Katekolamiini up-regulation MMP-7 ilmentymistä aktivoimalla AP-1 ja STAT3 mahalaukun cancer

katekolamiini up-regulation MMP-7 ilmentymistä aktivoimalla AP-1 ja STAT3 mahasyövän
tiivistelmä
tausta
Stressi, ahdistus ja masennus voivat aiheuttaa monimutkaisia ​​fysiologisia ja neuroendokrii- muutoksia, mikä lisää stressiä hormonin katekoliamiini, jotka voivat muodostaa ensisijainen mekanismi, jonka fysiologiset tekijät vaikuttavat geenien ilmentyminen kasvaimissa. Esillä olevassa tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia katekolamiini stimulaation MMP-7 ilmentymistä mahasyövässä soluissa ja selvitetty molekyylitason mekanismeja ylössäätöä MMP-7 tasolla katekolamiini läpi adrenergisen signalointireitille.
Tulokset
Lisääntynyt MMP-7 ilmentyminen tunnistettiin sekä mRNA ja proteiini tasoilla mahasyövän solujen vastauksena isoproterenolille stimulaatiota. β2-AR antigonist tehokkaasti kumottu isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilme. Aktivointi STAT3 ja AP-1 näkyvästi indusoitiin isoproterenoli stimulaation ja AP-1 näkyy enemmän tehoa kuin STST3 in isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilme. Mutageneesi kolme STST3 sitoutumiskohdista MMP-7 promoottori ei tukahduttaa transaktivaatiota MMP-7 promoottori ja hiljentäminen STAT3 ilme ei ollut tehokkaita estämään isoproterenol aiheuttaman MMP-7 ilme. Kuitenkin, isoproterenolin indusoimaa MMP-7-promoottorin toiminta oli täysin kadonnut, kun AP-1 site mutatoitiin. STAT3 ja c-Jun voisi fyysisesti vuorovaikutuksessa ja sitoutuvat AP-1 site, syytetään että vuorovaikutus sekä transkriptiotekijöitä AP-1 site vastaa isoproterenolilla stimuloitu MMP-7 ilmentymistä mahan syöpäsoluja. Ilmaisu MMP-7 mahasyövän kudoksissa havaittiin olevan kohdassa, jossa β2-AR yliekspressoitui ja MMP-7 ja β2-AR olivat korkeimpia metastaattisen lokuksessa mahasyövän.
Johtopäätökset
Up-MMP-7 ilmaisun β2-AR-välitteistä signalointireitin osallistuu invaasio ja etäpesäkkeiden mahasyövän.
Tausta
mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin yleisin syy syöpään liittyvät kuoleman kanssa noin 700 000 kuolemantapausta vuosittain [1, 2]. Yksi tärkeimmistä tekijöistä, patogeneesissä mahalaukun syöpä on krooninen infektio Helicobacter pylori
[3]. Kuitenkin suurin osa tartunnan saaneet yksilöt eivät kehittynyt pahanlaatuinen kasvain ja tuloksista infektio riippuu isäntä, ympäristö- ja muut tekijät [4]. On yhä enemmän todisteita tukemaan roolia psyykkisen stressin mahalaukun syövän puhkeamista ja kehitystä [5]. Useat epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että psyykkinen tai käyttäytymiseen stressitekijät voivat nopeuttaa etenemistä mahasyövän [6, 7]. Kuitenkin tarkka mekanismi, jolla psyykkinen stressi toimii mahalaukun syövän etenemisessä on epäselvä.
Stressi aloittaa vaste hypotalamus-aivolisäke-lisämunuaisakselin (HPA), mikä lisää katekolamiini tasolla [8, 9]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että stimulointi katekolamiini häiritsee bio-käyttäytymistä syöpäsoluja suoraan, lähinnä β2-reseptorien (β2-AR) -välitteisen signalointireitin [10-14]. Viimeaikaiset havainnot osoittavat mahdollisen mekanismin etenemisen munasarjojen, nenänielun ja haiman syövät osoittavat, että katekolamiini voi ilmentymisen moduloimiseksi matriisin metalloproteinaasi (MMP) -2 ja MMP-9 strooman ja kasvainsolujen [15-17]. Se herättää mielenkiintoinen kysymys, että psyykkinen stressi voi olla rooli kehitettäessä ja etenemisen mahasyövän moduloimalla ilmentymistä MMP kautta β2-AR välitteistä signalointireitin.
Kertyneet riviä todisteet osoittavat, että MMP-7 on osallisena invaasio ja etäpesäkkeet mahasyövän [18-24]. MMP-7 on pienin tunnettu jäsen MMP perheen ja sillä on korkein soluväliaineen (ECM) -degradative aktiivisuutta erilaisia ​​ECM komponentteja, mukaan lukien elastiinin, gelatiinia, tyypin IV kollageeni, fibronektiini, vitronektiini, laminiini, entaktiini, aggrekaania ja proteoglykaanien joukossa MMP [25, 26]. Se kykenee myös laukaista aktivoinnin MMP Cascade [27]. Ainutlaatuinen piirre MMP-7 on sen rajoitetun ilmentymisen pääasiassa epiteelisoluissa rauhaskudoksen sisältää normaalit rintarauhasen, maksan, haiman, eturauhasen ja peribronchial rauhaset [28].
