 0 ou 2,5 horas, respectivamente. O extracto nuclear foi preparado com um Kit Nuclear-citosol Extraction. β-tubulina e AP-2α foram analisados ​​por Western blot para examinar a separação de proteínas citoplasmáticas e nucleares. C, proteínas citosólicas; N, proteínas nucleares. D, 200 mg dos extractos nucleares foi incubada a 4 ° C durante 4 h, com os oligonucleótidos biotinilados contendo AP-1 sequência de consenso, previamente acoplada a Dynabeads M-280, na presença ou ausência de um, cinco ou 15 quantidade dobra da dupla concorrentes de oligonucleotídeos -cordas. A incubação das proteínas nucleares com os oligonucleótidos de cadeia dupla contendo uma mutação sítio AP-1 (Mut Oligo) ou oligonucleótidos de cadeia dupla não específicos (NS) Oligo foi usado como controle. Os complexos de proteína /ADN foram separadas com um íman Dynal, e sujeitos a SDS-PAGE. STAT3 e c-Jun foram detectadas por Western blot com anticorpos anti-STAT3 e anticorpos anti-c-Jun. E e F, MGC-803 células foram co-transf ectadas com os plasmídeos PMMP-7mA e pCDNA3.1 /c-Jun ou actividades STAT3C e luciferase foram ensaiadas.
Para caracterizar ainda mais a interacção da STAT3 /c-Jun com o AP-1 local, foi realizado um ensaio de precipitação afinidade DNA. Depois de células MGC-803 foram tratadas com isoproterenol durante 2,5 h, o extracto nuclear foi preparado e a sua qualidade foi avaliada (Fig. 5C). Os oligonucleótidos biotinilados correspondentes a -74 a -52 região de MMP-7 promotor foram incubadas com 200 ug de os extractos nucleares para as análises pendentes. As esferas magnéticas revestidas com estreptavidina foram usadas para precipitar os oligonucleótidos de cadeia dupla marcado com biotina e proteínas de ligação de ADN associados. A ligação de proteínas nucleares aos oligonucleótidos biotinilados foi analisada na presença de um, cinco, ou 15 vezes de montante concorrentes oligonucleótido de cadeia dupla que contêm sequências de consenso AP-1. A incubação das proteínas nucleares com os oligonucleótidos de cadeia dupla contendo um mutante de AP-1 site ou oligonucleótidos de cadeia dupla não específica foi usado como controle. Os complexos de ADN-proteína resultantes foram resolvidos por SDS-PAGE, seguido por Western blot com anticorpos anti-STAT3 anti-c-Jun e. A associação dos dois factores de transcrição com os oligonucleótidos que contêm sequências de consenso AP-1 pode ser claramente detectada nos extractos nucleares a partir de células estimuladas com isoproterenol, mas não a partir de células não estimuladas. Competição com quinze vezes montante dos concorrentes totalmente abolida a formação dos complexos de ADN /proteínas biotiniladas (Fig. 5D). Nenhuma ligação de c-jun e STAT3, quer os oligonucleótidos que contêm uma mutação sítio AP-1 ou oligonucleótidos não específica foi detectada (Fig. 5D). Esta experiência fornece em evidência in vitro para confirmar que a STAT3 e c-Jun, sob estimulação da catecolamina, pode interagir fisicamente e ligam-se ao site do AP-1 para atingir a transactivação de MMP-7 de genes em células de cancro gástrico.
Nós mostramos que o isoproterenol induzida por MMP-7 activação do promotor não foi perturbada pela mutagénese do núcleo sequências de todos os três locais de STAT3, sugerindo que os elementos de STAT3 pode não actuar de MMP-7 transcrição do gene induzido por isoproterenol em células de cancro gástrico. Para verificar ainda mais o papel do AP-1 elemento, o plasmídeo PMMP-7mA foi co-transfectado em células MGC-803 quer com pCDNA3.1 /c-Jun ou STAT3C, respectivamente. Curiosamente, a mutação de AP-1 local de ligação completamente bloqueado a activação de MMP-7 promotora nas células transf ectadas que sobre-expressam quer de c-Jun ou STAT3C (Fig. 5E e 5F), indicando que o sítio AP-1 é um elemento regulador importante e a regulação sinérgico induzido por isoproterenol de MMP-7 de expressão por STAT3 e AP-1 baseia-se neste elemento.
β2-AR e MMP-7 foram co-localizada em tecidos de cancro gástrico
a sobre-expressão da MMP-7 foi frequentemente na frente invasiva do câncer gástrico humano e directamente relacionado com o prognóstico em pacientes com câncer gástrico. Para estudar a correlação de nível β2-AR com MMP-7 de expressão no cancro gástrico humano, foram coletadas cinco amostras de tecido de câncer gástrico e analisou a expressão de β2-AR e MMP-7 por imunohistoquímica. Curiosamente, a expressão forte de β2-AR e MMP-7 surgiu na mesma região dos tecidos do tumor (Fig. 6A), o que sugere uma relação íntima entre o MMP-7 e β2-AR. Para investigar ainda mais o papel da MMP-7 e β2-AR na metástase do cancro gástrico, analisou-se a expressão de MMP-7 e p-ARs nos tecidos cancerosos, peri-cancerosas e metastáticas a partir de um paciente com cancro gástrico. Como mostrado na Fig. 6B, a expressão de β1-AR, AR-β2 e MMP-7 em nível de proteína foi maior no tecido canceroso do que no tecido peri-cancerosas. No entanto, a expressão mais elevada deles foi encontrada no tecido metastático. Além disso, a MMP-7 de mRNA também foi sobre-expresso em tecidos metastáticos (Fig. 6C). Estes dados implicam fortemente uma ligação estreita entre MMP-7, β2-AR e metástase de câncer gástrico. Figura 6 β2-AR e MMP-7 foram sobre-expressos em tecidos de cancro gástrico. A, cinco amostras de tecido de câncer gástrico foram recolhidos. A expressão de β2-AR e MMP-7 foi analisada por imuno-histoquímica. B, a expressão de MMP-7, β1-AR e β2-Ar nos tecidos cancerosos, peri-cancerosas e metastáticos foi analisada por Western blot. C, o nível de MMP-7 mRNA nos tecidos cancerosos, peri-cancerosas e metastáticos foi analisada por PCR em tempo real.
