Katecholaminų iki-reguliuoja MMP-7 išraišką aktyvuojant AP-1 ir stat3 skrandžio vėžio

Katecholaminų iki-reguliuoja MMP-7 išraišką aktyvuojant AP-1 ir stat3 skrandžio vėžio
Anotacija
fone
stresas, nerimas ir depresija gali sukelti sudėtingus fiziologinius ir neuroendokrininiais pokyčius, todėl padidėja streso lygį susijęs hormonas katecholaminų, kurie gali būti pagrindinis mechanizmas, pagal kurį fiziologinių veiksnių poveikį genų ekspresija navikų. Šiame tyrime mes ištyrė katecholaminų stimuliacijos poveikį MMP-7 raiškos skrandžio vėžio ląsteles ir nušvietė molekulinius mechanizmus up-reguliavimo MMP-7 lygio katecholaminų per adrenerginės signalizacijos keliu.
Rezultatai
Padidėjęs MMP-7 išraiška buvo nustatyta tiek mRNR ir baltymų lygių skrandžio vėžio ląstelių atsakas į izoproterenolis stimuliacijos. β2-AR antigonist efektyviai panaikinta izoproterenolis sukeltos MMP-7 išraiška. Iš STAT3 ir Ap-1 aktyvacija matomai sukelia izoproterenolis stimuliacijos AP-1 rodomas didesnį veiksmingumą nei STAT3 į izoproterenolis sukeltos MMP-7 išraiška. Mutegenezė trijų stat3 jungimosi vietų MMP-7 promotoriaus nepavyko slopinant MMP-7 promotoriaus transactivation ir triukšmo slopinimo stat3 išraiška nebuvo veiksmingos užkertant kelią izoproterenolis sukeltos MMP-7 išraiška. Tačiau izoproterenolio sukeltos MMP-7 promotorinės veikla buvo visiškai išnyko, kai AP-1 svetainė buvo mutavo. STAT3 ir c-birželis galėtų fiziškai sąveikauti ir prisijungti prie AP-1 vietoje, implicating, kad abiejų transkripcijos faktorių AP-1 vietoje sąveika yra atsakingas už izoproterenolis-stimuliuojama MMP-7 raiškos skrandžio vėžio ląsteles. Iš MMP-7 išraiška skrandžio vėžio audiniuose buvo nustatyta, kad toje vietoje, kur β2-AR buvo ekspresija ir MMP-7 ir b2-AR lygiais buvo didžiausias metastazavusiu lokuso skrandžio vėžio.
Išvados
Up-reguliavimo MMP-7 išraiška per β2-AR-tarpininkaujant signalinio kelio dalyvauja invazija ir metastazių skrandžio vėžio.
faktai
skrandžio vėžys yra antra labiausiai paplitusi pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusių mirčių, su apie 700 000 mirčių kiekvienais metais [1, 2]. Vienas iš svarbiausių veiksnių, skrandžio vėžio patogenezėje yra lėtinė infekcija Helicobacter pylori
[3]. Tačiau, užsikrėtusių asmenų dauguma neišauga piktybinių navikų ir infekcijos rezultatas priklauso nuo priimančiosios, aplinkos ir kiti veiksniai [4]. Daugėja įrodymų, kad psichologinio streso vaidmenį skrandžio vėžio atsiradimo ir vystymosi [5]. Keletas epidemiologinių tyrimų parodė, kad psichologinis ar elgesio reakcijų į stresą veiksniai gali pagreitinti skrandžio vėžio [6, 7] progresavimą. Tačiau tikslus mechanizmas, pagal kurį psichologinis stresas veikia skrandžio vėžio progresavimą, yra neaiški.
Stresas inicijuoja pagumburio-hipofizės-antinksčių ašies (HPA) reakcija, todėl padidėja katecholaminų lygį [8, 9]. Keletas tyrimų parodė, kad katecholaminų stimuliacija trukdo su Bio-elgesio vėžinių ląstelių tiesiogiai, daugiausia per b2 adrenerginių receptorių (β2-AR) sąlygojamą signalinio kelio [10-14]. Naujausi stebėjimai, rodantys galimą mechanizmą kiaušidžių progresavimo, nosiaryklės ir kasos vėžio rodo, kad katecholaminų gali moduliuoti matricos metaloproteinazės (MMP) -2 ir MMP-9 raiška iki stromos ir vėžinių ląstelių [15-17]. Jis kelia įdomų klausimą, psichologinį stresą gali vaidinti svarbų vaidmenį kuriant ir progresavimo skrandžio vėžio moduliuoja MMP raišką per β2-AR tarpininkaujant signalizacijos keliu.
Sukaupta linijas įrodymų rodo, kad MMP-7, dalyvauja invazija ir metastazės [18-24]. MMP-7 yra mažiausias žinomas narys MMP šeimos ir turi aukščiausią tarpląsteliniame (ECM) -degradative aktyvumas prieš iš ECM komponentų, įskaitant elastino, želatina, IV tipo kolageno, fibronektino, vitronektinas, laminino, entactin, aggrecan ir proteoglikanų įvairovė , tarp MMP [25, 26]. Tai taip pat gali pradėti taikyti MMP kaskados [27] aktyvacijos. Unikalios MMP-7 yra ribotą jo išraiška daugiausia epitelio ląstelių liaukų audinio įskaitant normalus pieno liaukų, kepenų, kasos, prostatos ir peribronchial liaukų [28].