On havaittu, että MMP-7 yliekspressoituu invasiivista syöpien ruoansulatuskanavan, kuten ruokatorven [29], mahalaukun [30], haiman [31, 32], peräsuolen [33-35], maksa [36] ja muihin elimiin. Ilmentymistaso MMP-7 liittyy merkittävästi muutosta kasvainsolujen, fenotyypit aggressiivinen syöpien ja vaiheessa kasvaimen etenemiseen [37], erityisesti kasvaimia ruoansulatuskanavassa. Yli-ilmentyminen MMP-7 on usein tunnistettu syöpää edeltävät mahavaurioita ja useimmat mahakarsinoomat [18-21, 24, 38]. Positiivinen korrelaatio MMP-7 tasolla kasvaimen invaasio mahalaukun seinämän, imusolmuke etäpesäke, vatsakalvon levittäminen ja selviytymisen mahasyöpäpotilaista on dokumentoitu useissa tutkimuksissa [23]. MMP-7 on tunnustettu tärkeä välittäjä syövän etenemiseen ja pitää riippumattomana prognostinen merkkiaine ensisijainen mahasyövän. Kuitenkin mahdollinen molekyylitason mekanismeja MMP-7 yli-ilmentymisen mahalaukun syöpä, on edelleen suurelta osin tutkimaton.
Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme vaikutuksia katekoliamiinien stimulaation MMP-7 ilmentymistä mahasyövän solulinjoissa ja selvitetty molekyylimekanismeihin up-MMP-7 tasolla katekolamiini läpi adrenergisen signalointireitille.
tulokset
isoproterenoli stimulaation ajan säätelee MMP-7
Kävi ilmi, että MMP-9 munasarjojen syöpä oli merkittävästi parannettu vuonna kasvaimeen liittyvät makrofagit potilailla koholla masennusoireita [15] ja katekoliamiini voimistua LPS-indusoitua MMP ihmisen monosyyteissä [39]. Sen tutkimiseksi, onko Katekoliamiini assosioituu MMP-7 mahasyövän soluissa, ensin tarkastetaan vaikutuksia β-AR-agonisti iso- transkriptioon MMP-7-geenin mahasyövän solulinjoissa HGC-27 ja MGC-803 . Annokset katekoliamiinien Tässä tutkimuksessa käytetyt valittiin vastaamaan fysiologisissa olosuhteissa tämän hormonin kasvaimissa [40, 41]. Semikvantitatiivinen ja reaaliaikainen PCR-analyysit osoittivat, että MMP-7 ilmentymisen transkription taso oli alhainen mahasyövässä solulinjoissa. Kun solut altistettiin 10 uM isoproterenolia on seerumittomassa elatusaineessa 12 h, MMP-7-mRNA: n tasot olivat merkittävästi lisääntyneet molemmissa solulinjoissa (Fig. 1A ja 1B). Voit selvittää tehostetun MMP-7-mRNA johtaa vastaavasti lisääntynyt proteiinin tuotanto, MMP-7 ilmentymisen HGC-27 ja MGC-803-soluissa analysoitiin Western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, iso- stimulaatio johti merkittävään ylössäätöä MMP-7 ilmentymisen HGC-27 ja MGC-803 soluja. β2-AR, joka välittää suurimman osan vaikutuksia katekoliamiinien, on todettu rinta- ja munasarjasyövän solujen [11, 13]. Selventää rooli β2-AR-välitteistä signalointia MMP-7 ilmentymisen, me hyödynsi β-AR-antagonisti propranololi ja selektiivinen β2-AR-antagonisti ICI-118,551 testata, jos vaikutusta isoproterenol on MMP-7 ilmentyminen voidaan estää. Meidän tiedot osoittivat, että hoito propranololi ja ICI-118551 tehokkaasti estetty isoproterenolilla stimuloitujen MMP-7 ilmentymisen (Fig. 1 D, ylempi paneeli). Sitten tutki β2-AR ilmentyy mahalaukun syöpäsoluja. Tiedot osoittivat, että ilmentyminen β2-AR oli havaittavissa kolmessa mahasyövän solulinjojen HGC-27, MGC-803 ja MKN-45 (Fig. 1 D, alempi paneeli). Nämä tiedot osoittivat, että iso- stimuloi tuotanto MMP-7 mahasyövän solulinjoissa ja että ylös-MMP-7 ilmentyminen isoproterenolia pääasiassa alkunsa β2-AR-välitteistä signalointia. Kuva 1 isoproterenoli stimulaation ajan säätelee MMP-7. A ja B, HGC-27 ja MGC-803-soluja inkuboitiin yön yli seerumivapaassa väliaineessa, ja sitten se käsiteltiin 2 tai 10 uM isoproterenolia, vastaavasti. Ekspression MMP-7-mRNA: n analysoitiin RT-PCR: llä (A) ja reaaliaikainen PCR (B). C, HGC-27-soluja stimuloitiin 0, 1 tai 2 uM isoproterenoli ja MGC-803-solujen kanssa 0, 5 ja 10 uM iso- jälkeen seerumistarvaatio. Ekspression MMP-7-proteiinia analysoitiin Western blot. D, MGC-803-soluja käsiteltiin 10 uM propranololi tai 1 uM ICI-118551: ssa 1 h ja sitten 10 uM isoproterenolia. MMP-7-ilmentyminen analysoitiin Western blot (ylempi paneeli); ilmaus β2-AR MGC-803, MKN-45 ja HGC-27-solujen havaittiin Western blot (alempi kuva).