Discussão
O presente estudo baseou-se na hipótese de que o estresse psicossocial pode ser um fator predisponente no câncer gástrico. O stress, a ansiedade e a depressão pode causar complexas alterações fisiológicas e neuroendócrinas que influenciam vários sistemas, incluindo o sistema digestivo. Os pacientes de câncer muitas vezes experimentam sofrimento emocional substancial. A associação de stress fisiológico com elevação da secreção de ácido gástrico e estômago tem sido notado [46, 47]. Tem sido relatado que o estresse crônico pode agravar úlceras estomacais. Em uma recente pesquisa de base populacional inscritos 2014 indivíduos, o estresse foi considerado como o fator de risco mais potente no câncer gástrico [48]. Os resultados de estudos experimentais sugerem que o aumento da atividade do sistema nervoso simpático pode constituir um mecanismo primário pelo qual a expressão do gene fatores fisiológicos impacto nos tumores [49]. Até à data, a maioria dos estudos que investigam os mecanismos que ligam a progressão estresse e câncer tem sido relacionado a efeitos indiretos através da imunossupressão [8]. Em vários estudos recentes, proteínas e vias de estresse relacionados foram ligados diretamente à alteração de comportamento de células malignas [10-17]. No entanto, há uma escassez de dados que delineiam os mecanismos moleculares envolvidos.
No presente estudo, nós identificamos aumentada de MMP-7 de expressão em linhas celulares de cancro gástrico em resposta à estimulação da hormona relacionada com o stress catecolamina. Estima-se que a concentração de catecolamina pode ser mais de 100 vezes maior no microambiente do tumor do que em tecidos normais e em circulação no plasma. MMP-7 é único na sua expressão restrita em células tumorais, o que indica que a MMP-7 de expressão é de uma forma associada ao tumor. Percebemos que a estimulação isoproterenol significativamente up-regulada MMP-7 de expressão em ambos os níveis de proteína em células cancerosas gástricas mRNA e. β2-AR antigonist eficazmente revogada a MMP-7 de expressão induzido por isoproterenol up-regulation, sugerindo que a via mediada por β2-AR está envolvido no processo.
MMP-7 de expressão é firmemente controlada ao nível da transcrição. Nosso estudo anterior demonstrou que induziu-heregulina-β expressão de MMP-7 foi regulamentada pelo STAT3 HER2-mediada e AP-1 ativação em linhas celulares de cancro da mama humano [42, 43]. Foram também identificados os locais de ligação AP-1 funcionais e STAT3 no primeiro 350 bp do sítio de iniciação da transcrição no promotor de MMP-7 humana [42, 43]. Outro estudo indicou que o FGF-2 pode regular positivamente directamente a MMP-7 de expressão de genes em linhas de células de tumores humanos e de células endoteliais da veia umbilical através de AP-1 e STAT3 [50]. Evidências acumuladas apoia fortemente que STAT3 serve como um nó regulatório central no qual múltiplas vias de sinalização oncogénica convergir [51]. activação aberrante da STAT3 foi provado que desempenham um papel crítico no desenvolvimento do cancro gástrico [52, 53]. Um estudo recente e nossos dados revelou a associação de catacholamine com a ativação do STAT3 em células de câncer de ovário e de mama [12, 13]. No presente estudo, foi demonstrado que a estimulação proeminente isoproterenol induziu a activação da STAT3 em células de cancro gástrico, implicando que catecolamina pode acelerar a progressão maligna do cancro gástrico. Os nossos dados não publicados também provou que isoproterenol estimulou a expressão de MMP-2 e MMP-9 em células de cancro gástrico, principalmente através da activação da STAT3. No entanto, neste estudo, verificou-se que o AP-1 apresentou maior eficácia do que a STAT3 em MMP-7 transcrição do gene induzido por isoproterenol e os elementos da STAT3 foram não-funcional, como silenciamento expressão STAT3 não foi eficaz na prevenção da MMP induzida por isoproterenol 7 expressão e de mutagénese de três sítios de ligação de STAT3 não conseguiram reprimir a transactivação de MMP-7 promotor em resposta à indução de isoproterenol. Em contraste, o local de AP-1 e c-Jun regido deste processo. Curiosamente, STAT3 e c-Jun foram encontrados para se ligarem ao local único AP-1 em MMP-7 promotor simultaneamente, o que implica que a interacção de dois factores de transcrição em um sítio de ligação é responsável para a MMP-7 de expressão estimulada por isoproterenol em cancro gástrico células. Nós demonstramos que a STAT3 e AP-1 são importantes reguladores transcricionais de MMP-7 e MMP-9 em células de cancro da mama humano anteriormente e STAT3 e AP-1 exercer funções de regulação transcricional por ligação aos seus respectivos elementos de [42-44]. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

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• Um paciente com câncer gástrico com carcinomatose peritoneal tratados com quimioterapia intraperitoneal que sobreviveram mais de 5 anos recebendo exames laparoscópicos repetidas: um caso report