Kateholamina se regulira MMP-7 izraz aktiviranjem AP-1 i STAT3 kod raka želuca

Kateholamina se regulira MMP-7 izraz aktiviranjem AP-1 i STAT3 kod raka želuca pregled apstraktne pregled pozadini pregled, stres, anksioznost i depresija može uzrokovati složene fiziološke i neuroendokrinih promjena, što je rezultiralo povećanjem razine povezane hormona stresa kateholamin, što može predstavljati primarni mehanizam kojim fiziološki faktori utječu ekspresije gena u tumorima. U ovom istraživanju, istražili smo učinke stimulacije kateholamina na MMP-7 ekspresije u želučanih stanica raka i razjašnjen molekularni mehanizmi u regulaciji MMP-7 razini kateholamina putem adrenergičkih signalnog puta. Pregled Rezultati
Povećana MMP-7 ekspresije je identificiran na razini mRNA i proteina u stanicama raka želuca kao odgovor na stimulaciju izoproterenola. β2-AR antigonist efektivno ukinuta Izoproterenol izazvanu MMP-7 izraz. Aktivacija STAT3 i AP-1, vidljivo je inducirana stimulacija izoproterenol i AP-1 pokazale su veću učinkovitost nego STAT3 isoproterenol inducirane MMP-7 ekspresije. Mutageneza tri vezna mjesta STAT3 u MMP-7 promotor nije uspio potisnuti transaktiviranje MMP-7 promotora i utišavanje STAT3 izraz nije bio učinkovit u sprječavanju Izoproterenol izazvanu MMP-7 izraz. Međutim, izoproterenol-inducirane MMP-7 promotorske aktivnosti potpuno nestala pri AP-1 mjesto mutirana. STAT3 i c-Jun fizički može komunicirati i vežu na AP-1 mjesta, što omogućava da se uzajamno djelovanje obaju transkripcijskih čimbenika na AP-1 mjesta je odgovoran za izoproterenol stimulirano MMP-7 ekspresije u želuca stanica raka. Ekspresija MMP-7 u želučanom tkivu raka je utvrđeno da je na mjestu gdje je prekomjerno β2-AR i razina MMP-7 i P2-AR bili najviši u metastatskim lokusa raka želuca. Pregled Zaključci
Up-regulaciju MMP-7 izražavanja kroz β2-AR-posredovane signalnog puta je uključen u invaziju i metastaziranje raka želuca. pregled Pozadina pregled, želučani karcinom je drugi najčešći vodeći uzrok raka se odnose na smrt, s oko 700 000 smrtnih slučajeva svake godine [1, 2]. Jedan od važnih čimbenika u patogenezi karcinoma želuca je kronična infekcija s Helicobacter pylori pregled [3]. Međutim, većina zaraženih osoba ne razvije malignosti i ishod infekcije ovise o domaćinu, ekološki i drugi čimbenici. [4] Postoji sve više dokaza podupire ulogu psihičkog stresa u želučanoj pojave raka i razvoja [5]. Nekoliko epidemioloških istraživanja pokazala su da psihološki ili ponašanja čimbenici stresa može ubrzati napredovanje raka želuca [6, 7]. Međutim, precizni mehanizam kojim psihološki stres djeluje na želučanu progresiju raka je nejasno. Pregled Stres započinje odgovor na hipotalamus-hipofiza-nadbubrežna os (HPA), što je rezultiralo povećanjem razine katekolamina [8, 9]. Nekoliko je studija pokazalo da stimulacija kateholamina interferira s bio-ponašanja stanica tumora izravno, uglavnom preko P2-adrenergičkih receptora (β2-ar) posredovano signalnog puta [10-14]. Nedavna istraživanja upućuju na potencijalne mehanizam za progresiju raka jajnika, nazofarinksa i gušterače raka pokazuju da kateholamin mogu modulirati ekspresiju matrične metaloproteinaze (MMP) -2 i MMP-9 pomoću strome i tumorskih stanica [15-17]. To postavlja zanimljivo pitanje da psihološki stres može igrati ulogu u razvoju i progresiji karcinoma želuca modulacijom ekspresiju MMP kroz β2-AR posredovanog signalnog puta.