Buvo nustatyta, kad MMP-7 yra aktyvuojami invazinė vėžio virškinimo organų, pavyzdžiui, stemplės [29], skrandžio [30], kasos [31, 32], gaubtinės [33-35], kepenų [36] ir kiti organai. Sąvoka lygis MMP-7 yra reikšmingai susijęs su naviko ląstelių, fenotipų agresyvių vėžio ir etape naviko progresavimo [37] transformacijos, ypač auglių skrandžio ir žarnų trakte. Iš MMP-7 raiška dažnai nustatyta ikivėžinių skrandžio žaizdų ir labiausiai skrandžio karcinoma [18-21, 24, 38]. Teigiama koreliacija MMP-7 lygyje su naviko invazijos į skrandžio sieną, limfmazgių metastazių, pilvaplėvės sklaidos ir išlikimo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams buvo dokumentuoti kelių tyrimų [23]. MMP-7 buvo pripažintas svarbiu tarpininku vėžio progresavimo ir laikomas nepriklausomu prognostinį persekiotoją pirminės skrandžio vėžio. Tačiau galimi molekulinius mechanizmus MMP-7 raiškos skrandžio vėžio vis dar daugiausia neištirta.
Šiame tyrime mes ištyrė katecholaminų stimuliacijos poveikį MMP-7 raiškos skrandžio vėžio ląstelių linijų ir nušvietė molekulinius mechanizmus up-reguliavimas MMP-7 lygio katecholaminų per adrenerginės signalizacijos keliu.
rezultatai
izoproterenolis stimuliacijos iki-reguliuoja MMP-7 išraišką
buvo parodyta, kad MMP-9 raiška kiaušidžių vėžys buvo gerokai sustiprintas naviku susijęs makrofagų pacientams, kurių padidėjęs depresijos simptomų [15], ir katecholaminų sustiprėti LPS-sukeltas išraišką MMP žmonėmis monocitų [39]. Siekiant ištirti, ar Katecholaminų Associates su MMP-7 raiškos skrandžio vėžio ląsteles, pirmiausia apžiūrėjo β-AR agonistų izoproterenolį poveikiui MMP-7 geno transkripcijos skrandžio vėžio ląstelių linijų HGC-27 ir MSV-803 , Į katecholaminų naudojamas šiame tyrime dozės parenkami siekiant atspindėti fiziologinį sąlygas šio hormono navikų [40, 41]. Pusiau kiekybinis ir realaus laiko PGR analizė parodė, kad MMP-7 išraiška transkripcijos lygis buvo žemas skrandžio vėžio ląstelių linijas. Kai ląstelės buvo veikiamos 10 mikromolių iš izoproterenolį į serumo neturinčioje terpėje 12 h, MMP-7 iRNR lygiui buvo smarkiai išaugo abiejų ląstelių linijų (. 1A ir pav 1B). Norint nustatyti, ar padidėjęs MMP-7 mRNR veda prie pat išaugo baltymų gamybą, MMP-7 raiškos HGC-27 ir MSV-803 ląstelių buvo analizuojami Vakarų dėmė. Kaip parodyta Fig. 1C, izoproterenolio stimuliacija lėmė reikšmingą iki reguliavimo MMP-7 raiškos HGC-27 ir MSV-803 ląstelių. β2-AR, kuris tarpininkauja dauguma katecholamino poveikio, buvo aptikta krūties ir kiaušidžių vėžio ląstelių [11, 13]. Paaiškinti β2-AR-tarpininkaujant signalizacijos vaidmenį MMP-7 išraiška, mes panaudojo β-AR antagonistais propranololis ir selektyvus β2-AR antagonistas ICI-118.551 išbandyti, jei izoproterenolį poveikis MMP-7 išraiška gali būti slopinamas. Mūsų duomenys parodė, kad gydymas propranololio ir ICI-118,551 efektyviai blokavo izoproterenolis stimuliuojama MMP-7 raiškos (pav. 1D, viršutinė skydo). Mes tada patikrino, ar β2-AR išreikštas skrandžio vėžio ląsteles. Duomenys parodė, kad b2-AR išraiška buvo aptikti trijų skrandžio vėžio ląstelių linijas, įskaitant HGC-27, MGC-803 ir MKN-45 (pav. 1D, apatinė skydelio). Šie duomenys rodo, kad izoproterenolio skatino MMP-7 gamybą skrandžio vėžio ląstelių linijų ir kad iki reguliavimas MMP-7 išraiškos izoproterenolį daugiausia sukėlė β2-AR tarpininkaujant signalizacijos. 1 pav izoproterenolio stimuliacija iki-reguliuoja MMP-7 išraiška. A ir B, HGC-27 ir MGC-803 ląstelės buvo inkubuojami per naktį terpėje serumo neturinčioje ir po to yra veikiamas 2 arba 10 mkm izoproterenolį, atitinkamai. Iš MMP-7 mRNR išraiška buvo analizuojami RT-PCR (A) ir realaus laiko PGR (B). C HGC-27 ląstelių buvo stimuliuojama su 0, 1 arba 2 mkm izoproterenolis ir MSV-803 ląstelių su 0, 5 ir 10 mkm izoproterenolį po bado serume. Iš MMP-7 baltymo ekspresija buvo analizuojami Western Blot. D, MGC-803 ląstelės buvo gydomi 10 mkm propranololio arba 1 pM ICI-118,551 už 1 h ir tada su 10 mkm izoproterenolį. MMP-7 išraiška buvo analizuojami Vakarų dėmė (viršutinis meniu); iš b2-AR ekspresija MGC-803, MKN-45 ir HGC-27 ląstelių buvo aptikta Vakarų dėmė (mažesnė grupė).
