A katekolamin up-szabályozza MMP-7 expresszió aktiválásával AP-1 és STAT3 a gyomor cancer

katekolaminok up-szabályozza MMP-7 expresszió aktiválásával AP-1 és STAT3 gyomorrákban
Abstract
alapon
stressz, szorongás és a depresszió okozhat összetett élettani és neuroendokrin változásokat, így a megnövekedett stressz hormon katekolamin, amely képezhet az elsődleges mechanizmus, amely révén a fiziológiai tényezők hatását génexpressziót daganatok. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk az katekolamin stimuláció MMP-7 expresszió gyomor rákos sejteket, és felderítették molekuláris mechanizmusainak up-reguláció MMP-7 szinten katekolamin keresztül adrenerg jelátviteli. Katalógusa Eredmények
Megnövelt MMP-7 expresszióját azonosítottuk mind mRNS és fehérje szintje a gyomorrák sejtek válasz izoproterenol stimulációt. β2-AR antigonist hatékonyan megszüntette előidéző ​​izoproterenol MMP-7 expresszió. Az aktiválás a STAT3 és az AP-1-et jól által kiváltott isoproterenol stimulálás és AP-1 jelenik meg egy nagyobb hatékonyságú, mint STAT3 az izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió. Mutagenezis három STAT3 kötőhelyek MMP-7 promóter nem elnyomják a transzaktivációját MMP-7 promóter és hangtompító STAT3 kifejezés nem volt hatékony megelőzése isoproterenollal indukált MMP-7 expresszió. Azonban, izoproterenol-indukált MMP-7 promóter tevékenységek teljesen eltűntek, amikor az AP-1-helyet-ben mutált. STAT3 és c-Jun képes fizikailag kölcsönhatásba lépnek, és kötődnek az AP-1-helyet, implicating, hogy a kölcsönhatás a két transzkripciós faktorok az AP-1-helyet felelős izoproterenol-stimulált MMP-7 expresszió gyomor rákos sejtekben. Az MMP-7 gyomorrák szövetekben találták a helyszínen, ahol a β2-AR-t túlzott mértékben, és a szintek az MMP-7 és β2-AR voltak a legmagasabb a metasztatikus locus gyomorrák.
Következtetések
Up-szabályozás az MMP-7 expresszió révén β2-AR-közvetített jelátviteli útvonal részt vesz invázió és metasztázis gyomorrák. katalógusa Háttér katalógusa gyomorrák a második leggyakoribb okozója a rák okozta halál, a 700 000 haláleset évente [1, 2]. Az egyik fontos tényező a patogenezisében gyomor rák krónikus Helicobacter pylori
[3]. Azonban a legtöbb fertőzött személyek nem fejlődik rosszindulatú folyamat és az eredmény a fertőzés függ host, környezeti és egyéb tényezők [4]. Egyre több bizonyíték van támogató szerepe a pszichés stressz a gyomorrák kialakulásának és [5]. Számos epidemiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a pszichológiai vagy viselkedési stressz faktorok felgyorsíthatják a gyomorrák [6, 7]. Azonban a pontos mechanizmus, amely révén a pszichológiai stressz jár gyomorrák progresszió nem tisztázott.
Stressz kezdeményez válasz a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengely (HPA), ami növeli a katekolamin szintet [8, 9]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a stimuláció az katekolamin zavarja a biológiai viselkedés a tumorsejtek közvetlenül, főleg a β2-adrenerg receptorok (β2-AR) által közvetített jeltovábbítási útvonal [10-14]. A legújabb megfigyelések mutatva, hogy egy lehetséges mechanizmusa a progresszió a petefészek-, orr-garat és hasnyálmirigyrákok azt jelzik, hogy a katekolamin modulálhatja expresszióját mátrix metalloproteináz (MMP) -2 és MMP-9 által stroma és a daganatos sejtek [15-17]. Ez felvet egy érdekes kérdés, hogy a pszichológiai stressz szerepet játszhat a kialakulásában és progressziójában gyomorrák modulálja a kifejezés az MMP-k révén β2-AR közvetített jelátviteli.
Halmozott vonal bizonyítékok azt mutatják, hogy az MMP-7 részt vesz a áttétek gyomorrák [18-24]. MMP-7 a legkisebb ismert tagja az MMP család, és rendelkezik a legmagasabb extracelluláris mátrix (ECM) -degradative aktivitás ellen a különböző ECM komponensek, ilyenek az elasztin, a zselatin, a IV típusú kollagén, a fibronektin, vitronektin, laminin, entaktin, aggrekán és proteoglikánok között a MMP-k [25, 26]. Azt is képes kiváltani az aktiválás egy MMP kaszkád [27]. Egy egyedülálló tulajdonsága az MMP-7 annak korlátozott expressziója elsősorban hámsejtjeiben mirigyes szövet, beleértve a normális emlő, a máj, a hasnyálmirigy, a prosztata és a peribronchiáiis mirigyek [28].
