Catecholamine up-reguleert MMP-7-expressie door het activeren van AP-1 en STAT3 in de maag cancer

catecholamine up-reguleert MMP-7-expressie door het activeren van AP-1 en STAT3 bij maagkanker
Abstracte achtergrond
Stress, angst en depressie kunnen complexe fysiologische en neuroendocriene veranderingen, resulterend in verhoogde mate van stress hormonen catecholamine die een primair mechanisme kunnen vormen waardoor fysiologische factoren invloed genexpressie in tumoren veroorzaken. In het onderhavige onderzoek onderzochten we het effect van catecholamine stimulatie op MMP-7-expressie in cellen maagkanker en opgehelderd de moleculaire mechanismen van de up-regulatie van MMP-7 niveau catecholamine met een adrenerge signaleringsroute.
Resultaten
verhoogde MMP-7-expressie geïdentificeerd zowel mRNA en eiwitniveaus in maagkanker cellen in reactie op isoproterenol stimulatie. β2-AR antigonist effectief opgeheven isoproterenol veroorzaakte MMP-7-expressie. De activering van STAT3 en AP-1 werd geïnduceerd door isoproterenol prominent stimulatie en AP-1 vertoonden een grotere werkzaamheid dan STAT3 in isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie. Mutagenese van drie STAT3 bindingsplaatsen in MMP-7 promotor niet aan de transactivatie van MMP-7 promoter te onderdrukken en de mute-STAT3 expressie effectief in het voorkomen isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie was niet. Echter, isoproterenol-geïnduceerde MMP-7 promoter activiteiten werden volledig verdwenen toen de AP-1-plaats werd gemuteerd. STAT3 en c-Jun kunnen fysieke interactie en binden aan de AP-1-plaats, wat impliceert dat de wisselwerking tussen beide transcriptiefactoren op de AP-1 plaats is verantwoordelijk voor isoproterenol gestimuleerde MMP-7-expressie in maagkanker cellen. De expressie van MMP-7 bij maagkanker weefsels bleek te zijn op de plaats waar β2-AR werd overexpressie en de niveaus van MMP-7 en β2-AR waren het hoogst in de metastatische locus van maagkanker.
Conclusies
Up-regulatie van MMP-7 tot expressie β2-AR-gemedieerde signaalweg betrokken bij invasie en metastase van maagkanker. achtergrond
maagkanker is de tweede meest belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte, met ongeveer 700 000 doden per jaar [1, 2]. Een van de belangrijke factoren bij de pathogenese van maagkanker is chronische infectie met Helicobacter pylori
[3]. Echter, de meeste geïnfecteerde individuen ontwikkelen geen kanker en het resultaat van de infectie wordt door gastheer, onder andere omgevingsfactoren [4]. Er zijn steeds meer aanwijzingen ter ondersteuning van de rol van psychologische stress in de maagkanker ontstaan ​​en ontwikkeling [5]. Verschillende epidemiologische studies hebben aangetoond dat psychologische of gedragsmatige stressfactoren de progressie van maagkanker [6, 7] kan versnellen. De precieze mechanisme waardoor psychologische stress optreedt bij maagkanker progressie onduidelijk.
Stress initieert een reactie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier-as (HPA), resulterend in verhoogde catecholamine niveau [8, 9]. Verschillende studies hebben aangetoond dat stimulering van catecholamine interfereert met biologische gedrag van tumorcellen direct, hoofdzakelijk door β2-adrenerge receptoren (β2-AR) gemedieerde signaalweg [10-14]. Recente waarnemingen wijzen op een mogelijk mechanisme voor de progressie van eierstok-, nasofaryngeale en alvleesklierkanker blijkt dat catecholamine de expressie van matrix metalloproteïnase (MMP) -2 en MMP-9 kunnen moduleren door stroma en tumorcellen [15-17]. Het roept een interessante vraag die psychologische stress een rol in de ontwikkeling en progressie van maagkanker kan spelen bij het moduleren van de expressie van MMP's tot β2-gemedieerde AR signaalweg.
Verzameld bewijsvoeringen blijkt dat MMP-7 betrokken bij de invasie en uitzaaiingen van maagkanker [18-24]. MMP-7 is de kleinste bekende lid van MMP familie en bezit de hoogste extracellulaire matrix (ECM) -degradative activiteit tegen verschillende ECM componenten zoals elastine, gelatine, collageen type IV, fibronectine, vitronectine, laminine, entactine, aggrecan en proteoglycanen onder de MMPs [25, 26]. Het kan ook het activeren van de activering van een MMP cascade [27]. Een uniek kenmerk van MMP-7 is de beperkte expressie overwegend epitheelcellen klierweefsel waaronder normale borstklier, lever, pancreas, prostaat en peribronchiale klieren [28].