izoproterenolis iki-reguliuoja MMP-7 promotoriaus aktyvumą ir aktyvuoja STAT3 AP-1
Norėdami ištirti molekulinius mechanizmus, kuriais katecholaminų iki-reguliuoja MMP-7 išraišką, pirmiausia nustatoma, ar izoproterenolio stimuliacija gali tiesiogiai paveikti MMP-7 promotoriaus aktyvumą. Mes sukonstravo plazmidę pMMP-7, kuriame liuciferazės genas reporteris, varomą 340 bp MMP-7 promotoriaus fragmento (-296 - 44) (pav 2A.). MGC-803 ląstelės buvo transfekuota su pMMP-7 ir izoproterenolį poveikis MMP-7 promotoriaus veiklos buvo įvertintas liuciferazės tyrimų. Kaip parodyta Fig. 2B, po izoproterenolis stimuliacijos 1 h, liuciferazės veikla pradėjo kilti ir palaipsniui didinamas. Šiuo 6 h po kontakto, MMP-7 promotorinės veikla parodė per du kartus padidėja, palyginti su Nestimuliuotų kontrolinių ląstelių, o tai rodo, kad izoproterenolis stimuliacija gali tiesiogiai sukelti MMP-7 promotoriaus transactivation. 2 pav izoproterenolio iki-reguliuoja MMP-7 promotoriaus aktyvumą ir aktyvuoja stat3 ir Ap-1. A, schematiškai pavaizduoti plazmidės pMMP-7, kurio sudėtyje yra liuciferazės genas reporteris, varomą 340 bp MMP-7 promotoriaus fragmento. "SBE, STAT3 svetainė; Abe, AP 1 svetainė. B MSV-803 ląstelės buvo bendrai perkeltų su pMMP-7 ir PRL-TK. Po to, kai transfekciją 48 h, ląstelės buvo inkubuojamos terpėje serumo neturinčioje už papildomą 24 h ir vėliau sužadinamas su 10 mkm izoproterenolį už 0, 1, 2, 3, 6 arba 9 h, atitinkamai. MMP-7 promotorinės veikla buvo įvertinta liuciferazės tyrimus. C ir D, MGC-803 ląstelės buvo gydomi 10 mkm propranololio už 1 h ir tada su 10 mkm izoproterenolį už 0, 15, 30, 60, 120 arba 180 min, atitinkamai. Iš STAT3 ir C-Bir fosforilinimas buvo analizuojami Vakarų dėmė su anti-fosforo-STAT3 ir Anti-fosforo-C-Birželio triušių polikloniniais antikūnais. ISO, izoproterenolio.
Mūsų ankstesniame tyrime [42, 43], mes nustatė AP-1 privalomąją svetainėje adresu pozicijos -67 iki -61 ir trys STAT3 privalomas svetaines pozicijų -137 iki -122, -168 iki -159 ir -255 iki -245 į MMP-7 promotoriaus (pav. 2A). Mes taip pat parodė, kad AP-1 ir STAT3 privalo AP-1 ir viena iš STAT3 (-137 iki -122) svetainių, teigiamai reguliavimo MMP-7 transkripciją. Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad katecholaminų turi potencialą aktyvuoti stat3. Ištirti, ar katecholaminų stimuliuoja MMP-7 transkripciją per iš STAT3 ir Ap-1 aktyvavimo, mes išanalizavo STAT3 ir C-Bir fosforilinimas. Pav. 2C parodė, kad izoproterenolio sukėlė STAT3 fosforilinimą po 30 min stimuliacijos, pasiekti smailės ties 2 h. Nors c-Jun aktyvavimo buvo lėtai, inicijavo 60 min, ne daugiau kaip fosforilinimo fazė buvo pasiekta 2 h, taip pat (pav. 2D). Tai reiškė, kad izoproterenolio stimuliacija parengė β2-AR-tarpininkaujant signalą, kuris paskatino apie STAT3 ir Ap-1.