Azt találtuk, hogy az MMP-7 túlexpresszálódik az invazív rákok emésztőszervek, mint például a nyelőcső [29], gyomorrák [30], a hasnyálmirigy [31, 32], a colorectalis [33-35], a májban [36] és más szervekben. Az expressziós szintjét az MMP-7 szignifikánsan összefügg az átalakulás a tumorsejtek, fenotípusok agresszív rákok és szakaszában tumorprogresszió [37], különösen a tumorok a gasztrointesztinális traktusban. A túlzott mértékű expressziója az MMP-7 gyakran azonosított premalignus gyomor léziók, és a legtöbb gastricus karcinómák [18-21, 24, 38]. A pozitív korreláció az MMP-7 szinten a tumor invázió a gyomorfal, nyirokcsomó áttét, peritoneális terjesztése és túlélését gyomorrákos betegek leírták több tanulmány [23]. MMP-7 már elismerten fontos közvetítője daganatos progresszió és úgy, mint egy független prognosztikai elsődleges gyomorrák. Azonban a lehetséges molekuláris mechanizmusait MMP-7 fokozott expressziója a gyomorrák még mindig nagyrészt feltáratlan.
A jelen tanulmányban vizsgáltuk a hatását katekolamin stimuláció az MMP-7-expresszió gyomorrák sejtvonalakat és felderítették molekuláris mechanizmusai a fel-szabályozás az MMP-7 szinten katekolamin keresztül egy adrenerg jelátviteli.
eredménye
izoproterenol stimuláció up-expresszióját szabályozza MMP-7
kimutattuk, hogy az MMP-9 petefészek rák jelentősen továbbfejlesztett tumorasszociált makrofágok a betegeknél, akiknél fokozott depressziós tünetek [15] és a katekolamin potencírozza LPS-indukált expressziója az MMP-k a humán monociták [39]. Annak érdekében, hogy vizsgálja meg, hogy katekolamin asszociálódik az MMP-7 gyomor rákos sejtekben, akkor először ellenőrzik hatását β-AR agonista izoproterenol a transzkripció az MMP-7 gén gyomor rákos sejtvonalakban HGC-27 és MGC-803 . A dózisok katecholamin ebben a vizsgálatban alkalmazott választottak, hogy tükrözze a fiziológiás körülmények között ez a hormon a tumorokban [40, 41]. Félig kvantitatív és real-time PCR-elemzések azt mutatták, hogy az MMP-7-expresszió transzkripciós szinten alacsony volt gyomor rákos sejtvonalak. Amikor a sejteket tettünk ki 10 jiM izoproterenol a szérummentes tápközegben, 12 órán, MMP-7 mRNS-szinteket jelentősen növekedett mindkét sejtvonal (1A. És 1B). Annak meghatározására, hogy a fokozott MMP-7 mRNS vezet hasonló növekedés a fehérje termelés, az MMP-7-expresszió HGC-27 és MGC-803 sejteket analizáltuk Western-blottal. Ábrán látható. 1C, izoproterenol stimuláció eredményezett jelentős up-regulációját az MMP-7-expresszió HGC-27 és MGC-803 sejtekben. β2-AR, amely közvetíti a legtöbb hatásait katekolamin, már azonosított mell és a petefészek rákos sejtek [11, 13]. Szerepének tisztázása a β2-AR-közvetített jelátvitel MMP-7 expresszió alkalmaztunk, a β-AR antagonista propranolol és szelektív β2-AR antagonista ICI-118551 annak tesztelésére, hogy a hatása isoproterenol MMP-7 expresszió gátolható. Adataink azt mutatják, hogy a kezelés propranolol és ICI-118551 hatékonyan blokkolta izoproterenol- stimulált MMP-7 expresszió (ábra. 1D felső panel). Ezután megvizsgálták, hogy β2-AR fejezik gyomor rákos sejteket. Az adatok azt mutatták, hogy a kifejezés a β2-AR volt kimutatható három gyomor rákos sejtvonalak, beleértve HGC-27, MGC-803 és MKN-45 (ábra. 1D alsó panel). Ezek az adatok azt mutatták, hogy izoproterenol stimulált termelésének MMP-7 gyomor rákos sejtvonalban, és hogy a fel-szabályozás az MMP-7 expresszió izoproterenol főként által kiváltott β2-AR-közvetített jelátviteli. 1. ábra izoproterenol stimuláció up-expresszióját szabályozza MMP-7. Az A és B, HGC-27 és MGC-803 sejteket egy éjszakán át inkubáltuk szérummentes közegben, majd az oldathoz 2 vagy 10 jiM izoproterenol, ill. Az MMP-7 mRNS analizáltuk RT-PCR (A) és a valós idejű PCR-t (B). C, HGC-27 sejteket stimulálunk 0, 1 vagy 2, uM isoproterenol és MGC-803 sejtek 0, 5 és 10 | iM izoproterenol után szérum éhezés. Az MMP-7 fehérje analizáltuk Western-blottal. D, MGC-803-sejteket kezeltünk 10 jiM propranololt vagy 1 uM ICI-118551 1 órán, majd 10 jiM izoproterenol. MMP-7-expressziót analizáltuk Western-blot (felső panel); a kifejezés a β2-AR MGC-803, MKN-45 és HGC-27 sejtek detektáltuk Western-blot (alsó panel).
