Катехоламинов вверх регулирует экспрессию ММР-7 путем активации AP-1 и STAT3 в желудочном cancer

катехоламинов вверх регулирует экспрессию ММР-7 путем активации AP-1 и STAT3 при раке желудка
Аннотация
фоне
стресс, беспокойство и депрессия может вызвать сложные физиологические и нейроэндокринные изменения, что приводит к повышению уровня стресса, связанного гормона катехоламинов, которые могут представлять собой первичный механизм, с помощью которого ген физиологические факторы влияют экспрессии в опухолях. В настоящем исследовании мы изучали влияние катехоламинов стимуляции на ММР-7 экспрессии в клетках рака желудка и выяснены молекулярные механизмы до регуляции ММР-7 уровне катехоламинов через адренергического сигнального пути.
Результаты <бр> Повышенная экспрессия ММР-7 был идентифицирован как на мРНК, так и уровни белка в желудочном раковых клеток в ответ на стимуляцию изопротеренол. β2-AR antigonist эффективно аннулировал изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7. Активация STAT3 и AP-1 была заметно индуцируется изопротеренол стимуляции и AP-1 проявляли более высокую эффективность, чем STAT3 в изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7. Мутагенеза из трех участков связывания STAT3 в ММР-7 промотора не удалось подавить трансактивации ММР-7 промотора и глушителей экспрессию STAT3 не было эффективным в предотвращении изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7. Однако изопротеренол-индуцированной ММР-7 промотора действия были полностью исчезли, когда сайт AP-1 мутировали. STAT3 и C-Jun может физически взаимодействовать и связываться с сайта АР-1, подразумевающий, что взаимодействие обоих факторов транскрипции на сайте АР-1 отвечает за изопротеренол-стимулированного ММР-7 экспрессии в клетках рака желудка. Было установлено, что на участке, где β2-АР был сверхэкспрессируется и уровни MMP-7 и β 2-AR Экспрессия MMP-7 в желудочном раковых тканей были наибольшими в метастатического очага рака желудка.
Выводы
повышающая регуляция ММР-7 через выражение β2-AR-опосредованного сигнального пути участвует в инвазии и метастазирования рака желудка.
Предпосылки
рак желудка является второй наиболее распространенной основной причиной рака смерти, связанной с около 700 000 смертельных случаев каждый год [1, 2]. Одним из важных факторов в патогенезе рака желудка является хроническая инфекция с Helicobacter Pylori
[3]. Тем не менее, большинство инфицированных людей не развивается злокачественная опухоль и исход инфекции зависит от хозяина, экологических и других факторов [4]. Существует все больше доказательств поддержки роли психологического стресса в желудочном начала рака и развития [5]. Несколько эпидемиологических исследований показали, что психологические или поведенческие факторы стресса, могут ускорять прогрессирование рака желудка [6, 7]. Тем не менее, точный механизм, с помощью которого психологическое напряжение действует в прогрессии рака желудка остается неясной.
Стресс инициирует реакцию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (HPA), что приводит к увеличению уровня катехоламинов [8, 9]. Несколько исследований показали, что стимуляция катехоламинов мешает био поведения опухолевых клеток непосредственно, в основном за счет β 2-адренергических рецепторов (β2-AR) -опосредованной сигнальный путь [10-14]. Недавние наблюдения, указывающие на возможный механизм для прогрессирования рака яичников, носоглотки и рак поджелудочной железы показывают, что катехоламинов может модулировать экспрессию матриксных металлопротеиназ (MMP) -2 и MMP-9 по стромы и опухолевых клеток [15-17]. Это поднимает интересный вопрос, что психологический стресс может играть определенную роль в развитии и прогрессировании рака желудка путем модуляции экспрессии ММР через β2-AR-опосредованного сигнального пути.
Накопленные линии доказательств показывают, что ММР-7 участвует в инвазия и метастазы рака желудка [18-24]. ММР-7 является самым маленьким известным членом семейства ММР и обладает самой высокой внеклеточного матрикса (ЕСМ) -degradative активностью против различных компонентов ECM, включая эластин, желатин, вещества типа IV коллагена, фибронектина, витронектина, ламинин, энтактин, аггрекана и протеогликанов , среди ММР [25, 26]. Он также способен вызывая активацию каскада с ММР [27]. Уникальной особенностью ММР-7 является его ограниченной экспрессии преимущественно в эпителиальных клетках железистой ткани в том числе нормальной молочной железы, печени, поджелудочной железы, предстательной железы и перибронхиальных желез [28].