Stat3 elementas MMP-7 rengėjas neprivalo ir STAT3 nepakanka izoproterenolis sukeltos MMP-7 raiškos aktyvinimas
siekiant nustatyti, ar stat3 elementai yra funkcinis izoproterenolis sukeltos MMP-7 genų transkripcijos, mes pirmą kartą ėmėsi trijų stat3 svetainių mutagenezE per mutavo šerdį sekas stat3 svetainių remiantis pMMP-7 (3A pav.) ir pagamintos plazmidės pMMP-7mS. Plazmidė transfekuota į MGC-803 ląstelių. Po to, kai transfekciją 48 h, ląstelės buvo inkubuojamos terpėje serumo neturinčioje nakties ir vėliau sužadinamas su 10 mikromolių iš izoproterenolį 6 val. Pastebėjome, nenuostabu, kad visų trijų STAT3 jungimosi vietų mutacijų neturėjo matomoje poveikį MMP-7 promotoriaus transactivation. Kaip parodyta Fig. 3B, liuciferazės veikla buvo palaipsniui didinama ir kreipėsi į viršūnę po 6 h po poveikio. Rezultatas buvo labai panašus į tą, kuris ląstelėse transfekuotų su laukinio tipo MMP-7 promotoriaus. Norėdami nustatyti STAT3 vaidmenį šiame renginyje, HGC-27 ir MSV-803 ląstelės buvo pernešta su pGeneSuppressor išreikšti shRNR taikymo stat3 ir HGC-27 /stat3-sh ir MSV-803 /įsteigta stat3-SH ląstelės. Pav. 3C parodė, kad STAT3 išraiška buvo efektyviai nuslopinta abiejų ląstelių. Suderinamas su pirmiau pateiktais duomenimis, izoproterenolis sukeltos MMP-7 promotorinės veikla atsirado ne būti žymiai sutrikęs MSV-803 /stat3-SH ląstelių (. 3D pav). Be to, izoproterenolio sukeltos MMP-7 išraiška tiek mRNR ir baltymų koncentracijos nebuvo svarbiau įtakos triukšmo slopinimo stat3 išraiškos kaip parodė RT-PGR, realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė (Pav. 3E, F ir 3G). Rezultatai rodo, kad STAT3 elementas MMP-7 promotoriaus nereikalaujama ir STAT3 nepakanka izoproterenolis sukeltas MMP-7 išraiška. 3 pav STAT3 elementas MMP-7 promotoriaus nereikalaujama ir STAT3 nepakanka izoproterenolis sukeltas MMP-7 išraiška. A schema atstovavimas plazmidės pMMP-7mS yra trys mutavo stat3 svetaines pozicijų -255 iki -245, -168 iki -159 ir -137 iki -122. B, MGC-803 ląstelės buvo bendrai transfekuota su pMMP-7mS ir PRL-TK, alkanas, ir vėliau sužadinamas su 10 mkm izoproterenolį už 0, 1, 2, 3, 6 arba 9 h, atitinkamai. MMP-7 promotorinės veikla buvo įvertinta liuciferazės tyrimus. C, HGC-27 ir MSV-803 ląstelės buvo stabiliai perkeltų su pGeneSuppressor išreikšti stat3 shRNR. Iš STAT3 išraiška buvo analizuojami Vakarų dėmė į HGC-27 /STAT3-SH ir MSV-803 /stat3-SH ląstelės. D, MMP-7 promotorinės veikla buvo tiriami į MGC-803 /stat3-SH ląstelių po stimuliacijos su 10 mkm izoproterenolį už 0, 1, 2, 3, 6 arba 9 h, atitinkamai. El per G HGC-27 /STAT3-SH ir MGC-803 /STAT3-sh ląstelės buvo stimuliuojama 2 mkm arba 10 mkm izoproterenolį, atitinkamai. Iš MMP-7 išraiška buvo analizuojami RT-PCR (E), realaus laiko PGR (F) ir Western Blot (G).