Gevonden is dat MMP-7 is overexpressie in de invasieve kanker van spijsverteringsorganen, zoals oesofageale [29], maag [30], alvleesklier [31, 32], colorectale [33-35], lever [36] en andere organen. Het expressieniveau van MMP-7 is significant geassocieerd met de transformatie van tumorcellen, fenotypes agressieve kanker en het stadium van tumorprogressie [37], in het bijzonder bij tumoren van het maagdarmkanaal. De overexpressie van MMP-7 vaak geïdentificeerd premaligne maaglesies en meest maagcarcinomen [18-21, 24, 38]. Een positieve correlatie van MMP-7 ter hoogte van de tumor invasie van de maagwand, lymfeknoop metastase, peritoneale verspreiding en overleving van maagkankerpatiënten is beschreven in diverse studies [23]. MMP-7 is erkend als een belangrijke mediator van kankerprogressie en beschouwd als een onafhankelijke prognostische marker voor primaire maagkanker. De mogelijke moleculaire mechanismen van MMP-7 overexpressie bij maagkanker nog nauwelijks onderzocht.
In het onderhavige onderzoek onderzochten we het effect van catecholamine stimulatie op MMP-7-expressie in maagkanker cellijnen en verduidelijkt de moleculaire mechanismen van de up-regulatie van MMP-7 niveau catecholamine met een adrenerge signaleringsroute.
Resultaten
Isoproterenol stimulatie up-reguleert de expressie van MMP-7
Er werd aangetoond dat de expressie van MMP-9 in ovarian kanker was significant verhoogd in tumor-geassocieerde macrofagen bij patiënten met verhoogde depressieve symptomen [15] en catecholamine versterkt LPS-geïnduceerde expressie van MMPs in humane monocyten [39]. Om te onderzoeken of catecholamine associeert met de expressie van MMP-7 in maagkanker cellen, we eerst onderzocht de effecten van β-AR agonist isoproterenol op de transcriptie van MMP-7 gen in maagkanker cellijnen HGC-27 en MGC-803 . De doses van catecholamine die in dit onderzoek werden gekozen om de fysiologische omstandigheden van dit hormoon in tumoren geven [40, 41]. Semi-kwantitatieve real-time PCR-analyses toonden aan dat MMP-7-expressie op transcriptieniveau laag was bij maagkanker cellijnen. Wanneer de cellen werden blootgesteld aan 10 uM isoproterenol in de serumvrije media voor 12 uur werden MMP-7 mRNA opmerkelijk verhoogd in beide cellijnen (Fig. 1A en 1B). Om te bepalen of de verhoogde MMP-7 mRNA leidt tot een vergelijkbare toename in eiwitproductie, MMP-7-expressie in HGC 27 en MGC-803-cellen werd geanalyseerd door Western blot. Zoals getoond in Fig. 1C, isoproterenol stimulatie leidde tot een significante opregulatie van MMP-7-expressie in HGC 27 en MGC-803 cellen. β2-AR, die de meeste effecten van catecholamine bemiddelt, geïdentificeerd in borst- en eierstokkanker cellen [11, 13]. Om de rol van β2-AR-gemedieerde signalering in MMP-7-expressie te verduidelijken, gebruikt we een β-AR antagonist propranolol en selectieve β2-AR antagonist ICI-118.551 te testen of het effect van isoproterenol op MMP-7-expressie kan worden geremd. Onze gegevens toonden aan dat de behandeling met propranolol en ICI-118.551 efficiënt geblokkeerd-isoproterenol gestimuleerde MMP-7-expressie (Fig. 1D, bovenste paneel). Vervolgens hebben we onderzocht of β2-AR wordt uitgedrukt in maagkanker cellen. De gegevens toonden aan dat de expressie van β2-AR detecteerbaar was in drie maagkanker cellijnen waaronder HGC-27, MGC-803 en MKN-45 (fig. 1D, onderste paneel). Deze gegevens gaven aan dat isoproterenol stimuleerde de productie van MMP-7 bij maagkanker cellijnen en dat de opregulatie van MMP-7-expressie door isoproterenol werd hoofdzakelijk veroorzaakt door β2-AR gemedieerde signalering. Figuur 1 Isoproterenol stimulatie up-reguleert de expressie van MMP-7. A en B, HGC-27 en MGC-803 cellen werden overnacht geïncubeerd in serumvrij medium en vervolgens behandeld met 2 of 10 uM isoproterenol, respectievelijk. De expressie van MMP-7 mRNA werd geanalyseerd door RT-PCR (A) en real-time PCR (B). C, HGC-27 cellen werden gestimuleerd met 0, 1 of 2 uM isoproterenol en MGC-803 cellen met 0, 5 en 10 uM isoproterenol na serumuithongering. De expressie van MMP-7 proteïne werd geanalyseerd door Western blot. D, MGC-803 cellen werden behandeld met 10 uM propranolol of 1 uM ICI-118.551 gedurende 1 uur en daarna met 10 uM isoproterenol. MMP-7-expressie werd geanalyseerd door Western blot (bovenste paneel); de expressie van β2-AR in MGC-803, MKN-45 en HGC-27 cellen werd gedetecteerd door Western blot (onderste paneel).