Isoproterenoli up-regulation MMP-7 promoottorin aktiivisuutta ja aktivoi STAT3 ja AP-1
Tutkitaan molekyylitason mekanismeja, joilla katekolamiini up-regulation MMP-7 ilmentymisen, ensin määritetään, onko iso- stimulaatio voi suoraan vaikuttaa MMP-7 promoottorin aktiivisuutta. Rakensimme plasmidin PMMP-7, joka sisältää lusiferaasireportterigeenin ohjaa 340 bp: n MMP-7-promoottori fragmentti (-296-44) (Fig. 2A). MGC-803-solut transfektoitiin PMMP-7 ja vaikutus isoproterenolin on MMP-7-promoottorin aktiivisuus määritettiin Lusiferaasimäärityksiä. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, kun iso- stimulaatio 1 h, lusiferaasi toiminta alkoi nousta ja vähitellen parantaa. 6 h altistuksen jälkeen, MMP-7 promoottoriaktiivisuuksien osoittivat yli kaksinkertaistui verrattuna stimuloitumattomassa ohjaus soluja, mikä viittaa siihen, että iso- stimulaatio voi suoraan aiheuttaa transaktivaatiota MMP-7 promoottori. Kuvio 2 isoproterenoli up-regulation MMP-7 promoottorin aktiivisuutta ja aktivoi STAT3 ja AP-1. A kaavamaisesti plasmidin PMMP-7, joka sisältää lusiferaasireportterigeenin ohjaa 340 bp: n MMP-7-promoottorin fragmentti. SBE, STAT3 päällä; ABE, AP-1 site. B, MGC-803-solut kotransfektoitiin PMMP-7 ja PRL-TK. Transfektion jälkeen 48 tuntia, soluja inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa vielä 24 tuntia ja sitten stimuloitiin 10 uM isoproterenolia 0, 1, 2, 3, 6 tai 9 h, vastaavasti. MMP-7 promoottoriaktiivisuuksien arvioitiin Lusiferaasimäärityksiä. C ja D, MGC-803-soluja käsiteltiin 10 uM propranololin 1 h ja sitten 10 uM isoproterenolia 0, 15, 30, 60, 120 tai 180 min. Fosforylaatio STAT3 ja c-Jun analysoitiin Western blot anti-fosfori-STAT3 ja anti-fosfori-c-Jun-kanin polyklonaalisia vasta-aineita. ISO, isoproterenolin.
Edellisessä tutkimuksessa [42, 43], tunnistimme AP-1 sitoutumiskohdan asemaan -67--61 ja kolme STAT3 sitoutumiskohtien asemissa -137--122, -168 ja -159 ja -255--245 MMP-7 promoottori (Fig. 2A). Olemme myös osoittaneet, että AP-1 ja STAT3 sitoutunut AP-1 ja yksi STAT3 (-137--122) sivustoilta, positiivisesti säännellään MMP-7 transkription. Tuore tutkimus osoitti, että katekolamiini on potentiaalia aktivoida STST3. Sen tutkimiseksi, katekoliamiinin stimuloi MMP-7 transkription aktivaation kautta STAT3 ja AP-1, analysoitiin fosforylaatiota STAT3 ja c-Jun. Kuva. 2C osoitti, että iso- aiheutti fosforylaatiota STAT3 jälkeen 30 minuutin stimulaation, huipussaan 2 tuntia. Vaikka aktivaation c-Jun oli hidasta, aloitetaan 60 min, enintään fosforylaatio saatiin aikaan 2 h, sekä (Fig. 2D). Se merkitsi, että iso- stimulointi tuotti β2-AR-välitteistä signaalia, joka laukaisi aktivointi STAT3 ja AP-1.