izoproterenol up-szabályozza az MMP-7-promoter aktivitásának és aktiválja STAT3 és AP-1
hogy vizsgálja meg a molekuláris mechanizmusok, amelyek a katekolamin up-szabályozza az MMP-7-expresszió, először meghatározzuk, hogy az isoproterenol stimulálás közvetlenül befolyásolhatják az MMP-7-promoter aktivitását. Mi épített plazmid PMMP-7 tartalmazó luciferáz riporter gén által vezérelt egy 340 bp-MMP-7 promoter fragmenst (-296 - +44) (2A.). MGC-803 sejteket transzfektáltunk PMMP-7, és a hatása az izoproterenol MMP-7 promóter aktivitását értékeltük luciferáz assay. Ábrán látható. 2B, miután izoproterenol stimuláció 1 órán, a luciferáz-aktivitás emelkedni kezdett, és fokozatosan javul. 6 óra expozíció után, MMP-7 promóter tevékenységek mutatott több mint kétszeres növekedést jelent a nem stimulált kontroll sejtekben, ami arra utal, hogy izoproterenol stimuláció közvetlen előidézője a transzaktivációját MMP-7 promóter. 2. ábra Az izoproterenol up-szabályozza az MMP-7-promoter aktivitásának és aktiválja STAT3 és AP-1. A, sematikus ábrázolása a plazmidot PMMP-7 tartalmazó luciferáz riporter gén által vezérelt egy 340 bp-MMP-7 promoter fragmentumot. SBE STAT3 helyszínen; ABE, AP-1 oldalon. B, MGC-803 sejteket együtt transzfektáltunk PMMP-7 és pRL-TK. A transzfekciót követően 48 órán át, a sejteket szérummentes tápközegben további 24 órán át, majd stimuláltuk 10 jiM izoproterenol 0, 1, 2, 3, 6 vagy 9 h. MMP-7 promóter aktivitásokat úgy határozzuk luciferáz assay. C és D, MGC-803-sejteket kezeltünk 10 jiM propranololt 1 órán, majd 10 jiM izoproterenol, 0, 15, 30, 60, 120 vagy 180 perc, ill. A foszforiláció a STAT3 és a c-Jun-t analizáltuk Western-blot-anti-foszfor-STAT3 és anti-foszfor-c-Jun nyúl poliklonális antitestekkel. ISO, izoproterenol. Katalógusa Korábbi vizsgálatunkban [42, 43], találtunk egy AP-1 kötőhely a helyzetben -67 a -61 és három STAT3 kötőhelyek pozíciók -137 hogy -122, -168, hogy -159 és -255 hogy -245 MMP-7-promóter (2A.). Kimutattuk továbbá, hogy az AP-1 és STAT3 kötődik az AP-1 és az egyik STAT3 (-137 hogy -122) oldalak, pozitívan szabályozó MMP-7 transzkripciót. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a katekolamin potenciálisan aktiválni STAT3. Annak vizsgálatára, hogy a katekolamin stimulálja az MMP-7 transzkripciós aktiválásán keresztül a STAT3 és AP-1, elemeztük a foszforilációja STAT3 és a c-június Ábra. 2C azt mutatta, hogy az izoproterenol okozott foszforilációját STAT3 30 perc után stimuláció, elérve a csúcs 2 órán át. Bár az aktiváló a c-Jun lassú volt, kezdeményezett 60 perc, legfeljebb foszforilációja megvalósíthatók 2 óra is (ábra. 2D). Ez azt jelentette, hogy izoproterenol stimuláció készített egy β2-AR-közvetített jel, amelynek hatására a aktiválását STAT3 és AP-1.