Было обнаружено, что ММР-7 избыточно экспрессируется в инвазивный раковые заболевания органов пищеварения, таких как пищеводного [29], желудка [30], поджелудочной железы [31, 32], ободочной и прямой кишки [33-35], печени [36] и другие органы. Уровень экспрессии ММР-7 в значительной степени связано с преобразованием опухолевых клеток, фенотипы агрессивных видов рака и стадии опухоли без прогрессирования [37], особенно при опухолях желудочно-кишечного тракта. Избыточная экспрессия ММР-7 часто идентифицируется в предраковых желудка поражений и наиболее желудочных карцином [18-21, 24, 38]. Положительная корреляция уровня MMP-7 с опухолевой инвазии стенки желудка, метастаз узла лимфы, перитонеального распространения и выживания больных раком желудка было документально подтверждено в ряде исследований [23]. ММР-7 была признана в качестве важного медиатора прогрессии рака и рассматривать в качестве независимого прогностического маркера для первичного рака желудка. Однако возможные молекулярные механизмы ММР-7 оверэкспрессии при раке желудка все еще в значительной степени неисследованной.
В настоящем исследовании мы изучали влияние катехоламинов стимуляции на ММР-7 экспрессии в желудочном линиях раковых клеток и выяснены молекулярные механизмы Повышающий регуляции ММР-7 уровня с помощью катехоламинов через адренергического сигнального пути.
Результаты
изопротеренол стимуляции вверх регулирует экспрессию ММР-7
было показано, что экспрессия ММР-9 в овариально рак был значительно повышена в опухолевых ассоциированных макрофагов у больных с повышенными депрессивными симптомами [15] и катехоламинов усиливал LPS-индуцированную экспрессию ММР в человеческих моноцитов [39]. Для того чтобы исследовать ли катехоламины ассоциированные с экспрессией MMP-7 в клеток рака желудка, мы впервые осматривал эффекты β-AR-агониста изопротеренола на транскрипцию гена ММР-7 в желудочном линиях раковых клеток ТЖК-27 и МГЦ-803 , Дозы катехоламинов, используемых в данном исследовании, были выбраны, чтобы отразить физиологические состояния этого гормона в опухоли [40, 41]. Полуколичественное и ПЦР в реальном времени анализ показал, что ММР-7 экспрессию на уровне транскрипции была низкой в ​​желудочном линиях раковых клеток. Когда клетки подвергали воздействию 10 мкМ изопротеренол в не содержащей сыворотки среде в течение 12 ч, ММР-7 уровней мРНК заметно увеличивалось в обеих клеточных линий (фиг. 1A и 1B). Для того, чтобы определить, приводит ли повышенный уровень MMP-7 мРНК к аналогичному увеличению производства белка, экспрессию ММР-7 в ТЖК-27 и MGC-803 клеток анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Как показано на рис. 1C, изопротеренол стимуляция приводит к значительному регуляцию экспрессии ММР-7 в ТЖК-27 и MGC-803 клеток. β2-AR, которая опосредует большинство эффектов катехоламинов, была обнаружена при раке молочной железы и яичников раковых клеток [11, 13]. Для того, чтобы уточнить роль β2-AR-опосредованной сигнализации в экспрессии ММР-7, мы использовали β-AR-антагонист пропранолол и селективный антагонист β2-AR ICI-118551, чтобы проверить, если эффект изопротеренола на экспрессию ММР-7 может быть подавлено. Наши данные показали, что лечение с помощью пропранолола и ICI-118,551 эффективно блокированного изопротеренол-стимулированного ММР-7 выражении (рис. 1D, верхняя панель). Затем мы исследовали, могут ли выражается β2-АР в клеток рака желудка. Данные показали, что экспрессия β 2-АР был обнаружен в трех желудочных раковых клеточных линиях, включая ТЖК-27, MGC-803 и MKN-45 (рис. 1D, нижняя панель). Эти данные указывают на то, что изопротеренол стимулировал продукцию ММР-7 в желудочном линиях раковых клеток, и что повышающая регуляция экспрессии ММР-7, изопротеренол, в основном вызвано β2-AR передачи сигналов. Рисунок 1 изопротеренол стимуляция вверх регулирует экспрессию ММР-7. А и В, ТЖК-27 и МГЦ-803 клетки инкубировали в течение ночи в среде без сыворотки и затем обрабатывают 2 или 10 мкМ изопротеренол, соответственно. Экспрессия ММР-7 мРНК анализировали с помощью ОТ-ПЦР (A) и ПЦР в реальном времени (B). С, ТЖК-27 клетки стимулировали 0, 1 или 2 мкМ изопротеренола и МГЦ-803 клеток с 0, 5 и 10 мкМ изопротеренол после сывороточного голодания. Экспрессия ММР-7 белка анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. D, клетки МГЦ-803 обрабатывали 10 мкМ пропранолола или 1 мкМ ICI-118,551 в течение 1 ч, а затем с 10 мкМ изопротеренола. экспрессия ММР-7 анализировали с помощью Вестерн-блоттинга (верхняя панель); выражение β 2-АР в MGC-803, MKN-45 и ГГК-27 клеток определяли с помощью Вестерн-блоттинга (нижняя панель).