STST3 elementti MMP-7 promoottori ei tarvita ja STAT3 ole riittävä isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilme
sen määrittämiseksi, onko STAT3 elementit ovat toiminnallisia isoproterenolin indusoimaa MMP-7-geenin transkription, ensin sitoutui mutageneesi kolmen STAT3 sivustoja mutatoimalla ydin-sekvenssit STAT3 sivustoja perustuu PMMP-7 (Fig. 3A) ja rakennettu plasmidi PMMP-7ms. Plasmidi transfektoitiin MGC-803-soluja. Transfektion jälkeen 48 tuntia, soluja inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa yön yli ja stimuloitiin sitten 10 uM isoproterenolia 6 tuntia. Huomasimme yllättäen, että mutaatio kaikkien kolmen STAT3 sitoutumiskohdista ei ollut näkyvästi vaikutusta transaktivaatiota MMP-7 promoottori. Kuten on esitetty kuviossa. 3B, Lusiferaasiaktiivisuudet asteittain ja lähestyi piikin 6 h altistuksen jälkeen. Tuloksena oli hyvin samanlainen kuin soluissa, jotka on transfektoitu villin tyypin MMP-7-promoottori. Tunnistaa roolin STAT3 tässä tapauksessa HGC-27 ja MGC-803-soluja transfektoitiin pGeneSuppressor ilmentävien shRNA kohdistaminen STST3 ja HGC-27 /STAT3-sh ja MGC-803 /STAT3-sh solujen perustettu. Kuva. 3C osoitti, että ilmentyminen STAT3 oli tehokkaasti tukahdutettiin molemmissa soluissa. Yhdenmukainen nämä tiedot isoproterenol aiheuttama MMP-7 promoottoriaktiivisuuksien ei näyttänyt merkittävästi heikentynyt MGC-803 /STAT3-sh-soluissa (kuvio. 3D). Lisäksi isoproterenoli aiheuttama MMP-7 ilmentymisen sekä mRNA ja proteiini tasoilla ollut tärkeämpää vaikuttanut hiljentäminen STST3 ilmaisu osoituksena RT-PCR, reaaliaikainen PCR ja Western blot (kuvio. 3E, F ja 3G). Tulokset viittasivat siihen, että STST3 tekijä MMP-7 promoottori ei tarvita ja STAT3 ole riittävä isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilme. Kuvio 3 STST3 elementti MMP-7 promoottori ei tarvita ja STAT3 ole riittävä isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilme. A kaavamaisesti plasmidin PMMP-7ms sisältää kolme mutatoitunut STAT3 sivustoja asemissa -255--245, -168--159 ja -137--122. B, MGC-803-solut kotransfektoitiin PMMP-7ms ja PRL-TK, nälässä ja stimuloitiin sitten 10 uM isoproterenolia 0, 1, 2, 3, 6 tai 9 h, vastaavasti. MMP-7 promoottoriaktiivisuuksien arvioitiin Lusiferaasimäärityksiä. C, HGC-27 ja MGC-803-solut transfektoitiin stabiilisti pGeneSuppressor ilmentävien STST3 shRNA. Ilmentyminen STAT3 analysoitiin Western blot HGC-27 /STAT3-sh ja MGC-803 /STAT3-sh soluissa. D, MMP-7-promoottorin aktiivisuudet määritettiin MGC-803 /STAT3-sh-solujen stimulaation jälkeen 10 uM isoproterenolia 0, 1, 2, 3, 6 tai 9 h, vastaavasti. E kautta G, HGC-27 /STAT3-sh ja MGC-803 /STAT3-sh-soluja stimuloitiin 2 uM tai 10 uM isoproterenolia, vastaavasti. Ekspression MMP-7 analysoitiin RT-PCR: llä (E), reaaliaikainen PCR (F) ja Western blot (G).