Akumulirani linije dokaza pokazuju da MMP-7 je uključen u invazija i metastaza raka želuca [18-24]. MMP-7 najmanji poznati član obitelji MMP i posjeduje najvišu ekstracelularni matriks (ECM) -degradative aktivnost protiv raznih komponenti ECM, uključujući elastin, želatina, kolagen tipa IV, fibronektinom, vitronektinom, laminin, entactin, agrekana i proteoglikanima među MMP [25, 26]. To je također sposoban pokrenuti aktiviranje MMP kaskade [27]. Posebnost MMP-7 je skučene izraz pretežno u epitelnim stanicama žljezdanog tkiva, uključujući normalne dojke, jetre, gušterače, prostate i peribronchial žlijezde [28].
Nađeno je da MMP-7 je izraženo u invazivni rak probavnih organa, kao što su jednjaka [29], želuca [30], gušterače [31, 32], debelog crijeva [33-35], jetra [36] i drugih organa. Razina ekspresije MMP-7 značajno je povezana s transformacijom tumorskih stanica, fenotipova agresivnih karcinoma i stupnju napredovanja tumora [37], a posebno u tumorima gastrointestinalnog trakta. Unosom MMP-7 je često identificiran u premalignih želučanih lezija i većina želučanih karcinoma [18-21, 24, 38]. Pozitivna korelacija MMP-7 razina s tumorske invazije na želučanu stijenku, limfnih čvorova metastaza, peritonejsku širenje i opstanak oboljelih od raka želuca je dokumentirano u nekoliko studija [23]. MMP-7 je bio prepoznat kao važan medijator progresije raka i smatra se kao nezavisni prognostički biljeg za primarni karcinom želuca. Međutim, moguće molekularni mehanizmi MMP-7 prekomjernom ekspresijom u raka želuca su još uvijek u velikoj mjeri neistražen.
U ovom istraživanju ispitivali smo učinke stimulacije kateholamina na MMP-7 ekspresije u želučanom staničnim linijama karcinoma i razjašnjen molekularni mehanizmi up-regulaciji MMP-7 razini od strane kateholamina putem adrenergičkih signalnog puta. pregled Rezultati
izoproterenol stimulacije se regulira ekspresiju MMP-7 pregled pokazalo se da je ekspresija MMP-9 u jajnika rak je značajno povećana u tumora koji su povezani makrofagima u pacijenata s povišenim depresije [15] i kateholamina potencirati LPS-induciranu ekspresiju MMP u humanih monocita [39]. Da bi se istražilo da li kateholamina povezuje s ekspresije MMP-7 u želuca stanica karcinoma, prvo inspekciju učinke β-AR agonista izoproterenol na transkripciju MMP-7 gena u želučanom staničnim linijama raka HGC-27 i MGC-803 , Doze kateholamina korišteno u ovoj studiji odabrane su tako da odražava fiziološke uvjete ovog hormona u tumorima [40, 41]. Semi-kvantitativno i real-time PCR analiza pokazala je da je MMP-7 ekspresije na razini transkripcije bila je niska u želučanim staničnim linijama karcinoma. Kada su stanice izložene 10 uM izoproterenol u mediju bez seruma kroz 12 sata, MMP-7 mRNA razine su značajno povećala u obje stanične linije (sl. 1A i 1B). Kako bi se utvrdilo je li povećana razina MMP-7 mRNA dovodi do slične povećanje proizvodnje proteina, MMP-7 ekspresije u HGC-27 i MGC-803 stanicama analiziran je Western blot. Kao što je prikazano na slici. 1C, stimulacija izoproterenol rezultirala je značajnim doreguliranjem MMP-7 ekspresije u HGC-27 i MGC-803 stanicama. β2-AR, koji posreduje većine učinaka kateholamina, identificiran u stanicama raka jajnika [11, 13] dojke. Da pojasnimo ulogu β2-AR-posredovane signalizaciju u MMP-7 izraza, koristi se antagonista propranolol β-AR i selektivne β2-AR antagonist ICI-118551 za testiranje, ako je učinak izoproterenola na MMP-7 izražavanja može biti inhibiran. Naši podaci su pokazali da je tretman s propranolol i ICI-118,551 učinkovito blokiran izoproterenol stimulirano MMP-7 ekspresije (sl. 1d, gornji panel). Zatim smo ispitali da li β2-AR je izražen u želučanim stanicama raka. Podaci pokazuju da je ekspresija ß2-AR dokazivog tri želučanim staničnim linijama raka, uključujući HGC-27, MGC-803 i MKN-45 (Sl. 1D, donji prikaz). Ovi podaci pokazuju da izoproterenol stimulira proizvodnju MMP-7, u želučanim staničnih linija raka i da doreguliranje MMP-7 ekspresiju izoproterenol uglavnom potaknuta posredovanog prijenosa signala β2-AR. Slika 1 Izoproterenol stimulacija se regulira ekspresiju MMP-7. A i B, HGC-27 i MGC-803 stanice su inkubirane preko noći u mediju bez seruma, a zatim obradi s 2 do 10 uM izoproterenol, respektivno. Ekspresija MMP-7 mRNA je analiziran pomoću RT-PCR (A) i u realnom vremenu PCR (B). C, HGC-27 stanice su stimulirane s 0, 1 ili 2 uM izoproterenol i MGC-803 stanica s 0, 5 i 10 uM izoproterenol nakon izgladnjivanjem. Ekspresija MMP-7 protein je analiziran pomoću Western blot. D, MGC-803 stanice su tretirane s 10 uM propranolola ili 1 uM ICI-118,551 tijekom 1 h, a zatim sa 10 uM izoproterenola. MMP-7 ekspresija je analizirana pomoću Western blot (gornji prikaz); ekspresija ß2-AR MGC-803, MKN-45 i HGC-27 stanica je određeno 'Western blot (donji prikaz).