STAT3 eleme MMP-7 promoter nem szükséges, és a STAT3 nem elegendő az izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió
Annak érdekében, hogy meghatározza, hogy a STAT3 elemek funkcionális izoproterenol-indukált MMP-7 gén transzkripcióját, először vállalta a mutagenezis három STAT3 oldalakon keresztül mutáló mag-szekvenciák a STAT3 oldalak alapuló PMMP-7 (ábra. 3A) és gyártani plazmidot PMMP-7mS. A plazmidot transzfektáljuk MGC-803 sejtekben. A transzfekciót követően 48 órán át, a sejteket szérummentes tápközegben éjszakán át, majd stimuláltuk 10 jiM izoproterenol 6 órán át. Észrevettük, meglepő módon, hogy a mutáció mindhárom STAT3 kötőhely nem volt kiemelkedő hatása a transzaktivációs az MMP-7-promoter. Ábrán látható. 3B, luciferáz tevékenységeket fokozatosan nőtt, és megközelítette a csúcs 6 órán expozíciót követően. Az eredmény nagyon hasonló volt, hogy megfigyelhető a transzfektált sejtekben a vad típusú MMP-7 promóter. Azonosításához a szerepe a STAT3 ebben az esetben, HGC-27 és MGC-803 sejteket transzfektáltunk pGeneSuppressor expresszáló shRNS célzási STAT3 és HGC-27 /STAT3-SH és MGC-803 /STAT3-SH sejteket létrehozni. Ábra. 3C azt mutatta, hogy a kifejezés a STAT3-ben hatékonyan elnyomta mindkét sejtekben. Összhangban a fenti adatokat, izoproterenol-indukált MMP-7 promóter tevékenységek nem tűnt jelentősen károsodik MGC-803 /STAT3-SH sejteket (ábra. 3D). Továbbá, izoproterenol-indukált MMP-7 expresszióját mRNS és fehérje szinten nem is fontosabb befolyásolta silencing STAT3 expressziójának amint azt RT-PCR, real-time PCR és Western blot (ábra. 3E, F és 3G). Az eredmények arra utalnak, hogy a STAT3 eleme MMP-7 promoter nem szükséges, és a STAT3 nem elegendő az izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió. 3. ábra STAT3 eleme MMP-7 promoter nem szükséges, és a STAT3 nem elegendő az izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió. A, sematikus ábrázolása a plazmidot PMMP-7mS tartalmazó három mutáns STAT3 helyeket a pozíciók -255 hogy -245, -168, hogy -159 és -137 a -122. B, MGC-803 sejteket együtt transzfektáltunk PMMP-7mS és pRL-TK, kiéhezett, majd stimuláltuk 10 jiM izoproterenol 0, 1, 2, 3, 6 vagy 9 h. MMP-7 promóter aktivitásokat úgy határozzuk luciferáz assay. C, HGC-27 és MGC-803 sejteket stabilan transzfektáltunk pGeneSuppressor expresszáló STAT3 shRNS. A kifejezés a STAT3 elemeztük Western blot HGC-27 /STAT3-sh MGC-803 /STAT3-sh sejteket. D, MMP-7 promóter aktivitásokat vizsgáltuk MGC-803 /STAT3-SH sejteket stimulálás után 10 jiM izoproterenol 0, 1, 2, 3, 6 vagy 9 h. E-G, HGC-27 /STAT3-SH és MGC-803 /STAT3-SH sejteket stimulálunk 2 uM vagy 10 jiM izoproterenol, ill. Az MMP-7-ben analizáltuk RT-PCR (E), a valós idejű PCR-t (F) és a Western-blot (G).