Isoproterenol up-reguleert MMP-7 promoter activiteit en activeert STAT3 en AP-1
Om de moleculaire mechanismen die catecholamine up-reguleert MMP-7-expressie te verkennen, moeten we eerst bepaald of isoproterenol stimulatie rechtstreeks van invloed kan zijn MMP-7 promoter activiteit. Wij construeerden een plasmide PMMP-7 die een luciferase reportergen aangedreven door een 340 bp MMP-7 promoter fragment (-296 - 44) (fig. 2A). MGC-803 cellen werden getransfecteerd met PMMP-7 en het effect van isoproterenol op MMP-7 promoter activiteit werd bepaald door luciferase assays. Zoals getoond in Fig. 2B, na isoproterenol stimulatie gedurende 1 uur, het luciferase activiteiten begon te stijgen en geleidelijk verbeterd. Om 6 uur na blootstelling, MMP-7 promoter activiteiten lieten een meer dan verdubbeling vergeleken met de gestimuleerde controle cellen, wat suggereert dat isoproterenol stimulatie zou de transactivatie van MMP-7 promoter direct induceren. Figuur 2 Isoproterenol up-reguleert MMP-7 promotoractiviteit en activeert STAT3 en AP-1. Een schematische weergave van het plasmide PMMP-7 die een luciferase reportergen aangedreven door een 340 bp MMP-7 promotorfragment. SBE, STAT3 site; ABE, AP-1-plaats. B, MGC-803 cellen werden gecotransfecteerd met PMMP-7 en pRL-TK. Na transfectie gedurende 48 uur werden de cellen geïncubeerd in serumvrij medium gedurende 24 uur en vervolgens gestimuleerd met 10 uM isoproterenol voor 0, 1, 2, 3, 6 en 9 uur, respectievelijk. MMP-7 promoter activiteiten werden beoordeeld door luciferase assays. C en D, MGC-803 cellen werden behandeld met 10 uM propranolol gedurende 1 uur en daarna met 10 uM isoproterenol voor 0, 15, 30, 60, 120 of 180 min, respectievelijk. De fosforylering van STAT3 en c- Jun werd geanalyseerd door Western blot met anti-fosfor-STAT3 en anti-fosfor-c-Jun konijnen polyklonale antilichamen. ISO, isoproterenol.
In onze vorige studie [42, 43], identificeerden we een AP-1 bindingsplaats op de positie -67 tot -61 en drie STAT3 bindingsplaatsen op de posities -137 tot -122, -168 tot -159 en -255 tot -245 in MMP-7 promoter (Fig. 2A). We hebben ook aangetoond dat AP-1 en STAT3 gebonden aan AP-1 en een van de STAT3 (-137 tot -122) plaatsen positief reguleren MMP-7 transcriptie. Een recente studie toonde aan dat catecholamine heeft het potentieel om STAT3 activeert. Om te onderzoeken of catecholamine stimuleert MMP-7 transcriptie via de activering van STAT3 en AP-1, analyseerden we de fosforylering van STAT3 en c-juni Fig. 2C bleek dat isoproterenol veroorzaakt de fosforylering van STAT3 na 30 min stimulatie, met een piek bij 2 uur. Hoewel de activatie van c-Jun was traag, ingeleid op 60 min, werd een maximale fosforylatie bereikt bij 2 u resp (fig. 2D). Het betekende dat isoproterenol stimulatie een β2-AR-gemedieerde signaal dat de activering van STAT3 en AP-1.