AP-1: lla on kriittinen rooli isoproterenolin indusoimaa MMP-7 ilmaisun
yllä olevat tiedot oli odottamaton, koska STST3 voitaisiin aktivoida iso- stimulaatiota. Lisäksi edellisessä tutkimuksessa [42, 43], olemme osoittaneet, että STAT3 ja AP-1 osallistui säätelyssä Her2 signalointi-välitteisen MMP-7 ilmentyminen rintasyöpäsoluissa. Sitten pyrittiin tutkimaan, onko AP-1 vaikuttaa isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilme. MGC-803-solut transfektoitiin plasmidi PMMP-7 mA, joka sisältää mutatoidun AP-1 site on asennossa -67--61 MMP-7-promoottori ja lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin (Fig. 4A). Yllättäen isoproterenol aiheuttama MMP-7 promoottori toiminta oli täysin kadonnut kaikkina ajankohtina (Fig. 4B), mikä viittaa siihen, että AP-1 site oli ratkaiseva isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilme. Kuvio 4 AP-1: lla on kriittinen rooli isoproterenolin indusoimaa MMP-7 ilmentymistä. A kaavamaisesti plasmidin PMMP-7mA sisältää mutatoidun AP-1 sivuilla asemassa -67--61. B, MGC-803-solut kotransfektoitiin PMMP-7 mA ja PRL-TK, nälässä ja stimuloitiin sitten 10 uM isoproterenolia 0, 1, 2, 3, 6 tai 9 h, vastaavasti. MMP-7 promoottoriaktiivisuuksien arvioitiin Lusiferaasimäärityksiä. C, MGC-803-solut kotransfektoitiin TAM67, PMMP-7 ja PRL-TK indusoitiin 10 uM isoproterenolia. MMP-7 promoottoriaktiivisuuksien analysoitiin Lusiferaasimäärityksiä. D, MGC-803-soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti shRNA kohdistaminen c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) perustettiin ja c-Jun-ilmentyminen analysoitiin Western blot. E, MMP-7-promoottorin aktiivisuudet määritettiin MGC-803 /c-Jun-sh-solujen stimulaation jälkeen 10 uM isoproterenolia 0, 1, 2, 3, 6 tai 9 h, vastaavasti. F, MMP-7 ilmentyminen analysoitiin MGC-803 /c-Jun-sh-solujen stimulaation jälkeen 0, 2 tai 10 uM isoproterenolia, vastaavasti. G, plasmideja ilmentävät c-Jun ja STAT3C transfektoitiin MGC-803 /c-Jun-sh-soluissa, vastaavasti. MMP-7-promoottorin toimintaa analysoitiin Lusiferaasimäärityksiä.
Vahvista isoproterenolin indusoimaa MMP-7 ilmentymistä kontrolloi AP-1, me jälkeen tutkittiin transaktivaatiota MMP-7-promoottori indusoidaan iso- voitiin estää määräävän negatiivinen c-Jun-mutantti TAM67, josta puuttuu c-Jun 5'-transaktivaatioaktiivisuuden domeeni, mutta hänellä on toiminnallinen c-Jun: leusiinivetoketjun ja DNA: ta sitovan domeenin. Sen jälkeen ohimenevän transfektion TAM67 osaksi MGC-803-solut, isoproterenol aiheuttama transaktivaatiota MMP-7 promoottori analysoitiin Lusiferaasimäärityksiä. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, ilmaus vallitsevan negatiivisen c-Jun näytteillä näkyvään hillitsevä vaikutus MMP-7 promoottoriaktiivisuuksien. Edelleen todentamiseksi kriittinen rooli AP-1, testasimme estää endogeenisesti ilmaistaan ​​c-Jun voi estää MMP-7. MGC-803 /c-Jun-sh solut vahvistettu (Fig. 4D) ja MMP-7 promoottoriaktiivisuuksien analysoitiin Lusiferaasimäärityksiä. Tiedot on esitetty. 4E osoittivat, että toiminta MMP-7 promoottorin silmiinpistävän vähentää knock-down c-Jun ilme. Western blot-analyysi osoitti myös, että isoprotereol aiheuttama MMP-7 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt MGC-803 /c-Jun-sh soluja, kun taas oleellisesti suuri määrä MMP-7-proteiinia ei havaittu emosoluilta jälkeen isoproterenolia stimulaation (Fig. 4F). Huomattavaa on, että yli-ilmentyminen eksogeenisen c-Jun dramaattisesti palauttaa MMP-7-promoottorin toimintaa MGC-803 /c-Jun-sh-solut, mutta konstitutiivisesti aktivoitua STAT3 mutantti STAT3C vain vähän aktivoitua MMP-7-promoottori, kun c-Jun: n ilmentyminen vaiennettu (kuvio . 4G). Nämä tiedot osoittivat, että AP-1 hallitsevat isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilme.
C-Jun ja STAT3 synergistisesti MMP-7 ilmentymistä vasteena isoproterenolille stimulaation
yhteistyö Stat3 ja c-Jun säätelyssä erilaisia -geenin transkriptio on raportoitu. Edellisessä tutkimus osoittaa, että aktivointi MMP-9-promoottori on riippuvainen vuorovaikutus Stat3 ja AP-1 [44]. Kuten edellä on mainittu, iso- stimulaatio indusoi aktivointi STAT3 ja AP-1 samanaikaisesti. Me arveltu, että Stat3 ja AP-1 voivat synergistisesti osallistua sääntelyn isoproterenol stimuloiman MMP-7 ilme. On todettu, että AP-1 toimii yhdessä STAT3 on interleukiini-6-indusoidun transaktivaation IL-6-vaste-elementtiin ilman suoraa AP-1 DNA: ta sitovan [45]. Se sai meidät testata mahdollisia osuuskunta sitoutumisen AP-1 /STAT3 AP-1 päällä.