AP-1 vaidina svarbų vaidmenį izoproterenolis sukeltas MMP-7 raiškos
Tokius naujus duomenis buvo netikėtas, nes STAT3 gali būti aktyvuojamas izoproterenolis stimuliacijos. Be to, į mūsų ankstesniame tyrime [42, 43], mes įrodyta, kad STAT3 ir AP-1 dalyvavo reguliuojant Her2 signalizavimo medijuojamo MMP-7 išraiška krūties vėžio ląsteles. Mes tada siekė ištirti, ar AP 1 įtakoja izoproterenolio sukeltos MMP-7 išraiška. MGC-803 ląstelės buvo transfekuota su plazmidės pMMP-7mA, kurio sudėtyje yra mutuotų AP-1 svetainę padėtyje -67 iki -61 į MMP-7 promotoriaus ir liuciferazės veiklos, išmatuota (Pav. 4a). Stebėtinai, izoproterenolis sukeltas MMP-7 promotorinės veikla buvo visiškai išnyko visais laiko momentais (pav. 4b), o tai rodo, kad AP-1 vieta buvo labai svarbu izoproterenolis sukeltas MMP-7 išraiška. Skaičius 4 AP-1 vaidina svarbų vaidmenį izoproterenolis sukeltas MMP-7 išraiška. A, schematiškai pavaizduoti plazmidės pMMP-7mA, kurio sudėtyje yra mutuotų AP-1 svetainę T padėtyje, -67 iki -61. B, MGC-803 ląstelės buvo bendrai transfekuota su pMMP-7mA ir PRL-TK, alkanas ir vėliau sužadinamas su 10 mkm izoproterenolį už 0, 1, 2, 3, 6 arba 9 h, atitinkamai. MMP-7 promotorinės veikla buvo įvertinta liuciferazės tyrimus. C MSV-803 ląstelių kartu perkeltų su TAM67, pMMP-7 ir PRL-TK buvo sukeltas su 10 mkm izoproterenolį. MMP-7 promotorinės veikla buvo analizuojami liuciferazės tyrimų. D MSV-803 ląstelių stabiliai išreikšti shRNR taikymo c-Jun (MSV-803 /C-Dec-sh) buvo įsteigti ir C-Birželio išraiška buvo analizuojami Vakarų dėmė. E, MMP-7 promotorinės veikla buvo tiriami į MGC-803 /c-Jun-sh ląstelių po stimuliacijos su 10 mkm izoproterenolį už 0, 1, 2, 3, 6 arba 9 h, atitinkamai. F MMP-7 išraiška buvo analizuojamas MSV-803 /C-Dec-sh ląstelių po stimuliacijos su 0, 2 arba 10 mkm izoproterenolį, atitinkamai. G plazmidės išreiškiantys c-Jun STAT3C buvo pernešta į MSV-803 /C-Dec-sh ląstelių, atitinkamai. MMP-7 promotorinės veikla buvo analizuojami liuciferazės tyrimus.
Norėdami patvirtinti izoproterenolio sukeltos MMP-7 išraiška yra kontroliuojama AP-1, mes tada tikrinama, ar yra MMP-7 promotoriaus transactivation sukeltas izoproterenolį gali būti slopinamas dominuojanti neigiamas c-Birželio mutantas TAM67, kuris trūksta c-Bir 5'-transaktyvuoti domeną, bet turi funkcinį c-Bir leucinas užtrauktuką ir DNR surišantis domenas. Po laikinu transfekciją su TAM67 į MSV-803 ląstelių, izoproterenolio sukeltos transactivation MMP-7 rengėjas buvo analizuojami liuciferazės tyrimus. Kaip parodyta Fig. 4C, kad dominuojančios neigiamas c-Jun raiška eksponuojami gerai pastebimas mažinantį poveikį MMP-7 promotoriaus veiklą. Norėdami dar kartą patikrinti svarbų vaidmenį AP-1, mes patikrinome, ar blokuoja organizme išreiškiamas c-Birželio gali slopinti MMP-7 išraiška. Į MSV-803 /C-Dec-sh ląstelės buvo įsteigta (4d pav.) Ir MMP-7 promotorių veiklą nagrinėjo liuciferazės tyrimus. Pavaizduota Pav duomenys. 4E parodė, kad MMP-7 rengėjo veikla buvo stulbinamai sumažintas Griaunamąjį C-Jun išraiška. Vakarų dėmė analizė taip pat parodė, kad isoprotereol sukeltos MMP-7 išraiška buvo ženkliai sumažėjo MSV-803 /C-Dec-sh ląsteles, kadangi iš esmės daug MMP-7 baltymų buvo aptiktas ir tėvinės ląstelės po izoproterenolis stimuliacijos (pav. 4F). Pažymėtina, kad egzogeninės c-Jun raiška žymiai atkurta MMP-7 promotorių veiklą MSV-803 /C-Dec-sh ląsteles, bet constitutively aktyvuota stat3 mutantas STAT3C tik minimaliai aktyvuota MMP-7 vykdytoją, kai c-Birželio išraiška nutilo (pav . 4G). Šie duomenys parodė, kad AP-1 dominuoja izoproterenolis sukeltos MMP-7 išraiška.
C-Jun STAT3 sąveikauja reguliuoti MMP-7 išraišką reaguojant į izoproterenolis stimuliacijos pervežimas bendradarbiavimo stat3 ir C-Bir reguliuojant daug įvairių genų transkripcija buvo pranešta. Mūsų ankstesnis tyrimai rodo, kad MMP-9 promotoriaus aktyvinimas yra priklauso nuo to, STAT3 ir AP-1 [44] sąveikos. Kaip minėta pirmiau, izoproterenolio stimuliacija sukeliama į STAT3 ir Ap-1 vienu metu aktyvacijos. Mes spėliojo, kad stat3 AP-1 gali sąveikauja dalyvauti izoproterenolis stimuliuojama MMP-7 raiškos reguliavimas. Jis buvo nurodyta, kad AP 1 bendradarbiauja su STAT3 į interleukino 6-sukeltas transactivation IL-6 reagavimo elemento tiesioginio AP 1 DNR nėra privalomas [45]. Tai paskatino mus išbandyti galimas bendradarbiavimo privalomas AP-1 /STAT3 AP-1 svetainėje.