izoproterenol se regulira MMP-7 aktivnost promotora i aktivira STAT3 i AP-1
Kako istražiti molekularne mehanizme kojima kateholamin se regulira MMP-7 izraz, prvo odrediti ako je stimulacija izoproterenol može izravno utjecati na MMP-7 aktivnost promotora. konstruirali smo plazmida pMMP-7 sadrži luciferaza reporterski gen, a kojeg je 340 bp MMP-7 fragment promotora (-296 - 44) (Slika 2A).. MGC-803 stanice su transficirane s pMMP-7, a učinak na izoproterenol MMP-7 promotorsku aktivnost je određena testom luciferaze. Kao što je prikazano na slici. 2B, nakon izoproterenol stimulacije za 1 h, aktivnosti luciferaze počeo rasti i postupno povećana. U 6 sati nakon izlaganja, MMP-7 promotorske aktivnosti pokazali su preko dvostruko više povećanje u odnosu na nestimulirane kontrolnih stanica, sugerirajući da stimulacija Izoproterenol mogao izravno induciraju transaktiviranje MMP-7 promotora. Slika 2 Izoproterenol se regulira MMP-7 aktivnost promotora i aktivira STAT3 i AP-1. A, shematski prikaz plazmida pMMP-7 sadrži luciferaza reporterski gen pokreće 340 bp MMP-7, promoter fragment. SBE, STAT3 stranica; ABE, AP-1 stranica. B, MGC-803 stanice su kotransfektirane sa pMMP-7 i PRL-TK. Nakon transfekcije za 48 sati, stanice su bile inkubirane u mediju bez seruma kroz dodatnih 24 sati, a zatim stimulirane s 10 uM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ili 9 h, respektivno. MMP-7 promotorske aktivnosti su ocijenjeni od strane luciferaze testovima. C i D, MGC-803 stanice su tretirane s 10 uM propranolol tijekom 1 h, a zatim sa 10 uM izoproterenol za 0, 15, 30, 60, 120 ili 180 min. Fosforilaciju STAT3 i c-Jun je analiziran pomoću Western blota s anti-fosfor-STAT3 i anti-fosfor-c-Jun zečja poliklonalna protutijela. ISO, izoproterenol. Pregled U našoj prethodnoj studiji [42, 43], identificirali smo AP-1 vezno mjesto na položaju -67 do -61 i tri STAT3 veznih mjesta na pozicijama -137 do -122, -168 do -159 i -255 do -245 u MMP-7 promotor (sl. 2a). Također smo pokazali da AP-1 i STAT3 dužan AP-1 i jedan od STAT3 (-137 do -122) stranicama, pozitivno regulira MMP-7 transkripciju. Nedavna studija pokazala je da kateholamin ima potencijal za aktiviranje STAT3. Da bi istražili da li kateholamin stimulira MMP-7 transkripciju preko aktivacije STAT3 i AP-1, analizirali smo fosforilaciju STAT3 i c-jun. Sl. 2C pokazali da izoproterenol izazvao fosforilaciju STAT3 nakon 30 min stimulacije, dosežući vrhunac na 2 sata. Iako aktivacija c-Jun bio je spor, započinje na 60 minuta, najviše fosforilacija postignuta na 2 sata i (Sl. 2d). To je značilo da stimulacija izoproterenol proizvela β2-AR-posredovanu signal koji je pokrenuo aktivaciju STAT3 i AP-1. Pregled STAT3 element MMP-7 promotora nije potrebna i STAT3 nije dovoljna za izoproterenol induciranu MMP-7 ekspresije