изопротеренол вверх регулирует ММР-7 промоторной активностью и активирует STAT3 и AP-1 <бр> Для того, чтобы изучить молекулярные механизмы, с помощью которых катехоламинов вверх регулирует экспрессию ММР-7, мы сначала определить, если изопротеренол стимуляция может непосредственно влиять на ММР-7 промоторной активностью. Мы сконструировали плазмиду PMMP-7, содержащий ген-репортер люциферазы, приводимый в 340 п.н., ММР-7 фрагмента промотора (-296 - +44) (рис 2А.). Клетки МГЦ-803 трансфицировали PMMP-7 и эффект изопротеренола на ММР-7 активности промотора оценивали с помощью люциферазы анализов. Как показано на рис. 2B, после того, как изопротеренол стимуляции в течение 1 ч, люциферазы активность начинает расти и постепенно усиливается. Через 6 ч после облучения, MMP-7 промоутер мероприятия показали двукратное увеличение по сравнению с нестимулированных контрольными клетками, предполагая, что изопротеренол стимуляция может непосредственно вызвать трансактивации ММР-7 промотора. Рисунок 2 Isoproterenol вверх регулирует ММР-7 промоторной активностью и активирует STAT3 и АР-1. А, схематическое представление плазмиды PMMP-7, содержащего ген-репортер люциферазы, приводимый в 340 п.н., ММР-7 фрагмента промотора. SBE, STAT3 сайт; ABE, AP-1 сайт. Б, клетки МГЦ-803 совместно трансфицируют с PMMP-7 и PRL-ТЗ. После трансфекции в течение 48 ч, клетки инкубировали в среде без сыворотки в течение еще 24 ч, а затем стимулировали с помощью 10 мкМ изопротеренол в течение 0, 1, 2, 3, 6 или 9 ч соответственно. ММР-7 промотора действия оценивали с помощью люциферазы анализов. С и D, клетки МГЦ-803 обрабатывали 10 мкМ пропранолола в течение 1 ч, а затем 10 мкМ изопротеренол в течение 0, 15, 30, 60, 120 или 180 мин, соответственно. Фосфорилирование STAT3 и С-Jun анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с анти-фосфористой STAT3 и анти-люминофор-C-Jun кроличьих поликлональных антител. ISO, изопротеренол.
В нашем предыдущем исследовании [42, 43], мы идентифицировали сайт связывания AP-1 в позиции -67 до -61 и три STAT3 сайты связывания в позициях -137 до -122, -168 до -159 и -255 до -245 в ММР-7 промотора (рис. 2А). Мы также показали, что АР-1 и STAT3 связан с AP-1 и один из STAT3 (-137 до -122) участков, положительно регулирующих ММР-7 транскрипции. Недавнее исследование показало, что катехоламинов имеет потенциал для активации STAT3. Для исследования стимулирует ли катехоламинов ММР-7 транскрипции через активацию STAT3 и AP-1, мы проанализировали фосфорилирование STAT3 и С-Jun. Инжир. 2C показано, что изопротеренол вызвал фосфорилирование STAT3 после 30 мин стимуляции, достигая пика через 2 часа. Хотя активация с-Jun был медленным, инициированный через 60 мин, максимум фосфорилирования достигается через 2 ч, а (рис. 2D). Это означало, что изопротеренол стимуляция произвел β2-АР-опосредованный сигнал, который вызвал активацию STAT3 и АР-1.