AP-1 kritikus szerepet játszik az izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió
A fenti adatok váratlan volt, mivel a STAT3 lehet aktiválni izoproterenol stimulációt. Ezen túlmenően, a korábbi vizsgálatban [42, 43], kimutattuk, hogy a STAT3 és AP-1 részt szabályozásában Her2 jelző közvetített MMP-7 expresszió emlőrákos sejtekre. Ezután kérte, hogy vizsgálja meg az AP-1 hatások előidéző ​​izoproterenol MMP-7 expresszió. MGC-803 sejteket transzfektáltunk a plazmid PMMP-7 mA tartalmazó mutáns AP-1-helyet a helyzetben -67 a -61 MMP-7 promotert és luciferáz-aktivitás mérhető (ábra. 4A). Meglepő módon, izoproterenol-indukált MMP-7 promóter tevékenységek teljesen eltűnt minden időpontban (ábra. 4B), ami arra utal, hogy az AP-1-helyet volt kulcsfontosságú izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió. A 4. ábra az AP-1 kritikus szerepet játszik az izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió. A, sematikus ábrázolása a plazmidot PMMP-7 mA tartalmazó mutáns AP-1-helyet a helyzetben -67 a -61. B, MGC-803 sejteket együtt transzfektáltunk PMMP-7 mA és pRL-TK, kiéhezett majd stimuláltuk 10 jiM izoproterenol 0, 1, 2, 3, 6 vagy 9 h. MMP-7 promóter aktivitásokat úgy határozzuk luciferáz assay. C, MGC-803 sejtek együtt transzfektált TAM67, PMMP-7 és pRL-TK indukálódtak 10 jiM izoproterenol. MMP-7 promóter tevékenységet elemezzük luciferáz vizsgálati eljárás. D, MGC-803 sejteket stabilan expresszáló shRNS célzási c-Jun (MGC-803 /c-Jun-SH) jöttek létre, és a c-Jun-expressziót analizáltuk Western-blottal. E, MMP-7 promóter aktivitásokat vizsgáltuk MGC-803 /c-Jun-SH sejteket stimulálás után 10 jiM izoproterenol 0, 1, 2, 3, 6 vagy 9 h. F, MMP-7-expressziót analizáltuk MGC-803 /c-Jun-SH sejteket stimulálás után 0, 2 vagy 10 jiM izoproterenol, ill. G, a kifejező plazmidok a c-Jun és az STAT3C t transzfektáltunk MGC-803 /c-Jun-SH sejtekben, ill. MMP-7 promóter tevékenységek analizáltuk luciferáz assay.
Annak igazolására, izoproterenol-indukált MMP-7 expresszióját vezérli az AP-1, akkor majd vizsgálni, hogy a transzaktivációs az MMP-7-promoter által indukált isoproterenol gátolható egy domináns negatív c-Jun mutáns TAM67, amelyből hiányzik a c-Jun-5'-transzaktiváló domén, de rendelkezik egy funkcionális c-Jun leucin cipzár és DNS-kötő domén. Miután tranziens transzfekciót TAM67 figyelembe MGC-803-sejtek, izoproterenol-indukált transzaktiváló az MMP-7-promoter analizáltuk luciferáz vizsgálati eljárásokban. Ábrán látható. 4C, a kifejezés a domináns negatív c-Jun mutatott feltűnő visszafogja a MMP-7 promóter tevékenységét. Annak további igazolására, kritikus szerepe az AP-1, azt teszteltük, hogy blokkolja az endogén módon expresszált c-Jun képes gátolni a MMP-7. Az MGC-803 /c-Jun-sh sejteket hoztak létre (ábra. 4D) és az MMP-7 promóter tevékenységet elemezzük luciferáz vizsgálati eljárás. Az adatok ábra. 4E azt mutatták, hogy a tevékenységét MMP-7 promoter feltűnően csökken knock-down c-Jun kifejezést. Western-blot elemzés azt is bizonyította, hogy a isoprotereol-indukált MMP-7-expresszió jelentősen csökkent MGC-803 /c-Jun-SH sejtekben, míg a lényegében nagy mennyiségű MMP-7 fehérje kimutatható volt a szülői sejtekben után isoproterenol stimulálás (ábra. 4F). Figyelemre méltó, hogy a túlzott expressziója exogén c-Jun drámaian felújított MMP-7 promóter tevékenységek MGC-803 /c-Jun-sh sejtekben, de alapvetően aktivált STAT3 mutáns STAT3C csak minimálisan aktivált MMP-7 promóter, ha c-Jun kifejezés elcsendesült (ábra . 4G). Ezek az adatok azt bizonyították, hogy az AP-1 domináló izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió.
C-jun és STAT3 szinergisztikusan szabályozzák az MMP-7-expresszió válaszul isoproterenol stimulálás
Együttműködési a STAT3 és c-Jun szabályozásában a különböző gén transzkripciós számoltak be. A mi korábbi tanulmány azt bizonyítja, hogy az aktiválás az MMP-9-promoter függ a kölcsönhatás a Stat3 és az AP-1 [44]. Amint fentebb említettük, izoproterenol stimulálás által indukált aktiválását STAT3 és AP-1 egyszerre. Azt gondolták, hogy a Stat3 és AP-1 lehet szinergikusan részt szabályozásában isoproterenol stimulált MMP-7 expresszió. Azt is jelezték, hogy az AP-1 együttműködik a STAT3 interleukin 6-indukálta transzaktiváló az IL-6 válasz elem hiányában közvetlen AP-1 DNS kötő [45]. Ez arra ösztönzött minket, hogy teszteljék a lehetséges együttműködési kötődését AP-1 /STAT3 az AP-1-helyet.