da bi se utvrdilo jesu li STAT3 elementi su funkcionalni u Izoproterenol izazvanu MMP-7 transkripcije gena, prvo je preuzela mutageneza tri STAT3 stranice putem mutira osnovne-sekvenci STAT3 stranice na temelju pMMP-7 (Sl. 3A) i konstruirao plazmida pMMP-7mS. Plazmid je unesen u MGC-803 stanicama. Nakon transfekcije za 48 sati, stanice su bile inkubirane u mediju bez seruma preko noći, a zatim stimulirane s 10 uM izoproterenol 6 h. Primijetili smo, iznenađujuće, da mutacija svih triju STAT3 veznih mjesta nema značajan učinak na transaktivaciju MMP-7 promotora. Kao što je prikazano na slici. 3b, luciferaze aktivnosti postupno povećava i prilazi pik na 6 sati nakon izlaganja. Rezultat je bio vrlo sličan onome u stanicama koje su transfektirane sa divljim tipom MMP-7 promotora. Kako prepoznati ulogu STAT3 u ovom slučaju, HGC-27 i MGC-803 stanice su transficirane pGeneSuppressor izražavajući shRNA ciljanje STAT3 i HGC-27 /STAT3-SH i MGC-803 /STAT3-sh stanice uspostavljena. Sl. 3C pokazali su da je ekspresija STAT3 učinkovito se potiskuje u obje stanice. U skladu s gore navedenim podacima, izoproterenol izazvanu MMP-7 promotorske aktivnosti pojavio ne bi se značajno umanjena u MGC-803 /STAT3-SH stanicama (Sl. 3D). Nadalje, izoproterenol izazvanu MMP-7 ekspresije na razini mRNA i proteina nije važnije utjecati na stišavanje buke STAT3 izražavanja kao što je prikazano pomoću RT-PCR, real-time PCR i Western blot (Sl. 3E, F i 3G). Rezultati su pokazali da STAT3 element MMP-7 promotora nije potrebna i STAT3 nije dovoljna za izoproterenol induciranu MMP-7 ekspresije. Slika 3 STAT3 element u MMP-7 promotora nije potrebna i STAT3 nije dovoljna za izoproterenol induciranu MMP-7 ekspresije. A, shematski prikaz plazmida pMMP-7mS sadrži tri mutirane STAT3 mjesta na pozicijama -255 do -245, -168 do -159 i -137 do -122. B, MGC-803 stanice su kotransfektirane sa pMMP-7mS i PRL-TK, izgladnjivani, a zatim stimulirane s 10 uM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ili 9 h, respektivno. MMP-7 promotorske aktivnosti su ocijenjeni od strane luciferaze testovima. C, HGC-27 i MGC-803 stanice su stabilno transficirane pGeneSuppressor izražavanje STAT3 shRNA. Ekspresija STAT3 analiziran je Western blot u HGC-27 /STAT3-sh i MGC-803 /STAT3-SH stanicama. D, MMP-7 promotorske aktivnosti je izmjerena u MGC-803 /STAT3-SH stanicama nakon stimulacije s 10 uM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ili 9 h, respektivno. E do G, HGC-27 /STAT3-sh i MGC-803 /STAT3-SH stanice su stimulirane sa 2 uM do 10 uM izoproterenol, respektivno. Ekspresija MMP-7 je analiziran pomoću RT-PCR (E), real-time PCR (F) i Western blot (G).