Voit selvittää, että STST3 ja AP-1 voidaan rekrytoida AP-1 site in MMP-7 promoottori in vivo , MGC-803-soluja stimuloitiin 10 uM isoproterenolia 0, 2,5 tai 4 h, vastaavasti. Kromatiini DNA /ydin- proteiinin kompleksit oli valmis ja sitoutuminen STAT3 ja c-Jun AP-1 site analysoitiin ChIP määrityksissä. PCR-tuote valitaan vahvistus ulottuu -76-165 alueen kätkeminen AP-1 site MMP-7-promoottori. Immuunisakkautuksen anti-STAT3 ja anti-c-Jun vasta sen jälkeen PCR tuotti odotettua 241 bp vyöhyke saostajina jälkeen isoproterenol stimulaation 2,5 tuntia. Intensiteetit näillä taajuuksilla heikensi 4 h. Sen sijaan, stimuloimattomissa kontrollisoluissa ei sitoutuminen STAT3 tälle sivustolle havaittiin ja sitoutumisen c-Jun tuskin havaittavissa. Ei bändi monistettiin immunosaostuksella käyttämällä kaniinin IgG (Fig. 5A). Tiedot vahvistettiin reaaliaikainen PCR (Kuva. 5B). Nämä tiedot osoittivat, että yhdistys STAT3 ja c-Jun MMP-7 promoottori in vivo
oli erityinen ja että iso- stimulaatio indusoi sitoutuminen STAT3 /c-Jun AP-1 elementti. Kuva 5 c-Jun ja STAT3 synergistisesti MMP-7 ilme. A ja B, MGC-803-soluja stimuloitiin 10 uM isoproterenolia 0, 2,5 tai 4 h, vastaavasti. Kromatiini DNA /ydin- proteiinin kompleksit valmistettiin. Sitoutuminen STAT3 ja c-Jun AP-1 site analysoitiin immunosaostuksella anti-STAT3 ja anti-AP-1-vasta-aineiden ja sen jälkeen PCR: llä (A) ja reaaliaikainen PCR (B). C, MGC-803-soluja käsiteltiin 10 uM isoproterenolia 0 tai 2,5 h, vastaavasti. Tumauute valmistettiin käyttämällä Nuclear-sytosolin Extraction Kit. β-tubuliinia ja AP-2α analysoitiin Western blot tutkia erottaminen soluliman ja tumaproteiinit. C, sytosolisia proteiinit; N, tumaproteiineja. D, 200 ug tumauutteiden inkuboitiin 4 ° C: ssa 4 h: n biotinyloidun oligonukleotideja, jotka sisältävät AP-1 konsensus-sekvenssin aiemmin kytketty Dynabeads M-280: n läsnä tai poissa ollessa, viisi tai 15-kertainen määrä kaksinkertaisen -stranded oligonukleotidi kilpailijoita. Inkubointi tumaproteiinien kanssa kaksijuosteisen oligonukleotideja, jotka sisältävät mutatoidun AP-1 site (Mut oligo) tai ei-spesifisiä kaksijuosteisia oligonukleotideja (NS Oligo) käytettiin kontrolleina. Proteiini /DNA-kompleksit erotettiin kanssa Dynal magneetti, ja suoritettiin SDS-PAGE. STAT3 ja c-Jun havaittiin Western blot anti-STAT3 ja anti-c-Jun-vasta-aineita. E ja F, MGC-803-solut transfektoitiin yhdessä plasmideilla PMMP-7 mA ja pCDNA3.1 /c-Jun tai STAT3C ja Lusiferaasiaktiivisuudet määritettiin.
Edelleen karakterisoimiseksi vuorovaikutuksen STAT3 /c-Jun kanssa AP-1 site, teimme DNA affiniteetti presipitaatioanalyysissä. Jälkeen MGC-803-soluja käsiteltiin iso- 2,5 h, ydin- uute valmistettiin ja sen laatu arvioitiin (kuvio. 5C). Biotinyloidun oligonukleotideja, jotka vastaavat -74--52 alueelle MMP-7 promoottori inkuboitiin 200 ug ydinvoiman uutteita avattavasta määrityksissä. Streptavidiinilla päällystettyjen magneettisten helmien käytettiin saostamiseksi biotiini-leimattua kaksijuosteista oligonukleotidit ja niihin liittyvät DNA: han sitoutuvat proteiinit. Sitoutumisen tumaproteiinien biotinyloituun oligonukleotidit analysoitiin, kun läsnä on yksi, viisi tai 15-kertainen määrä kaksijuosteinen oligonukleotidi kilpailijoita, jotka sisältävät AP-1 konsensus-sekvenssit. Inkubointi tumaproteiinien kanssa kaksijuosteisen oligonukleotideja, jotka sisältävät mutatoidun AP-1 site tai ei-spesifisiä kaksijuosteisia oligonukleotideja käytettiin kontrolleina. Saatu DNA-proteiini-kompleksit erotettiin SDS-PAGE: lla, jota seurasi Western blot anti-c-Jun ja anti-STAT3-vasta-aineita. Yhdistyksen Molempien transkriptiotekijöitä kanssa sisältävät oligonukleotidit AP-1 konsensus-sekvenssit voitiin selvästi havaita ydin- otteita isoproterenol stimuloiduista, mutta ei stimuloimattomasta soluista. Kilpailu viidentoista kertainen määrä kilpailijoiden täysin poistetaan muodostumista biotinyloitua DNA /proteiini-kompleksit (Kuvio. 5D). O sitoutuminen c-Jun ja STAT3 joko oligonukleotideja, jotka sisältävät mutatoidun AP-1 site tai epäspesifinen oligonukleotidit havaittiin (Fig. 5D). Tämä koe antaa in vitro todisteita siitä, että STST3 ja c-Jun, alle katekolamiini stimulaatio, voi fyysisesti vuorovaikutuksessa ja sitoutuvat AP-1 site saavuttaa transaktivaatiota MMP-7-geenin mahalaukun syöpäsoluja.