Norėdami nustatyti, ar, kad STAT3 AP-1 gali būti įdarbinti AP-1 svetainėje MMP-7 promotoriaus in vivo , MGC-803 ląstelės buvo stimuliuojama su 10 mikromolių iš izoproterenolį už 0, 2,5 arba 4 h, atitinkamai. Chromatino DNR /Branduolinė baltymų kompleksai buvo pasirengę ir jungiasi STAT3 ir C-Bir AP-1 svetainėje buvo analizuojami Chip tyrimus. PGR produktas pasirinktas amplifikacijos tęsiasi nuo -76 iki 165 regiono slėpimas AP-1 svetainę MMP-7 rengėjas. Imunoprecipitacijos su anti-STAT3 ir anti-c-Jun antikūnai po to PGR davė numatomą 241 bp grupe iš nusodikliai po izoproterenolis stimuliacijos už 2,5 val. Šias juostas intensyvumas buvo susilpnėti po 4 h. Priešingai, Nestimuliuotų kontrolinių ląstelių jokios privalomas STAT3 šioje svetainėje buvo pastebėtas ir c-Jun privalomas vos aptinkamas. Nei viena juosta buvo amplifikuota imunoprecipitaciją, naudojant triušio IgG (pav. 5a). Duomenys buvo patvirtinta realiu laiku PGR (pav. 5B). Šie duomenys parodė, kad STAT3 ir C-Bir asociacija su MMP-7 promotoriaus in vivo
buvo specifinis ir kad izoproterenolio stimuliacija sukeltas privalomas stat3 /C-Bir AP-1 elementu. 5 paveikslas C-Jun STAT3 sąveikauja reguliuoti MMP-7 išraiška. A ir B, MGC-803 ląstelės buvo stimuliuojama su 10 mikromolių iš izoproterenolį už 0, 2,5 arba 4 h, atitinkamai. Chromatino DNR /parengė branduolinės baltymų kompleksai. Privalomas STAT3 ir C-Bir AP-1 svetainėje buvo analizuojamos Imunoprecipitacijos su anti-STAT3 ir anti-AP-1 antikūnus po PGR (A) ir realaus laiko PGR (B). C, MGC-803 ląstelės buvo gydomi 10 mkm izoproterenolį už 0 arba 2,5 h, atitinkamai. Branduolinis ekstraktas buvo pagamintas su branduolinių citozolyje ekstrakcijos rinkinio. β-tubulino ir AP 2α buvo analizuojami Vakarų dėmė išnagrinėti citoplazmos ir branduolinių baltymų atskyrimas. C citozolinių baltymai; N branduolinių baltymai. D, 200 mikrogramų branduolinių ekstraktų buvo inkubuojamos 4 ° C temperatūroje 4 h su Biotinilintų oligonukleotidų, kurių sudėtyje yra AP-1 konsensuso seka anksčiau, sujungtą su Dynabeads M-280, esant arba nesant vieno, penkių arba 15 kartų suma dvigubos -stranded oligonukleidų konkurentai. Inkubavimas branduolinių baltymų su dvigrandės oligonukleotidų, kurių sudėtyje yra mutuotą AP-1 svetainę (Mut Oligo) arba nespecifinių dvigrandę oligonukleotidai (NS Oligo) buvo naudojamas kaip kontrolės. Baltymų /DNR kompleksai buvo atskirti su Dynal magnetu, ir pateikti SDS-PAGE. STAT3 ir C-Birželio aptikta Vakarų dėmė su anti-STAT3 ir Anti-C-birželis antikūnų. E ir F, MSV-803 ląstelės buvo bendrai perkeltų su plazmidžių pMMP-7mA ir pCDNA3.1 /C-Dec arba STAT3C ir liuciferazės veikla buvo tiriami.
Toliau apibūdinti stat3 /C-Bir sąveiką su AP 1 svetainė, mes atliekame DNR giminystės kritulių tyrimą. Po to, kai MGC-803 ląstelės buvo gydomi izoproterenolį 2,5 h, branduolinė ekstraktas buvo pagamintas ir jo kokybė buvo įvertintas (5c pav.). Biotinilintą oligonukleotidai atitinkantys -74 iki -52 regione MMP-7 rengėjas buvo inkubuojami su 200 mikrogramų branduolinių ekstraktų išskleidžiamojo tyrimus. Į avidino padengtas magnetinės karoliukai buvo naudojami nusodinti Biotinas žymėto dvigubo dideles oligonukleotidai ir susijusios DNR privalomas baltymus. Jungiasi branduolinių baltymais biotinilintą oligonukleotidų buvo analizuojamas vieno, penkių ar 15 kartų suma dvigubai dideles Oligonųkleotidų konkurentų, kurių sudėtyje yra AP-1 konsensuso sekos buvimą. Inkubavimas branduolinių baltymų su dvigrandės oligonukleotidų, kurių sudėtyje yra mutuotu AP-1 svetainę arba nespecifinį dvigrandės oligonukleotidus buvo naudojamas kaip kontrolės. Sudaroma DNR-baltymų kompleksai buvo išspręstas SDS-PAGE, o po to Western Blot su anti-c-Jun ir anti-stat3 antikūnų. Abiejų transkripcijos faktorių su oligonukleotidų, kurių sudėtyje yra AP-1 konsensuso sekas asociacija galėtų būti aiškiai aptinkama branduolinių ekstraktų iš izoproterenolis-stimuliuojama ląstelių, bet ne iš Nestimuliuotų ląstelių. Konkurencija su penkiolika kartų sumos konkurentų visiškai panaikino biotinilintą DNR /baltymų kompleksų (pav. 5d) išsidėstymą. Ne c-Jun ir STAT3 privalomas arba buvo aptikta oligonukleotidai, turinčios mutavusių AP-1 vietoje ar nespecifinių oligonukleotidai (pav. 5d). Šis eksperimentas suteikia in vitro įrodymų, patvirtinančių, kad stat3 ir C-Jun, pagal katecholaminų stimuliacija, gali fiziškai bendrauti ir įpareigoti AP-1 svetainėje pasiekti transactivation MMP-7 geno skrandžio vėžio ląsteles.