AP-1 ima ključnu ulogu u Izoproterenol izazvanu MMP-7 izražavanja
gornji podaci bio neočekivan, jer STAT3 mogla biti aktivirana stimulacije izoproterenol. Osim toga, u našem prethodnom istraživanju [42, 43], pokazali smo da STAT3 i AP-1 je sudjelovao u reguliranju Her2 signalno-posredovane MMP-7 ekspresija u stanicama raka dojke. Nakon toga smo nastojali istražiti da li AP-1 utječe izoproterenol izazvanu MMP-7 izraz. MGC-803 stanice su transficirane s plazmidom pMMP-7mA sadrži mutirani AP-1 mjesto na položaju -67 do -61 na aktivnost MMP-7 promotora i aktivnosti luciferaze mjerena (Sl. 4A). Iznenađujuće, izoproterenol inducirane MMP-7 promotorske aktivnosti potpuno nestao u svim vremenskim točkama (sl. 4B), sugerirajući da je AP-1 mjesto bilo presudno isoproterenol inducirane MMP-7 ekspresije. Slika 4 AP-1 igra važnu ulogu u izoproterenol inducirane MMP-7 ekspresije. A, shematski prikaz plazmida pMMP-7mA sadrži mutirani AP-1 mjesto na položaju -67 do -61. B, MGC-803 stanice su kotransfektirane sa pMMP-7mA i PRL-TK, izgladnjele i zatim stimulirane s 10 uM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ili 9 h, respektivno. MMP-7 promotorske aktivnosti su ocijenjeni od strane luciferaze testovima. C, MGC-803 stanice kotransfektiraju sa TAM67, pMMP-7 i pRL-TK su inducirane s 10 uM izoproterenola. MMP-7 promotorske aktivnosti su analizirani luciferazom testovima. D, MGC-803 stanice koje stabilno eksprimiraju shRNA ciljanje c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) utvrđeni su i c-Jun ekspresija je analizirana pomoću Western blot. E, MMP-7 promotorske aktivnosti je izmjerena u MGC-803 /c-Jun-SH stanicama nakon stimulacije s 10 uM izoproterenol za 0, 1, 2, 3, 6 ili 9 h, respektivno. F, MMP-7 ekspresija je analizirana u MGC-803 /c-Jun-SH stanicama nakon stimulacije s 0, 2 ili 10 uM izoproterenol, respektivno. G, plazmida koji eksprimiraju c-Jun i STAT3C su transfektirani u MGC-803 /c-Jun-SH stanicama, respektivno. MMP-7 promotorske aktivnosti su analizirani luciferazom testovima.
Za potvrdu izoproterenol inducirane MMP-7 ekspresije kontrolira AP-1, a zatim se ispituje je li transaktivacija MMP-7 promotora inducirana izoproterenol može biti inhibirana dominantna negativni c-Jun mutant TAM67, koji nema c-Jun 5'-transaktivaciju domena ali posjeduje funkcionalnu c-jun leucinski zatvarač i domene DNA-vezivanja. Nakon prijelazne transfekcije s TAM67 u MGC-803 stanicama, izoproterenol inducirana transaktivacija MMP-7 promotora analizirana je luciferazom testovima. Kao što je prikazano na slici. 4C, izraz dominantnog negativnog c-Jun izložena upadljivo prigušivanje učinak na MMP-7 promotorske aktivnosti. Dalje verifikacije ključnu ulogu AP-1, ispitali smo može li blokiranje endogeno izlučeni c-Jun može inhibirati ekspresiju MMP-7. U MGC-803 /c-Jun-SH stanice su uspostavili (Sl. 4d) i MMP-7 promotorske aktivnosti analiziraju luciferaze testovima. Podaci na Slici. 4E pokazali da su aktivnosti MMP-7 promotora su izrazito smanjena za knock-down c-Jun izražavanja. Western blot analiza je pokazala da isoprotereol inducirane MMP-7 ekspresije značajno je smanjena u MGC-803 /c-Jun-SH stanicama, dok u biti velika količina MMP-7 proteina je otkriven u roditeljskim stanicama nakon stimulacije izoproterenol (Sl. 4F). Posebice, prekomjerna ekspresija egzogenog c-Jun značajno vratiti MMP-7 promotorske aktivnosti MGC-803 /c-Jun-SH stanicama, ali konstitutivno aktiviran STAT3 mutant STAT3C samo minimalno Aktivirani MMP-7 promotor, kada c-Jun je ekspresija silenced (Sl . 4G). Ti podaci pokazali da AP-1 dominiraju izoproterenol inducirane MMP-7 ekspresije. Pregled c-Jun i STAT3 sinergistički reguliraju ekspresiju MMP-7, kao odgovor na stimulaciju izoproterenol
suradnju Stat3 i c-Jun u regulaciju različitih transkripciju gena je bio prijavljen. Naša prethodna studija pokazuje da aktivacija MMP-9 promotor ovisi o interakciji Stat3 i AP-1 [44]. Kao što je spomenuto, stimulacija izoproterenol inducira aktivaciju STAT3 i AP-1 istovremeno. Nagađa smo da STAT3 i AP-1 može sinergijski sudjelovati u regulaciji Izoproterenol-stimulirana MMP-7 izražavanja. Ima naznaka da AP-1 surađuje s STAT3 u interleukin 6-induciranu transaktivaciju elementa odgovora IL-6 u odsustvu izravne AP-1 DNA za vezanje [45]. To nas je potaknulo da se testirati moguća zadruga vezivanje AP-1 /STAT3 do AP-1 stranice.