STAT3 элемент ММР-7 промотора не требуется, и STAT3 недостаточно для изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7
для того, чтобы определить, является ли функциональны в изопротеренол-индуцированной ММР-7 транскрипции генов в STAT3 элементы, мы впервые предприняли мутагенез трех STAT3 участков через мутирует ядpо-последовательности STAT3 сайтов, основанных на PMMP-7 (рис. 3А) и построил плазмиду PMMP-7MS. Эту плазмиду трансфицируют в клетки МГЦ-803. После трансфекции в течение 48 ч, клетки инкубировали в среде без сыворотки в течение ночи и затем стимулировали с помощью 10 мкМ изопротеренол в течение 6 часов. Мы заметили, что удивительно, что мутации всех трех участков связывания STAT3 не имели заметное влияние на трансактивации ММР-7 промотора. Как показано на рис. 3B, люциферазные деятельность постепенно увеличивалась и приблизилась пик при 6 ч после облучения. Результат был очень подобен наблюдаемому в клетках, трансфицированных дикого типа ММР-7 промотора. Для того, чтобы определить роль STAT3 в этом событии, ГГК-27 и MGC-803 клетки трансфицировали pGeneSuppressor выражая shRNA таргетирования STAT3 и ГГК-27 /STAT3-ш и MGC-803 /установлены STAT3-ш клетки. Инжир. 3C показано, что экспрессия STAT3 было эффективно подавлено в обеих клетках. В соответствии с данными выше, изопротеренол-индуцированной ММР-7 промотора деятельность как представляется, не существенно подрывается в MGC-803 /STAT3-ш клеток (рис. 3D). Кроме того, изопротеренол-индуцированной ММР-7 экспрессию в обоих мРНК и уровня белка было не важно влияние глушителей экспрессии STAT3, как показано с помощью ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот (рис. 3Е, F и 3G). Результаты показали, что STAT3 элемент в ММР-7 промотора не требуется и STAT3 недостаточно для изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7. Рисунок 3 STAT3 элемент в ММР-7 промотора не требуется и STAT3 недостаточно для изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7. А, схематическое представление плазмиды PMMP-7MS, содержащей три мутированные участки STAT3 в положениях от -255 до -245, -168 до -159 и -137 до -122. Б, клетки МГЦ-803 совместно трансфицируют с PMMP-7MS и PRL-TK, голодали, а затем стимулировали с помощью 10 мкМ изопротеренол в течение 0, 1, 2, 3, 6 или 9 ч соответственно. ММР-7 промотора действия оценивали с помощью люциферазы анализов. C, ГГК-27 и MGC-803 клетки, стабильно трансфицированные pGeneSuppressor экспрессии STAT3 shRNA. Экспрессия STAT3 анализировали с помощью Вестерн-блоттинга в ТЖК-27 /STAT3-ш и MGC-803 /STAT3-ш клетки. D, ММР-7 промотора активность анализировали в МГЦ-803 /STAT3-ш клеток после стимуляции с помощью 10 мкМ изопротеренол в течение 0, 1, 2, 3, 6 или 9 ч соответственно. Е через G, ТЖК-27 /STAT3-ш и MGC-803 /STAT3-SH клетки стимулировали 2 мкМ или 10 мкМ изопротеренол, соответственно. Экспрессия ММР-7 анализировали с помощью RT-PCR (E), ПЦР в реальном времени (F) и Вестерн-блоттинга (G).