Mes parodėme, kad izoproterenolio indukuotų MMP-7 rengėjas aktyvacijos nebuvo sutrikdyta dėl pagrindinio sekas visose trijose stat3 svetainių mutagenezes, tai rodo, kad stat3 elementai negali veikti izoproterenolis sukeltos MMP-7 genų transkripcijos skrandžio vėžio ląsteles. Siekiant dar labiau patikrinti AP 1 elemento vaidmenį, plazmidą pMMP-7mA buvo bendrai perkeltų į MSV-803 ląstelių su kuriuo pCDNA3.1 /C-Bir ar STAT3C, atitinkamai. Įdomu tai, kad AP-1 rišimosi vietos, mutacija kruopščiai blokavo MMP-7 promotoriaus aktyvaciją transfekuotų ląstelių ekspresija arba c-birželis arba STAT3C (5E pav. Ir 5F), nurodant, kad AP-1 svetainė yra svarbus reguliavimo elementas ir sinergetinis reguliavimas izoproterenolis sukeltos MMP-7 išraiška pagal STAT3 ir Ap-1 remiasi šio elemento.
β2-AR ir MMP-7 buvo colocalized skrandžio vėžio audiniuose
MMP-7 buvo dažnai raiška tuo invaziniam žmogaus skrandžio vėžio priekyje ir tiesiogiai susijęs su prognoze pacientams, sergantiems skrandžio vėžio. Ištirti β2-AR lygio koreliaciją su MMP-7 išraiška žmogaus skrandžio vėžio, mes surinkti penkis skrandžio vėžio audinių pavyzdžius ir analizavo b2 AR ir MMP-7 ekspresiją imunohistocheminio ženklinimo. Įdomu tai, kad stiprus išraiška b2 AR ir MMP-7 atsirado tuo pačiu regiono naviko audiniuose (. 6A pav), tai rodo, intymius santykius tarp MMP-7 ir b2-AR. Toliau tirti MMP-7 vaidmenį ir b2-AR į skrandžio vėžio metastazių, mes išanalizavo išraišką MMP-7 ir beta-ARS į vėžinių, priemiesčių vėžinių ir metastazavusiu audinių iš paciento su skrandžio vėžiu. Kaip parodyta Fig. 6B, kad β1-AR, b2 AR ir MMP-7 prie baltymų lygio išraiška buvo didesnis vėžinių audinių nei apylinkių vėžiniai audinio. Tačiau, didžiausias išraiška iš jų buvo nustatyta, kad metastazavusio audinio. Be to, MMP-7 mRNR buvo taip pat ekspresija, esant metastazėms, audinių (6C pav.). Šie duomenys aiškiai reikšti glaudų ryšį tarp MMP-7, β2-AR ir metastazių skrandžio vėžio. 6 pav β2-AR ir MMP-7 buvo ekspresija skrandžio vėžio audiniuose. A penki skrandžio vėžio audinio mėginiai buvo surinkti. Iš b2-AR ir MMP-7 išraiška buvo analizuojami imunohistocheminiu. B iš MMP-7 išraiška, β1-AR ir β2-AR į vėžinių, priemiesčių vėžinių ir metastazavusiu audiniuose buvo analizuojami Vakarų dėmė. C iš MMP-7 mRNR lygis vėžinių, priemiesčių vėžinių ir metastazavusiu audiniuose buvo analizuojami realiuoju laiku Diskusijos
Šio tyrimo PGR.
Buvo grindžiamas hipoteze, kad psichosocialinis stresas gali būti lemiančių veiksnių skrandžio vėžio. Stresas, nerimas ir depresija gali sukelti sudėtingus fiziologinius ir neuroendokrininiais pokyčius, kurie daro įtaką keliomis sistemomis, įskaitant virškinimo sistema. Vėžiu sergantiems pacientams dažnai patiria didelę emocinę kančią. Iš fiziologinio streso asociacija su padidėjusiu skrandžio rūgšties sekrecijos ir skrandžio skausmai jau seniai buvo pastebėta, [46, 47]. Buvo pranešta, kad lėtinis stresas gali apsunkinti skrandžio opos. Neseniai gyventojų pagrįstas tyrimas dalyvavo 2014 dalykus, stresas buvo laikoma galingiausia rizikos veiksnys skrandžio vėžiui [48]. Išvados iš eksperimentinių tyrimų rodo, kad padidėjęs aktyvumas simpatinės nervų sistemos gali būti pagrindinis mechanizmas, pagal kurį fiziologinių veiksnių poveikį genų ekspresija navikų [49]. Iki šiol dauguma tyrimų tyrimą mechanizmus, jungiančius streso ir vėžio progresavimą buvo susiję su netiesioginio poveikio per imunosupresija [8]. Keliuose naujausi tyrimai, stresas susijęs baltymai ir keliai buvo tiesiogiai susijęs su elgesio keitimo piktybinių ląstelių [10-17]. Tačiau, yra duomenų, apibrėžianti molekulinius mechanizmus, trūkumo.