Bi se utvrdilo da li da STAT3 i AP-1 može biti primljen na AP-1 stranice u MMP-7 promotora in vivo , MGC-803 stanice su stimulirane s 10 uM izoproterenol za 0, 2,5 ili 4 h, respektivno. Kromatin DNA /nuklearne kompleksa proteina su pripravljeni i vezanje STAT3 i c-Jun na AP-1 mjesta analizirana je chip analiza. PCR produkt amplifikacije bira proteže od -76 do 165 regiju koja nosi AP-1 mjesto na MMP-7 promotora. Imunoprecipitaciji s protu-STAT3 i anti-c-Jun antitijela zatim PCR da bi se dobio očekivani 241 bp band iz taloženje nakon stimulacije izoproterenol 2.5 h. Intenziteti tih bendova su oslabile nakon 4 sata. Nasuprot tome, u nestimulirane kontrolne stanice bez vezivanja STAT3 za ove stranice se uočava i vezanje c-Jun jedva mjerljive. Ne band je pojačan pomoću imunoprecipitacije korištenjem zečjeg IgG (Sl. 5A). Podaci su potvrđeni u realnom vremenu PCR (Sl. 5B). Ovi podaci pokazuju da je udruga STAT3 i c-jun s MMP-7 promotora in vivo pregled je bio specifičan i da stimulacija izoproterenol izazvana vezanje STAT3 /c-Jun na AP-1 element. Slika 5 c-Jun i STAT3 sinergistički reguliraju MMP-7 ekspresije. A i B, MGC-803 stanice su stimulirane s 10 uM izoproterenol za 0, 2,5 ili 4 h, respektivno. Kromatin DNA /nuklearni kompleks proteina su pripremljeni. Vezanje STAT3 i c-Jun na AP-1 mjesta analizirana je imunoprecipitaciji s protu-STAT3 i anti-AP-1 antitijela i zatim PCR (A) i u realnom vremenu PCR (B). C, MGC-803 stanice su tretirane s 10 uM izoproterenol za 0 ili 2.5 h, respektivno. Nuklearni Ekstrakt je pripremljena sa nuklearnih citosolu Extraction Kit. β-tubulina i AP-2α su analizirane Western blot ispitivanje razdvajanje citoplazmatske i nuklearnih proteina. C, citoplazmatski protein; N, proteina jezgre. D, 200 ug nuklearnih ekstrakata se inkubira na 4 ° C tijekom 4 h s biotiniliranim oligonukleotida sadrži AP-1 konsenzus sekvencu prethodno vezan za Dynagranule M-280, u prisutnosti ili odsutnosti jedan, pet ili 15 puta količine dvostruko -stranded oligonukleotidne natjecatelja. Inkubacija nuklearnih proteina s oligonukleotida dvolančane sadrže mutirani AP-1 mjesto (Mut oligo) ili nespecifične dvolančane oligonukleotida (NS oligo) korištena je kao kontrola. Proteinski /DNA kompleksi su razdvojeni s Dynal magnet, i podvrgnuti SDS-PAGE. STAT3 i c-Jun su detektirani Western analizom s anti-STAT3 i anti-c-Jun antitijela. E i F, MGC-803 stanice su ko-transfektirane s plazmidima pMMP-7mA i pCDNA3.1 /c-Jun i STAT3C i aktivnosti luciferaze su ispitani.
Za daljnju karakterizaciju interakcije STAT3 /c-Jun s AP-1 stranica, Izvršili smo test oborine afinitet DNK. Nakon MGC-803 stanice su tretirane s izoproterenol 2.5 h, nuklearna ekstrakt se dobije njegova kvaliteta je određena (Sl. 5c). S biotinom nukleotida koji odgovaraju -74 do -52 regiji MMP-7 promotora su inkubirani s 200 ug nuklearnih ekstrakata za padajućeg testovima. Magnetske kuglice obložene streptavidinom su korišteni da se istaloži označenim biotinom dvostruka oligonukleotida i povezane vezanje DNA proteina. Vezanje proteina jezgre na biotinilirani oligonukleotida je analiziran u prisutnosti jednog, pet, ili 15 puta količine dvolančane oligonukleotidnim natjecatelja koji sadrži AP-1 konsenzus sekvence. Inkubacija je od proteina jezgre s nukleotida dvostrukih sadrže mutirani AP-1 web stranica ili nespecifične dvostruka oligonukleotida je služila kao kontrola. Nastali DNA-protein kompleksi se mogu razdvojiti pomoću SDS-PAGE, nakon čega slijedi Western blot sa anti-c-Jun i anti-stat3 antitijela. Povezanost obiju transkripcijskih faktora s oligonukleotida sadrži AP-1 konsenzus sekvence mogu se jasno detektirati u Nuklearni ekstrakti iz izoproterenol-stimuliranim stanicama, ali ne i nestimulirane stanice. Natjecanje s petnaest puta većoj količini natjecatelja potpuno ukinuta formiranje biotiniliranih DNA /proteinskih kompleksa (Sl. 5D). Ne vezanje c-Jun i STAT3 bilo oligonukleotidi sadrže mutirani AP-1 mjesto ili nespecifične nukleotida je otkrivena (Sl. 5D). Ovaj eksperiment daje in vitro dokaza potvrđuje da STAT3 i c-jun, pod stimulacije kateholamina, može fizički reagiraju i vežu na AP-1 mjesta postići transaktivaciju MMP-7 gena u stanicama raka želuca.