STAT3 element in MMP-7 promoter is niet nodig en STAT3 niet voldoende voor isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie geactiveerd geproduceerd
om te bepalen of de STAT3 elementen functioneel isoproterenol geïnduceerde MMP-7 gentranscriptie we eerst begonnen met de mutagenese van drie STAT3 sites via muteren van de kern-sequenties van STAT3 sites op basis PMMP-7 (Fig. 3A) en bouwde het plasmide PMMP-7ms. Het plasmide werd getransfecteerd in MGC-803 cellen. Na transfectie gedurende 48 uur werden de cellen geïncubeerd in serumvrij medium nacht en daarna gestimuleerd met 10 uM isoproterenol gedurende 6 uur. Wij merkten verrassenderwijs dat de mutatie van drie STAT3 bindingsplaatsen zonder zichtbare invloed op de transactivatie van MMP-7 promotor hadden. Zoals getoond in Fig. 3B, luciferase activiteiten geleidelijk en benaderde een piek bij 6 uur na blootstelling. Het resultaat was vergelijkbaar met die waargenomen in de cellen getransfecteerd met wildtype MMP-7 promoter. Om de rol van STAT3 identificeren dit geval werden HGC-27 en MGC-803 cellen getransfecteerd met pGeneSuppressor expressie shRNA gericht STAT3 en HGC-27 /STAT3-sh en MGC-803 /STAT3-sh cellen vastgesteld. Fig. 3C toonde dat de expressie van STAT3 efficiënt werd onderdrukt in beide cellen. In overeenstemming met bovenstaande gegevens,-isoproterenol veroorzaakte MMP-7 promotor activiteiten bleek niet significant te worden belemmerd in MGC-803 /STAT3-sh cellen (fig. 3D). Bovendien werd isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie in zowel mRNA en eiwitniveaus niet belangrijker silencing beïnvloed door STAT3 expressie zoals aangetoond door RT-PCR, real-time PCR en Western blot (fig. 3E, F en 3G). De resultaten suggereerden dat STAT3 element in MMP-7 promoter niet vereist en STAT3 niet voldoende voor isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie. Figuur 3 STAT3 element in MMP-7 promoter is niet nodig en STAT3 niet voldoende voor isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie. Een schematische weergave van het plasmide-PMMP 7ms met drie gemuteerde STAT3 plaatsen op de posities -255 tot -245, -168 tot -159 en -137 tot -122. B, MGC-803 cellen werden gecotransfecteerd met PMMP-7 ms en pRL-TK, uitgehongerd, en vervolgens gestimuleerd met 10 uM isoproterenol voor 0, 1, 2, 3, 6 en 9 uur, respectievelijk. MMP-7 promoter activiteiten werden beoordeeld door luciferase assays. C, HGC-27 en MGC-803-cellen werden stabiel getransfecteerd met pGeneSuppressor STAT3 expressie shRNA. De expressie van STAT3 werd geanalyseerd door Western blot in HGC-27 /STAT3-sh en MGC-803 /STAT3-sh cellen. D, MMP-7 promoter activiteiten werden bepaald in MGC-803 /STAT3-sh cellen na stimulatie met 10 uM isoproterenol voor 0, 1, 2, 3, 6 en 9 uur, respectievelijk. E tot G, HGC-27 /STAT3-sh en MGC-803 /STAT3-sh cellen werden gestimuleerd met 2 uM of 10 uM isoproterenol, respectievelijk. De expressie van MMP-7 werd geanalyseerd door RT-PCR (E), real-time PCR (F) en Western blot (G).