Osoitimme, että iso- indusoimaan MMP-7-promoottorin aktivaatio ei heikennä mutageneesi ydin-sekvenssit kaikkien kolmen STAT3 sivustoja, mikä viittaa siihen, että STAT3 elementit eivät voi toimia isoproterenolin indusoimaa MMP-7-geenin transkription mahalaukun syöpäsoluja. Edelleen todentamiseksi rooli AP-1-elementti, plasmidi PMMP-7 mA oli kotransfektoitiin MGC-803-soluissa joko pCDNA3.1 /c-Jun tai STAT3C, vastaavasti. Mielenkiintoista on, että mutaatio AP-1 sitoutumiskohta perusteellisesti estetty aktivointi MMP-7-promoottorin transfektoiduissa soluissa, jotka yliekspressoivat joko c-Jun tai STAT3C (Fig. 5E ja 5F), mikä osoittaa, että AP-1 site on tärkeä säätelyelementti ja synergistinen sääntely isoproterenol aiheuttaman MMP-7 ilmentyminen STST3 ja AP-1 luottaa tähän elementtiin.
β2-AR ja MMP-7 oli colocalized mahasyövän kudoksissa
yli-ilmentymisen MMP-7 oli usein leviämisrintamassa ihmisen mahasyövän ja suoraan liittyvät ennusteeseen potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. Tutkia korrelaatio β2-AR tasolla MMP-7 ilmentymistä ihmisen mahasyövän, keräsimme viisi mahasyövässä kudosnäytteitä ja analysoitiin ilmentyminen β2-AR ja MMP-7 immunohistokemiallisella merkintöjä. Mielenkiintoista on, että vahva ilmentyminen β2-AR: n ja MMP-7 ilmeni samalla alueella kasvainkudoksessa (Fig. 6A), mikä viittaa siihen, intiimi suhde MMP-7 ja β2-AR. Jotta voitaisiin edelleen tutkia roolia MMP-7 ja β2-AR että etäpesäke mahasyövän, analysoimme ilmaisun MMP-7 ja β-AR: in cancerous, peri-syöpä- ja metastaattinen kudosten potilaalta, jolla mahasyöpä. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, ilmaus β1-AR, β2-AR ja MMP-7-proteiinin taso oli korkeampi syöpäkudoksessa kuin reuna-syöpäkudoksen. Kuitenkin korkein ilmentymä niistä havaittiin metastaattisen kudoksessa. Lisäksi MMP-7-mRNA yli-ilmentyy myös etäpesäkkeisessä kudoksissa (Fig. 6C). Nämä tiedot vahvasti merkitsevät läheinen yhteys keskuudessa MMP-7, β2-AR ja etäpesäkkeiden mahasyövän. Kuva 6 β2-AR ja MMP-7 oli yli-ilmentynyt mahasyövän kudoksissa. A, viisi mahasyövän kudosta kerättiin. Ekspression β2-AR: n ja MMP-7 analysoitiin immunohistokemiallisesti. B MMP-7, β1-AR ja β2-AR cancerous, peri-syöpä- ja metastasoitunut kudoksia analysoitiin Western blot. C, taso MMP-7 mRNA cancerous, peri-syöpä- ja metastasoitunut kudoksia analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä.