Pokazali smo da izoproterenol induciranu MMP-7 aktivacija promotora nije narušena mutagenezu core-sekvenci svih triju STAT3 mjesta, što ukazuje da su STAT3 elementi ne može djelovati na izoproterenol inducirane MMP-7 genske transkripcije u želučanim stanice raka. Dalje verifikacije ulogu AP-1 element, plazmid pMMP-7mA je kotransfeciran u MGC-803 stanica bilo s pCDNA3.1 /c-Jun i STAT3C, respektivno. Zanimljivo je da mutacija AP-1 veznog mjesta potpuno blokira aktivaciju MMP-7 promotor transfektiranih stanica ekspresijom ili c-Jun i STAT3C (sl. 5E i 5F), što ukazuje da je AP-1 mjesto važan regulacijski element i sinergistički reguliranje izoproterenol inducirane MMP-7 ekspresiju STAT3 i AP-1 oslanja se na tom dijelu. pregled β2-AR i MMP-7 su colocalized u želučanom tkivu raka
prekomjerna ekspresija MMP-7 bila je često na invazivne ispred ljudskog karcinoma želuca i izravno povezana s prognozom u bolesnika s karcinomom želuca. Kako bi se ispitalo povezanost razine β2-AR s MMP-7 ekspresije u ljudskim karcinoma želuca, prikupili smo pet uzoraka rak želuca tkiva i analizirati ekspresiju ß2-AR i MMP-7 imunohistokemijskom označavanja. Zanimljivo, jaka ekspresija ß2-AR i MMP-7 nastao na istu regiju tumorskih tkiva (Sl. 6A), što ukazuje na intimni odnos između MMP-7 i ß2-AR. Kako bi se dodatno istražiti ulogu MMP-7 i P2-AR u metastazi karcinoma želuca, analizirali smo ekspresiju MMP-7 i P-župnika u kancerogen, peri-kancerozne i metastatskih tkiva pacijenta sa karcinomom želuca. Kao što je prikazano na slici. 6B, ekspresija β1-AR, ß2-AR i MMP-7, na razini proteina bila je veća u kanceroznim tkivima u odnosu na peri-kancerogenog tkiva. Međutim, najveći izraz njih je pronađena u metastatskom tkivu. Nadalje, MMP-7 mRNA je također povećana kod metastatskih tkivima (Sl. 6C). Ovi podaci snažno upućuju na usku povezanost između MMP-7, β2-AR i metastaze karcinoma želuca. Slika 6 β2-AR i MMP-7 su izraženo u želučanog tkiva raka. A, pet uzoraka raka želuca tkiva su prikupljeni. Ekspresija ß2-AR i MMP-7 analizirana je imunokemijski. B, ekspresija MMP-7, β1-AR i β2-AR u raka, peri-kancerozne i metastatskih tkiva je analiziran pomoću Western blot. C, razina MMP-7 mRNA u kancerogenih, peri-kancerozne i metastatskih tkiva analizirana je real-time PCR. Pregled Rasprava pregled ovog rada bio je temeljen na pretpostavci da je psihosocijalni stres može biti predisponirajući faktor u raka želuca. Stres, anksioznost i depresija mogu izazvati složene fiziološke i neuroendokrinih promjena koje utječu na više sustava, uključujući i probavni sustav. Pacijenti s rakom često doživljavaju značajan emocionalni stres. Udruga fiziološkom stresu s visine od lučenja želučane kiseline i bolovima u trbuhu je odavno primijetio [46, 47]. On je izvijestio da kronični stres može pogoršati čir želuca. U nedavnom populacije na bazi ankete upisani 2014 ispitanika, stres je smatran najmoćnijim faktor rizika u rakom želuca [48]. Nalazi iz eksperimentalnih studija ukazuju na to da je povećana aktivnost simpatičkog živčanog sustava može predstavljati osnovnu mehanizam kojim fiziološki čimbenici utječu ekspresije gena u tumorima [49]. Do danas, većina studija koje istražuju mehanizme koji povezuju stres i raka napredovanje je vezana uz neizravne učinke kroz imunosupresije. [8] U nekoliko nedavnih studija, koja se odnosi na stres proteini i putevi su povezani direktno na ponašanja promjene malignih stanica [10-17]. Međutim, postoji dovoljno podataka razgraničenje molekularne mehanizme koji su uključeni.