Šiame tyrime, mes nustatė padidėjusią MMP-7 ekspresiją skrandžio vėžio ląstelių linijų, reaguojant į streso susijusių hormono katecholamino stimuliacijos. Manoma, kad katecholaminų koncentracija gali būti daugiau nei 100 kartų didesnis naviko mikroaplinkos nei normalių audinių ir kraujo plazmoje. MMP-7 yra unikali savo riboto išraiškos vėžinių ląstelių, nurodant, kad MMP-7 išraiška yra naviko-susijęs būdu. Pastebėjome, kad izoproterenolis stimuliacija pastebimai iki reguliuojama MMP-7 išraišką tiek mRNR ir baltymų kiekiai skrandžio vėžio ląsteles. β2-AR antigonist efektyviai panaikinta izoproterenolis sukeltos MMP-7 išraišką iki reguliavimą, o tai rodo, kad β2-AR tarpininkaujant kelias yra įtrauktas į šį procesą.
MMP-7 išraiška griežtai kontroliuojama ne transkripcijos lygyje. Mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad heregulin-β-sukeltas MMP-7 išraiška buvo reglamentuojama HER2 tarpininkaujant STAT3 ir AP 1 aktyvacijos žmogaus krūties vėžio ląstelių linijų [42, 43]. Mes taip pat nustatė funkcinius AP-1 ir stat3 surišimo vietose pirmoje 350 bp transkripcijos pradžios aikštelėje žmogaus MMP-7 promotoriaus [42, 43]. Kitas tyrimas parodė, kad FGF-2 gali tiesiogiai upregulate MMP-7 genų raišką žmogaus navikų ląstelių linijų ir bambos venos endotelio ląstelių per AP-1 ir STAT3 [50]. Daugėja įrodymų, tvirtai remia, kad STAT3 tarnauja kaip centrinę reguliavimo mazgas, dėl kurių keletą onkogeninė signalizacijos keliai nueiti [51]. Netipinė aktyvavimo STAT3 buvo įrodyta, vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio vystymuisi [52, 53]. Neseniai atliktas tyrimas ir mūsų duomenys atskleidė, kad catacholamine asociacijos stat3 aktyvacijos kiaušidžių ir krūties vėžio ląstelių [12, 13]. Šioje studijoje, mes parodė, kad izoproterenolio stimuliacija pastebimai sukeltas į STAT3 aktyvacijos skrandžio vėžio ląsteles, implicating kad katecholaminų gali paspartinti piktybinis progresavimą skrandžio vėžio. Mūsų neskelbtų duomenys taip pat parodė, kad izoproterenolio skatino MMP-2 ir MMP-9 raiška skrandžio vėžio ląstelių daugiausia per aktyvuoti stat3. Tačiau šiame tyrime, mes nustatėme, kad AP-1 rodomas didesnį veiksmingumą nei STAT3 į izoproterenolis sukeltos MMP-7 genų transkripcijos ir stat3 elementai buvo nefunkcionalus, kaip nutildyti stat3 išraiška nebuvo veiksmingos užkertant kelią izoproterenolis sukeltos MMP- 7 išraiška ir mutageninis poveikis iš trijų stat3 jungimosi vietų nepavyko slopinant MMP-7 promotoriaus transactivation reaguojant į izoproterenolis indukcija. Priešingai, AP-1 vieta ir c-birželis reglamentuoja šį procesą. Įdomu tai, kad STAT3 ir c-birželis buvo nustatyta, kad jungiasi prie bendrosios AP-1 aikštelėje MMP-7 promotoriaus tuo pačiu metu, implicating, kad abiejų transkripcijos veiksnių sąveika vienu rišimosi vietos, yra atsakingas už izoproterenolis-stimuliuojama MMP-7 raiškos skrandžio vėžio ląstelės. Įrodėme, kad STAT3 AP-1 yra svarbūs transkripcijos reguliatoriai MMP-7 ir MMP-9 žmogaus krūties vėžio ląstelių anksčiau ir STAT3 AP-1 daro transkripcijos reguliavimo funkcijas, prisijungdamas prie jų atitinkamų elementų [42-44]. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• PROTEOMIKOS pakeitimą, gastic adenokarcinomos iš Japonijos patients
• Pacientas su skrandžio vėžiu, peritoninės karcinomatoze gydomi pilvo ertmę chemoterapijos, kuris išgyveno daugiau nei 5 metus gauti pakartotinius laparoskopinį egzaminus: byla report