AP-1 играет важную роль в изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7 <бр> Приведенные выше данные было неожиданным, так как STAT3 может быть активирован с помощью изопротеренол стимуляции. Кроме того, в нашем предыдущем исследовании [42, 43], мы показали, что STAT3 и АР-1 принимали участие в регулировании Her2 сигнализации-опосредованную экспрессию ММР-7 в клетках рака молочной железы. Затем мы пытались исследовать вопрос о том AP-1 влияет на изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7. Клетки МГЦ-803 трансфицировали плазмидой PMMP-7MA, содержащей мутантный AP-1-сайт в положении -67 до -61 в ММР-7 промоторов и люциферазы деятельности, измеренной (рис. 4, а). Удивительно, изопротеренол-индуцированной ММР-7 промотора действия были полностью исчезли во всех временных точках (рис. 4, б), предполагая, что сайт АР-1 имеет решающее значение в изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7. Рисунок 4: AP-1 играет важную роль в изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7. А, схематическое представление плазмиды PMMP-7MA, содержащей мутантный AP-1-сайт в позиции -67 до -61. Б, клетки МГЦ-803 совместно трансфицируют с PMMP-7 мА и PRL-TK, голодали и затем стимулировали с помощью 10 мкМ изопротеренол в течение 0, 1, 2, 3, 6 или 9 ч соответственно. ММР-7 промотора действия оценивали с помощью люциферазы анализов. С, MGC-803 клетки совместно трансфицируют с TAM67, PMMP-7 и PRL-ТК индуцировали 10 мкМ изопротеренол. ММР-7 промотора активности анализируют люциферазы анализов. D, клетки MGC-803, стабильно экспрессирующие shRNA таргетирования с-Jun (MGC-803 /C-Jun-SH) были установлены и экспрессия с-Jun анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. Е, ММР-7 промотора активность анализировали в МГЦ-803 /C-Jun-Sh клеток после стимуляции с помощью 10 мкМ изопротеренол в течение 0, 1, 2, 3, 6 или 9 ч соответственно. F, экспрессия ММР-7 анализировали в MGC-803 /C-Jun-ш клеток после стимуляции 0, 2 или 10 мкМ изопротеренол, соответственно. G, плазмиды, экспрессирующие с-Jun и STAT3C трансфицировали в MGC-803 /C-Jun-ш клеток, соответственно. ММР-7 промотора активности анализируют люциферазы анализов.
Чтобы подтвердить изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7 управляется AP-1, мы затем исследовали, могут ли трансактивации ММР-7 промотора, индуцированный изопротеренол можно ингибировать доминантный отрицательный с-Jun мутант TAM67, который испытывает недостаток в C-Jun домен 5'-трансактивирующей но обладает функциональной с-Jun лейциновой молнии и ДНК-связывающий домен. После временной трансфекции с TAM67 в клетки МГЦ-803, изопротеренол-индуцированной трансактивации ММР-7 промотора анализировали с помощью люциферазы анализов. Как показано на рис. 4C, выражение доминирующего отрицательную С-Jun проявляли заметное сдерживающее влияние на ММР-7 промоторов деятельности. Для дальнейшей проверки критическую роль AP-1, мы проверили, экспрессировали ли блокирование эндогенно с-Jun может ингибировать экспрессию ММР-7. В MGC-803 /C-Jun-SH клетки были установлены (рис. 4) и ММР-7 промотор деятельности проанализированные люциферазы анализов. Данные, представленные на рис. 4E показал, что деятельность ММР-7 промотора были поразительно уменьшается нокдауна экспрессии с-Jun. Вестерн-блот-анализ также показал, что isoprotereol-индуцированную экспрессию ММР-7 заметно уменьшилась в MGC 803 /C-Jun-Sh клеток, в то время как, по существу, большое количество ММР-7 белок был обнаружен в родительских клетках после изопротеренол стимуляции (рис. 4F). Примечательно, что избыточная экспрессия экзогенного с-Jun резко восстанавливается ММР-7 промотора деятельности в MGC-803 /C-Jun-ш клеток, но конститутивно активированный STAT3 мутант STAT3C только минимально активированную ММР-7 промотор, когда экспрессия с-Jun был подавлен (рис . 4G). Эти данные показали, что AP-1 преобладают изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7.
C-Jun и STAT3 синергически регулируют экспрессию ММР-7 в ответ на изопротеренол стимуляции
сотрудничества Stat3 и С-Jun в регуляции различных транскрипции гена сообщалось. Наше предыдущее исследование показало, что активация ММР-9 промотора зависит от взаимодействия Stat3 и АР-1 [44]. Как уже упоминалось выше, изопротеренол стимуляция индуцированной активации STAT3 и АР-1 одновременно. Мы предположили, что Stat3 и АР-1 может синергически участвовать в регуляции изопротеренол-стимулированного экспрессии ММР-7. Было показано, что АР-1 взаимодействует с STAT3 в интерлейкин 6-индуцированной трансактивации элемент ответа IL-6 в отсутствие прямого АР-1 связывания ДНК [45]. Это побудило нас проверить возможное кооперативное связывание АР-1 /STAT3 на сайт АР-1.