Annak meghatározásához, hogy STAT3 és AP-1 lehet felvenni, hogy az AP-1-helyet MMP-7 promóter in vivo , MGC-803 sejteket stimulálunk 10 pM izoproterenol 0, 2,5 vagy 4 óra, ill. A kromatin DNS /nukleáris protein komplexek voltak készülve és kötelező STAT3 és c-Jun az AP-1-helyet elemeztük ChIP vizsgálatokban. A PCR-terméket kiválasztott amplifikálására terjed a -76 165 régió hordozzák az AP-1-helyet MMP-7 promóter. Az immunprecipitációs anti-STAT3 és anti-c-Jun antitestek, majd PCR-rel kapjuk a várt 241 bp sávot a kicsapó után isoproterenol stimulálás 2,5 órán át. Az intenzitás ezen sávok gyengültek 4 óra után. Ezzel szemben, a nem stimulált kontroll sejtek nem kötődését STAT3, hogy ezen az oldalon volt megfigyelhető, és a kötődés a c-Jun alig kimutatható. Nem sáv amplifikáltuk immunprecipitációnak nyúl IgG (ábra. 5A). Az adatokat is megerősítette real-time PCR (ábra. 5B). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az egyesület a STAT3 és c-Jun MMP-7 promóter in vivo katalógusa specifikus volt, és hogy az isoproterenol stimulálás által indukált kötődését STAT3 /c-Jun az AP-1 elem. 5. ábra c-Jun és STAT3 szinergisztikusan szabályozzák az MMP-7-expressziót. Az A és B, MGC-803 sejteket stimulálunk 10 pM izoproterenol 0, 2,5 vagy 4 óra, ill. A kromatin DNS /nukleáris protein komplexek állítottuk elő. Kötődése STAT3 és a c-Jun, hogy az AP-1-helyet analizáltuk a immunprecipitációval anti-STAT3 és anti-AP-1 antitestek, majd PCR-rel (A) és a valós idejű PCR-t (B). C, MGC-803-sejteket kezeltünk 10 jiM izoproterenol 0 vagy 2,5 h. A nukleáris kivonatot készítettünk egy Nukleáris citoszoija Extraction Kit. β-tubulin és AP-2α analizáltuk Western-blot-, hogy megvizsgálja a szétválasztása citoplazmatikus és nukleáris fehérjéket. C, citoszol fehérjék; N, nukleáris fehérjék. D, 200 ug a nukleáris extraktumok át inkubáljuk 4 ° C-on 4 órán át a biotinilezett oligonukleotidot tartalmazó AP-1 konszenzus szekvencia korábban kapcsolt Dynabeads M-280 jelenlétében vagy hiányában egy, öt vagy 15-szeres mennyiségű kettős -stranded oligonukleotid versenytársai. Inkubációs a nukleáris fehérjék a kettős-szálú oligonukleotidot tartalmazó mutált AP-1-helyet (Mut Oligo), vagy a nem-specifikus kettős szálú oligonukleotidok (NS oligo) használtunk kontrollként. A fehérje /DNS komplexeket elválasztva Dynal mágnes, és SDS-PAGE. STAT3 és c-Jun detektáltuk Western-blot-anti-STAT3 és anti-c-Jun antitesteket. E és F, MGC-803 sejteket együtt transzfektáltunk a plazmidokkal PMMP-7 mA és pCDNA3.1 /c-Jun vagy STAT3C és a luciferáz aktivitásokat vizsgáltuk.
További jellemzése a kölcsönhatás a STAT3 /c-Jun a AP-1-helyet, végeztünk egy DNS affinitás csapadék vizsgálatban. Miután MGC-803-sejteket kezeltünk izoproterenol 2,5 órán, a nukleáris kivonatot állítottunk elő, és annak minőségét értékeltük (ábra. 5C). A biotinilált oligonukleotidot megfelelő -74 és -52 régióját MMP-7 promóter inkubáltuk 200 ug nukleáris kivonatok legördülő vizsgálatokban. A sztreptavidinnel bevont mágneses gyöngyöt kicsapáshoz használt biotinnal jelzett kettős szálú oligonukleotidok és a kapcsolódó DNS-kötő fehérjék. A kötelező a nukleáris fehérjék a biotinilezett oligonukleotidok elemeztük jelenlétében egy, öt, vagy 15-szeres mennyiségű kétszálú oligonukleotid versenytársak tartalmazó AP-1 konszenzus szekvenciákat. Inkubációs a nukleáris fehérjék a kettős-szálú oligonukleotidot tartalmazó mutáns AP-1-helyet, vagy nem-specifikus kettős szálú oligonukleotidok használtunk kontrollként. A kapott DNS-protein komplexek SDS-PAGE, majd Western-blot és az anti-c-Jun és az anti-STAT3 antitesteket. Az egyesület mindkét transzkripciós faktorok az oligonukleotidokat tartalmazó AP-1 konszenzus szekvenciák lehetett világosan kimutatni a nukleáris kivonatok izoproterenol-stimulált sejtekben, de nem a nem-stimulált sejtekben. A verseny tizenöt szeres mennyiségű versenyzők teljesen eltörölte a kialakulását a biotinilált DNS /fehérje komplexek (ábra. 5D). Nem kötelező a c-Jun és STAT3, hogy vagy az oligonukleotid, amely egy mutáns AP-1-helyet vagy nem specifikus oligonukleotidok volt kimutatható (ábra. 5D). Ez a kísérlet szolgáló in vitro bizonyíték arra, hogy a STAT3 és a c-Jun, alatt katekolamin stimuláció, fizikailag kölcsönhatásba, és kötődnek a AP-1-helyet, hogy elérjék transzaktivációs az MMP-7 gén gyomor rákos sejtekben.