Keskustelu
Tämä tutkimus perustui olettamukseen, että psykososiaalinen stressi saattaa olla altistava tekijä mahasyövän. Stressi, ahdistus ja masennus voivat aiheuttaa monimutkaisia ​​fysiologisia ja neuroendokrii- muutoksia, jotka vaikuttavat useita järjestelmiä, mukaan lukien ruoansulatuskanavan. Syöpäpotilaiden kokevat usein huomattavan ahdistusta. Yhdistyksen fysiologisten stressiä korkeus mahahapon eritystä ja vatsakipua on pitkään huomannut [46, 47]. On raportoitu, että krooninen stressi voi pahentaa vatsahaavan. Tuoreessa väestöpohjainen tutkimus ilmoittautunut 2014 aiheita, stressi pidettiin tehokkain riskitekijä mahasyövän [48]. Havainnot kokeellisista tutkimukset viittaavat siihen, että lisääntynyt aktiivisuus sympaattisen hermoston voi olla ensisijainen mekanismi, jonka fysiologiset tekijät vaikuttavat geenien ilmentyminen kasvaimissa [49]. Tähän mennessä suurin osa tutkimuksista tutkivat mekanismeja yhdistävät stressiä ja syövän etenemistä on liittynyt välillisiä vaikutuksia kautta immunosuppressio [8]. Useissa viimeaikaisissa tutkimuksissa, stressiin liittyvät proteiinit ja reitit liitettiin suoraan käyttäytymiseen muutos pahanlaatuisten solujen [10-17]. Kuitenkin on olemassa niukasti tietoja rajaamista molekyylitason mekanismit.
Tässä tutkimuksessa tunnistimme lisäsi MMP-7 ilmentymistä mahasyövän solulinjoja vastauksena stimulaation stressiin liittyvät hormoni Katekoliamiini. On arvioitu, että pitoisuus katekolamiini voisi olla yli 100 kertaa suurempi kasvaimen mikroympäristössä kuin normaaleissa kudoksissa ja kiertävän plasman. MMP-7 on ainutlaatuinen rajoitettu ilmentyminen kasvainsoluissa, mikä osoittaa, että MMP-7 ilmentyminen on kasvaimeen liittyvän tavalla. Huomasimme, että iso- stimulaatio merkittävästi säädelty MMP-7 ilmentymisen sekä mRNA ja proteiini tasoilla mahalaukun syöpäsoluja. β2-AR antigonist tehokkaasti kumottu isoproterenol aiheuttama MMP-7 ilmentymisen ylössäätöä, mikä viittaa siihen, että β2-AR-välitteistä reitin on mukana prosessissa.
MMP-7 ilmentyminen on tiukasti kontrolloitua tasolla transkription. Edellisessä tutkimus osoitti, että hereguliini-β-indusoidun MMP-7 ekspressio säätelee HER2-välitteisen STAT3 ja AP-1 aktivaatio ihmisen rintasyövän solulinjoissa [42, 43]. Havaitsimme myös toiminnallinen AP-1 ja STAT3 sitoutumiskohdat ensimmäisellä 350 bp transkription aloituskohdasta ihmisen MMP-7 promoottori [42, 43]. Toinen tutkimus osoitti, että FGF-2 voi suoraan upregulate MMP-7-geenin ilmentymistä ihmisen kasvainsolulinjoissa ja napalaskimon endoteelisolujen läpi AP-1 ja STAT3 [50]. Kertyvät näyttöä tukee voimakkaasti STST3 toimii keskeinen sääntelyn solmulle, jossa useita kasvaimia synnyttävän signalointireittien lähenevät [51]. Poikkeava aktivaatio STAT3 on osoittautunut kriittinen rooli mahasyövän kehittämiseen [52, 53]. Tuoreessa tutkimuksessa ja tietojemme paljastui yhdistys catacholamine kanssa STAT3 aktivaatio munasarja- ja rintasyövän soluja [12, 13]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että iso- stimulaatio näkyvästi indusoidun aktivaation STAT3 mahalaukun syöpäsoluja, syytetään että katekoliamiini voi nopeuttaa maligni kehittyminen mahasyövän. Meidän julkaisematon data osoitti myös, että iso- stimuloi MMP-2 ja MMP-9 mahalaukun syöpäsoluissa lähinnä aktivoimalla STST3. Kuitenkin tässä tutkimuksessa, huomasimme, että AP-1 näkyy enemmän tehoa kuin STST3 in isoproterenol aiheuttama MMP-7-geenin transkription ja STAT3 elementit olivat toimimattomia, kuten hiljentäminen STST3 ilmaisu ei ollut tehokkaita estämään isoproterenol aiheuttaman MMP- 7 ilmaisun ja mutageneesi kolmen STAT3 sitoutumiskohtien ole tukahduttaa transaktivaatiota MMP-7 promoottori vastauksena isoproterenolille induktioon. Sen sijaan AP-1 site ja c-Jun säätelee tätä prosessia. Mielenkiintoista on, STAT3 ja c-Jun havaittiin sitoutuvan yhden AP-1 site MMP-7-promoottori samanaikaisesti, syytetään että vuorovaikutus sekä transkriptiotekijöitä yksi sitoutumiskohta on vastuussa isoproterenolilla stimuloitu MMP-7 ilmentymistä mahasyövän solut. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Proteomic muutos gastic adenokarsinooman välillä Japani potilaista
• Potilas, jolla mahasyövän vatsakalvon carcinomatosis hoidettu vatsaonteloon kemoterapiaa jotka selvisivät yli 5 vuoden vastaanottava toistuva laparoskooppisten tutkimukset: tapausselostus