Чтобы определить, является ли, что STAT3 и АР-1 может быть набраны на сайт АР-1 в ММР-7 промотора в естественных условиях , клетки МГЦ-803 стимулировали 10 мкМ изопротеренол для 0, 2,5 или 4 ч соответственно. Хроматина ДНК /ядерные белковые комплексы были подготовлены и связывание STAT3 и с-Jun на сайт AP-1, анализировали микросхемой анализов. Продукт ПЦР-амплификации выбран для простирается от -76 до +165 области укрывает сайт АР-1 в ММР-7 промотора. Иммунопреципитации с анти-STAT3 и анти-с-Jun антителами с последующей ПЦР дало ожидаемый диапазон 241 пар оснований из осадителей после изопротеренол стимуляции в течение 2,5 ч. Интенсивность этих полос были ослаблены после 4 ч. нет В отличие от этого, в стимулированных контрольных клетках не связывание STAT3 на этот сайт наблюдалось и связывание с-Jun едва обнаружим. Ни одна группа не была амплифицирована с помощью иммунопреципитации с использованием кроличьего IgG (фиг. 5А). Эти данные были подтверждены с помощью ПЦР в реальном времени (рис. 5, б). Эти данные показали, что ассоциация STAT3 и с-Jun с ММР-7 промотора в естественных условиях
был специфичным и что стимуляция изопротеренол индуцированное связывание STAT3 /C-Jun к элементу AP-1. Рисунок 5 с-Цзюнь и STAT3 синергически регулируют экспрессию ММР-7. А и В, клетки МГЦ-803 стимулировали 10 мкМ изопротеренол для 0, 2,5 или 4 ч, соответственно. ДНК хроматина /получали белковые комплексы ядерных. Связывание STAT3 и с-Jun на сайт AP-1, анализировали с помощью иммунопреципитации с анти-STAT3 и анти-АР-1 антителами с последующей ПЦР (А) и ПЦР в реальном времени (B). С клетки МГЦ-803 обрабатывали 10 мкМ изопротеренол 0 или 2,5 ч, соответственно. Ядерный экстракт был подготовлен с комплектом ядерных Цитозоль Extraction. β-тубулина и AP-2α анализировали с помощью Вестерн-блоттинга, чтобы исследовать разделение цитоплазмы и ядерных белков. C, цитозольных белков; N, ядерные белки. D, 200 мкг ядерных экстрактов инкубировали при 4 ° С в течение 4 ч с биотинилированных олигонуклеотидов, содержащих АР-1 консенсусной последовательности, ранее соединенный с Dynabeads М-280 в присутствии или отсутствии одного, пять или 15-кратном размере двойной -stranded конкуренты олигонуклеотида. Инкубация ядерных белков с двухцепочную олигонуклеотидов, содержащих мутантную AP-1-сайт (Мут олиго) или неспецифическими двухцепочечные олигонуклеотиды (NS олиго) использовали в качестве контроля. В /ДНК комплексы белок разделяли с магнитом Dynal, и подвергали SDS-PAGE. STAT3 и C-Jun, были обнаружены с помощью Вестерн-блоттинга с анти-STAT3 и анти-с-Jun антител. Е и F, MGC-803 клетки совместно трансфицируют плазмидами PMMP-7MA и pCDNA3.1 /C-Jun или STAT3C и люциферазы мероприятия анализировались.