Kimutattuk, hogy izoproterenol indukált MMP-7 promóter aktiválás nem zavarta a mutagenezis a mag-szekvenciák mindhárom STAT3 oldalak, ami arra utal, hogy a STAT3 elemek nem járhat el izoproterenol-indukált MMP-7 gén transzkripciót gyomor rákos sejtekben. Annak további igazolására, a szerepe az AP-1 elem, a plazmid PMMP-7 mA volt kotranszfektáljuk MGC-803 sejtek vagy pCDNA3.1 /c-Jun vagy STAT3C, ill. Érdekes, hogy a mutáció az AP-1 kötőhely alaposan blokkolta az aktiválás az MMP-7-promoter a transzfektált sejtekben overexpresszáló vagy a c-Jun vagy STAT3C (ábra. 5E és 5F), jelezve, hogy az AP-1-helyet egy fontos szabályozó eleme és a szinergikus szabályozás izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió STAT3 és AP-1 támaszkodik az elem.
β2-AR és MMP-7-ben kolokalizált gyomorkarcinómában szövetekben
overexpressziója MMP-7-et gyakran az invazív elülső humán gyomorrák és közvetlenül kapcsolódó prognózis betegeknél gyomorrák. Vizsgálni a korreláció β2-AR szinten MMP-7 expresszió humán gyomorrák, gyűjtöttünk öt gyomorrák szövetminták és elemezte a kifejezése β2-AR és MMP-7 immunhisztokémiai címkézés. Érdekes, hogy az erős expresszióját β2-AR és MMP-7 felmerült az ugyanabban a régióban a tumor szövetekben (a 6A.), Ami arra utal, hogy egy bensőséges kapcsolatot között az MMP-7 és β2-AR. Ahhoz, hogy tovább vizsgáljuk a szerepe az MMP-7 és β2-AR a metasztázis gyomorrák, elemeztük a kifejezés MMP-7 és β-AR a rákos, peri-rákos és metasztatikus szöveteket beteg gyomorrák. Ábrán látható. 6B, a kifejezés a β1-AR, β2-AR és MMP-7 fehérje szinten magasabb volt rákos szövet, mint a peri-rákos szövet. Azonban, a legmagasabb expressziós közülük találtak a metasztatikus szövetben. Sőt, az MMP-7-mRNS-t is túltermelõdik a metasztatikus szövetekben (ábra. 6C). Ezek az adatok erősen utalnak szoros kapcsolat között az MMP-7, β2-AR, valamint az áttétek a gyomorrák. 6. ábra β2-AR és MMP-7-ben túltermelõdik gyomorrák szövetekben. Egy öt gyomorrák szöveti mintákat gyűjtöttünk. A kifejezés a β2-AR és MMP-7-ben analizáltuk immunhisztokémiai. B, a kifejezés a MMP-7, β1-AR és β2-AR-a rákos, peri-rákos és metasztatikus szövetekben analizáltuk Western-blottal. C szint MMP-7 mRNS a rákos, peri-rákos és metasztatikus szövetek elemeztük real-time PCR. Katalógusa Megbeszélés katalógusa Jelen tanulmány azon a feltételezésen alapul, hogy a pszichoszociális stressz lehet egy hajlamosító tényező a gyomorrák. A stressz, szorongás és a depresszió is okozhat összetett élettani és neuroendokrin változásokat, amelyek befolyásolják több rendszer, beleértve az emésztőrendszerben. A rákos betegek sokszor jelentős érzelmi stressz. Az egyesület a fiziológiai stressz magassági gyomorsav és a hasfájás már régóta észrevette [46, 47]. Leírták, hogy a krónikus stressz súlyosbíthatja gyomorfekély. Egy, a közelmúltban lakossági alapú felmérés beiratkozott 2014 témák, stressz volt tekinthető a legerősebb kockázati tényező a gyomorrák [48]. Az eredmények kísérleti vizsgálatok arra utalnak, hogy megnövekedett aktivitását a szimpatikus idegrendszer képezhet az elsődleges mechanizmus, amely révén a fiziológiai tényezők hatása a génexpresszió tumorokban [49]. Jelenleg a legtöbb vizsgáló mechanizmusok összekötő stressz és a rák progressziója, hogy a tárgyat a közvetett hatások révén immunszuppresszió [8]. A közelmúltban több tanulmány, stresszel kapcsolatos fehérjék és reakcióútjaiként közvetlenül kapcsolódó viselkedési változást a rosszindulatú sejtek [10-17]. Van azonban kevés adat lehatároló szerepet játszó molekuláris mechanizmusok.