U ovom istraživanju, identificirali smo povećali MMP-7 izraz u staničnim linijama karcinoma želuca, kao odgovor na stimulaciju stresom povezanih hormona kateholamina. Procjenjuje se da je koncentracija kateholamina može biti više od 100 puta veća u mikro tumora nego u normalnom tkivu i kruži plazme. MMP-7 jedinstven je u svoje ograničene ekspresije u stanicama tumora, što pokazuje da MMP-7 ekspresije u modi tumorom. Primijetili smo da stimulacija Izoproterenol značajno je povećana MMP-7 izraz na oba mRNA i proteina u želučanih stanica raka. β2-AR antigonist efektivno ukinuta Izoproterenol izazvanu MMP-7 izraz up-regulaciji, što ukazuje da β2-AR-posredovani put sudjeluje u tom procesu. pregled, MMP-7 izraz strogo kontrolira na razini transkripcije. Naša prethodna studija pokazala je da heregulin-β inducirane MMP-7 ekspresija je reguliran HER2 posredovanog STAT3 i AP-1 aktivacije u ljudskim staničnim linijama raka dojke [42, 43]. Također smo identificirali funkcionalne AP-1 i STAT3 vezna mjesta u prvom 350 bp na početno mjesto transkripcije u ljudskoj MMP-7 promotora [42, 43]. Jedna studija ukazuje da FGF-2 može izravno povećati ekspresiju MMP-7 gena u tumorskim staničnim linijama i endotelijalnih stanica pupčane vene kroz AP-1 i STAT3 [50]. Prikupljeni dokazi snažno podupire da STAT3 služi kao središnje regulatorno čvora na kojem više onkogeni signalni put konvergirati [51]. Netipična aktivacija STAT3 je dokazano da igra važnu ulogu u razvoju raka želuca [52, 53]. Nedavna studija i naši podaci otkrili povezanost catacholamine s aktivacijom STAT3 u jajnika i dojke stanica raka [12, 13]. U ovom istraživanju, pokazali smo da stimulacija izoproterenol vidljivo inducira aktivaciju STAT3 u stanicama raka želuca, što ukazuje na to kateholamina može ubrzati malignu napredovanje raka želuca. Naš nepublicirani podaci također dokazano da izoproterenol stimulira ekspresiju MMP-2 i MMP-9 na stanicama raka želuca, uglavnom kroz aktiviranje STAT3. Međutim, u ovoj studiji, otkrili smo da AP-1 pokazale su veću učinkovitost nego STAT3 isoproterenol inducirane MMP-7 transkripcije gena i Stat3 elementi bili nefunkcionalni kao utišavanje ekspresije STAT3 nije bio učinkovit u sprječavanju izoproterenol induciranu MMP 7. izraz i mutageneza tri STAT3 veznih mjesta nije uspjela potisnuti transaktiviranje MMP-7 promotora kao odgovor na indukciju izoproterenol. Nasuprot tome, AP-1 mjesto i c-Jun uređeno taj proces. Zanimljivo, STAT3 i c-Jun je utvrđeno da se vežu na jedan AP-1 mjesta u MMP-7 promotora istovremeno, što omogućava da se uzajamno djelovanje obaju transkripcijskih faktora, na jedno mjesto vezanja je odgovoran za izoproterenol stimulirano MMP-7 ekspresije u raka želuca Stanice. Mi smo pokazali da STAT3 i AP-1 su važni regulatori transkripcijski MMP-7 i MMP-9 u ljudskim stanicama raka dojke prije i STAT3 i AP-1 pokazuju transkripcijske funkcije regulacijskih vezanjem na njihovim elementima [42-44]. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Proteomska promjena u gastic adenokarcinoma iz japanske patients
• Pacijent s rakom želuca s peritonejskom karcinomatoza tretirana s intraperitonealnim kemoterapije koja je preživjela više od 5 godina primio ponovljene laparoskopske preglede: slučaj report