Для дальнейшего характеризуют взаимодействие STAT3 /C-Jun с AP-1 сайт, мы провели ДНК осаждения сродством анализа. После того, как клетки MGC-803 обрабатывали изопротеренол в течение 2,5 ч, ядерный экстракт был подготовлен и его качество было оценено (рис. 5в). Биотинилированные олигонуклеотиды, соответствующие -74 до -52 области ММР-7 промотора инкубировали с 200 мкг ядерных экстрактов для раскрывающихся анализов. В стрептавидина магнитные гранулы были использованы для осаждения биотин-меченый двухцепочные олигонуклеотиды и связанных с ними ДНК-связывающих белков. Связывание ядерных белков с биотинилированных олигонуклеотидов анализируют в присутствии одного, пять, или 15-кратным количеством конкурентов двухцепочечных олигонуклеотидов, содержащих АР-1 консенсусные последовательности. Инкубация ядерных белков с двухцепочную олигонуклеотидов, содержащих мутантный АР-1-сайт или неспецифические двухцепочечные олигонуклеотиды использовали в качестве контроля. Полученные ДНК-белковые комплексы были решены с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга с анти-с-Jun и анти-STAT3 антител. Объединение обоих транскрипционных факторов с олигонуклеотидами, содержащими АР-1 консенсусные последовательности могут быть четко обнаружен в нуклеарных экстрактов из изопротеренола-стимулированных клеток, но не из стимулированных клеток. Конкуренция с пятнадцати количеством кратном конкурентов совершенно отменила формирование биотинилированных ДНК /белковых комплексов (рис. 5D). Нет связывания с-Jun и STAT3 либо олигонуклеотиды, содержащие мутантный AP-1-сайт или неспецифические олигонуклеотиды был обнаружен (рис. 5D). Этот эксперимент дает в пробирке доказательства, чтобы подтвердить, что STAT3 и С-июнь по катехоламинов стимуляции, может физически взаимодействовать и связываться с сайта AP-1 для достижения трансактивации ММР-7 гена в клетках рака желудка.
Мы показали, что изопротеренол индуцированная ММР-7 активация промотора не была нарушена мутагенез ядро-последовательностей всех трех STAT3 сайтов, предполагая, что STAT3 элементы не могут действовать в изопротеренол-индуцированной ММР-7 транскрипции генов в клетках рака желудка. Для дополнительной проверки роли АР-1 элемента, плазмиду PMMP-7mA котрансфицировали в клетки MGC-803 с любой из пкДНК3.1 /C-Jun или STAT3C соответственно. Интересно отметить, что мутации сайта АР-1 связывания полностью блокировали активацию ММР-7 промотора в трансфицированных клетках с гиперэкспрессией либо C-Jun или STAT3C (рис. 5Е и 5F), указывая, что сайт АР-1 является важным регуляторным элементом и синергетический регулирование изопротеренол-индуцированной экспрессии ММР-7 с помощью STAT3 и AP-1 опирается на этот элемент.
β2-AR и ММР-7 были локализуется в раковых тканях желудка
суперэкспрессия ММР-7 часто при инвазивной перед раком желудка человека и непосредственно связаны с прогнозом у больных раком желудка. Для изучения корреляции уровня β2-AR с выражением MMP-7 в развитии рака желудка человека, мы собрали пять образцов ткани рака желудка и анализировали экспрессию β 2-АР и ММР-7 с помощью иммуногистохимических маркировки. Интересно отметить, что сильное выражение β 2-АР и ММР-7 появились в той же области тканей опухоли (рис. 6А), что указывает на тесную связь между MMP-7 и бета 2-AR. Для дальнейшего изучения роли MMP-7 и β 2-АР в метастазирования рака желудка, мы проанализировали экспрессию MMP-7 и бета-АРС в раковыми, пери-раковыми и метастатических тканей от пациента с раком желудка. Как показано на рис. 6В, выражение β 1-АР, β 2-АР и ММР-7 на уровне белка в раковой ткани выше, чем в периоперационную раковой ткани. Тем не менее, самое высокое выражение их было найдено в метастатической ткани. Кроме того, ММР-7 мРНК также избыточно экспрессируется в метастатических тканях (рис. 6в). Эти данные убедительно предполагают тесную связь между ММР-7, β2-AR и метастазирование рака желудка. Рисунок 6 β2-AR и ММР-7 были избыточно экспрессируется в раковых тканях желудка. А, были собраны пять образцов рака желудка ткани. Выражение β 2-АР и ММР-7 анализировали с помощью иммуногистохимии. Б, экспрессия ММР-7, β1-АР и β2-АР в раковым перигородских раковыми и метастатических ткани анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. C, уровень ММР-7 мРНК в раковой, пери-раковых и метастатических тканях анализировали с помощью ПЦР в реальном времени.