A jelen tanulmányban, azonosítottunk fokozott MMP-7 expresszió a gyomor rákos sejtvonalak, válaszul a stimuláció stresszel kapcsolatos hormon katekolamin. Úgy becsülik, hogy a koncentráció a katekolamin lehet több, mint 100-szor magasabb a tumor mikrokörnyezetében, mint a normális szövetekben és a keringő plazmában. MMP-7 egyedülálló a korlátozott expressziója a tumorsejtekben, jelezve, hogy az MMP-7-expresszió a tumor-asszociált formában. Észrevettük, hogy isoproterenol stimulálás jelentősen serkentő szabályozás MMP-7 expresszió mRNS és fehérje szint gyomor rákos sejteket. β2-AR antigonist hatékonyan megszüntette izoproterenol-indukált MMP-7 expresszió up-szabályozás, ami arra utal, hogy β2-AR-közvetített útvonal részt vesz a folyamatban.
MMP-7 expresszióját szigorúan ellenőrzött, a transzkripciós szinten. A mi korábbi tanulmány kimutatta, hogy a heregulin-β-indukált MMP-7 expresszióját szabályozzák a HER2-közvetített STAT3 és AP-1 aktiváció humán emlőrák sejtvonal [42, 43]. Azt is azonosították a funkcionális AP-1 és STAT3 kötőhelyek az első 350 bp-t a transzkripciós starthely a humán MMP-7 promóter [42, 43]. Egy másik tanulmány azt mutatta, hogy az FGF-2 képes közvetlenül upregulate MMP-7 gén expresszióját humán tumor sejtvonalat és köldökvéna endoteliális sejtek révén AP-1 és STAT3 [50]. Egyre több bizonyíték támasztja alá, hogy a STAT3 erősen szolgál a központi szabályozó csomópont, amely több onkogén jelátviteli útvonal konvergál [51]. Aberráns aktiválása STAT3 bebizonyosodott, hogy kritikus szerepet játszanak a gyomorrák fejlesztés [52, 53]. Egy nemrégiben készült tanulmány és adataink fedetlen társulásáról catacholamine a STAT3 aktiváció petefészek- és emlőrák sejtekben [12, 13]. A jelen vizsgálatban kimutattuk, hogy izoproterenol stimuláció szembetűnően indukált aktiválását STAT3 gyomor rákos sejtek, implicating hogy katekolamin felgyorsíthatja a malignus progresszió gyomorrák. A publikált adatok is igazolták, hogy izoproterenol stimulált az MMP-2 és MMP-9 gyomorrák-sejtek főleg aktiváló STAT3. Azonban ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy az AP-1 jelenik meg egy nagyobb hatékonyságú, mint STAT3 az izoproterenol-indukált MMP-7 gén transzkripció és a STAT3 elemek voltak, nem funkcionális, mint hangtompító STAT3 expressziójának nem volt hatékony megelőzése izoproterenol-indukált MMP 7 expresszió és mutagenezis három STAT3 kötőhelyek nem elnyomják a transzaktivációját MMP-7 promóter válaszul izoproterenol indukció. Ezzel szemben, az AP-1-helyet és a c-Jun szabályozott ezt a folyamatot. Érdekes, STAT3 és a c-Jun azt találtuk, hogy kötődnek az egységes AP-1-helyet az MMP-7-promoter egyidejűleg, implicating, hogy a kölcsönhatás a két transzkripciós faktorok egyik kötőhely felelős izoproterenol-stimulált MMP-7 expresszió gyomorrák sejtekben. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Proteomikai módosulása Gyomor adenocarcinoma japán beteg
• A beteg gyomorrák peritoneális carcinomatosis intraperitoneálisan kemoterápia, aki túlélte több mint 5 éve kapó ismételt laparoszkópos vizsgálatok: a esetismertetés