Обсуждение
Настоящее исследование было основано на гипотезе о том, что психологический стресс может быть фактором, предрасполагающим при раке желудка. Стресс, тревога и депрессия может вызвать сложные физиологические и нейроэндокринные изменения, которые влияют на несколько систем, в том числе пищеварительной системы. Больные раком часто испытывают значительный эмоциональный стресс. Ассоциация физиологического стресса с повышением секреции желудочной кислоты и боли в животе уже давно было замечено [46, 47]. Сообщалось, что хронический стресс может усугубить язвы желудка. В недавнем населения на основе обследования обучающихся 2014 предметов, стресс считался самым мощным фактором риска в развитии рака желудка [48]. Результаты экспериментальных исследований позволяют предположить, что повышенная активность симпатической нервной системы может представлять собой первичный механизм, с помощью которого ген физиологические факторы влияют экспрессии в опухолях [49]. На сегодняшний день, большинство исследований, изучающих механизмы, связывающие развитие стресса и рака было связано с косвенными эффектами через иммуносупрессии [8]. В ряде недавних исследований, связанных со стрессом белков и путей были связаны непосредственно к поведенческому изменению злокачественных клеток [10-17]. Тем не менее, существует недостаток данных разграничивая молекулярных механизмов, участвующих.
В настоящем исследовании мы выявили повышенную экспрессию ММР-7 в желудочном линиях раковых клеток в ответ на стимуляцию связанных со стрессом гормонов катехоламинов. Подсчитано, что концентрация катехоламинов может быть в опухоли микроокружения в 100 раз выше, чем в нормальных тканях и циркулирующей плазмы. ММР-7 является уникальным в своем ограниченной экспрессии в опухолевых клетках, что свидетельствует о том, что экспрессия ММР-7 находится в моде ассоциированных с опухолью. Мы заметили, что изопротеренол стимуляция значительно повышающей регуляции экспрессии ММР-7 на обоих мРНК и уровня белка в клетках рака желудка. β2-AR antigonist эффективно аннулировал изопротеренол-индуцированной ММР-7 экспрессию повышающей регуляции, предполагая, что β2-AR-опосредованный путь участвует в процессе.
выражение ММР-7 жестко контролируется на уровне транскрипции. Наше предыдущее исследование показало, что херегулин-β-индуцированная экспрессия ММР-7 регулируется HER2-опосредованной активации STAT3 и АР-1 в клеточных линиях рака молочной железы человека [42, 43]. Мы также определили функциональные AP-1 и STAT3 сайты связывания в первой 350 п.н. сайта инициации транскрипции в человеческой ММР-7 промотора [42, 43]. Другое исследование показало, что FGF-2 может непосредственно повышать экспрессию гена ММР-7 в опухолевых клеточных линий человека и эндотелиальных клеток пупочной вены через AP-1 и STAT3 [50]. Накопленные данные убедительно подтверждают, что STAT3 служит в качестве центрального регулирующего узла, на котором несколько путей онкогенными сигнализации сходиться [51]. Аномальная активация STAT3 было доказано играть решающую роль в развитии рака желудка [52, 53]. Недавнее исследование, и наши данные обнаружили ассоциацию catacholamine с активацией STAT3 в яичниках и клеток рака молочной железы [12, 13]. В настоящем исследовании мы показали, что стимуляция изопротеренол заметно индуцирует активацию STAT3 в клеток рака желудка, подразумевающий, что катехоламинов может ускорить злокачественное прогрессирование рака желудка. Наши неопубликованные данные также показали, что изопротеренол стимулировали экспрессию ММР-2 и ММР-9 в клеток рака желудка, главным образом, за счет активации STAT3. Тем не менее, в этом исследовании мы обнаружили, что АР-1 проявляли более высокую эффективность, чем STAT3 в изопротеренол-индуцированной ММР-7 транскрипции генов и STAT3 элементы были нефункциональными, в качестве глушителей экспрессии STAT3 не было эффективным в предотвращении изопротеренол-индуцированной MMP- 7 экспрессия и мутагенеза трех сайтов связывания STAT3 не удалось подавить трансактивации ММР-7 промотора в ответ на индукцию изопротеренол. В отличие от этого, сайт AP-1 и C-Jun регулируется этот процесс. Интересно отметить, что STAT3 и C-Jun было обнаружено, связываются с одной AP-1 сайт в ММР-7 промотора одновременно, подразумевающий, что взаимодействие обоих транскрипционных факторов, на одном участке связывания отвечает за изопротеренол-стимулированного ММР-7 экспрессии при раке желудка клетки. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Протеомный изменения в желудочной аденокарциномы от японских пациентов
• Пациент с раком желудка с перитонеального карциноматозом обрабатывали внутрибрюшинной химиотерапии, котора…