AP-1 speelt een cruciale rol bij isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie
bovenstaande gegevens was onverwacht, aangezien STAT3 kon worden geactiveerd door isoproterenol stimulatie. Bovendien, in onze eerdere studie [42, 43] hebben we aangetoond dat STAT3 en AP-1 deel in de regulering Her2 signalerende gemedieerde MMP-7-expressie in borstkankercellen. Vervolgens hebben we gevraagd om te onderzoeken of AP-1 invloeden isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie. MGC-803 cellen werden getransfecteerd met het plasmide PMMP-7mA bevattende een gemuteerd AP-1-plaats op positie -67 tot -61 in MMP-7 promotor en luciferase activiteiten gemeten (Fig. 4A). Verrassenderwijs werd isoproterenol-geïnduceerde MMP-7 promoter activiteiten volledig verdwenen op alle tijdstippen (Fig. 4B), wat suggereert dat de AP-1-plaats is cruciaal isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie. Figuur 4 AP-1 speelt een cruciale rol bij isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie. Een schematische weergave van het plasmide-PMMP 7mA bevattende een gemuteerd AP-1-plaats op positie -67 tot -61. B, MGC-803 cellen werden gecotransfecteerd met PMMP-7mA en pRL-TK, uitgehongerd en gestimuleerd met 10 uM isoproterenol voor 0, 1, 2, 3, 6 en 9 uur, respectievelijk. MMP-7 promoter activiteiten werden beoordeeld door luciferase assays. C, MGC-803-cellen gecotransfecteerd met TAM67, PMMP-7 en pRL-TK werden geïnduceerd met 10 uM isoproterenol. MMP-7 promoter activiteiten werden geanalyseerd door luciferase assays. D, MGC-803 cellen die stabiel tot expressie shRNA gericht op c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) werden vastgesteld en c-Jun-expressie werd geanalyseerd door Western blot. E, MMP-7 promoter activiteiten werden bepaald in MGC-803 /c-Jun-sh cellen na stimulatie met 10 uM isoproterenol voor 0, 1, 2, 3, 6 en 9 uur, respectievelijk. F, MMP-7-expressie werd geanalyseerd MGC-803 /c-Jun-sh cellen na stimulatie met 0, 2 en 10 uM isoproterenol, respectievelijk. G, de plasmiden die c-Jun en STAT3C getransfecteerd in MGC-803 /c-Jun-sh cellen. MMP-7 promoter activiteiten werden geanalyseerd door luciferase assays.
Bevestigen isoproterenol-geïnduceerde MMP-7 expre AP-1, dan hebben we onderzocht of de transactivatie van MMP-7 promoter geïnduceerd door isoproterenol kan worden geremd door een dominante negatieve mutant c-Jun TAM67, die de c-Jun-5'transactiverende domein mist maar bezit een functionele c-Jun leucine zipper en DNA-bindende domein. Na transiënte transfectie met TAM67 in MGC-803 cellen werd isoproterenol geïnduceerde transactivatie van MMP-7 promoter geanalyseerd door luciferase assays. Zoals getoond in Fig. 4C, de expressie van het dominante negatieve c-Jun vertoonde een opvallend remmend effect op MMP-7 promoter activiteiten. Om de kritische rol van AP-1 verder te controleren, testten we of blokkeren endogeen tot expressie gebracht c-Jun kan de expressie van MMP-7 te remmen. De MGC-803 /c-Jun-SH cellen werden vastgesteld (fig. 4D) en MMP-7 promotor activiteiten van luciferase assays geanalyseerd. De gegevens in Fig. 4E bleek dat de activiteit van MMP-7 promoter opvallend maal bij omverwerpen van c-Jun-expressie. Western blot analyse toonde ook aan dat-isoprotereol geïnduceerde MMP-7-expressie sterk was verminderd bij MGC-803 /c-Jun-sh cellen, terwijl een aanzienlijk grote hoeveelheid MMP-7 proteïne werd gedetecteerd in de parentale cellen na isoproterenol stimulatie (Fig. 4F). Met name de overexpressie van exogeen c-Jun dramatisch gerestaureerde MMP-7 promoter activiteiten MGC-803 /c-Jun-SH cellen, maar constitutief geactiveerde STAT3 mutant STAT3C slechts minimaal actief MMP-7 promoter als c-Jun-expressie stil (Fig . 4G). Deze gegevens bewijzen dat AP-1 gedomineerde isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie.
C-Jun en STAT3 synergistisch regelen MMP-7-expressie als reactie op isoproterenol stimulatie
samenwerking tussen Stat3 en c-Jun in het reguleren van verschillende gentranscriptie gerapporteerd. Onze eerdere studie toont aan dat de activatie van MMP-9-promoter is afhankelijk van de interactie van Stat3 en AP-1 [44]. Zoals hierboven vermeld, isoproterenol stimulatie geïnduceerde activering van STAT3 en AP-1 gelijktijdig. We speculeerden dat Stat3 en AP-1 synergetisch kunnen deelnemen aan de regulatie van isoproterenol gestimuleerde MMP-7-expressie. Er is op gewezen dat de AP-1 samen met STAT3 in interleukine 6 geïnduceerde transactivering van het IL-6 responselement in de afwezigheid van directe AP-1 DNA binding [45]. Het voor ons aanleiding om de mogelijke coöperatieve binding van AP-1 /STAT3 aan de AP-1-site te testen.
Om te bepalen of dat STAT3 en AP-1 kan worden aangeworven om de AP-1-plaats in MMP-7 promoter in vivo , MGC-803 cellen werden gestimuleerd met 10 uM isoproterenol voor 0, 2,5 of 4 uur, respectievelijk. De chromatine DNA /nucleair eiwit complexen werden bereid en binding van STAT3 en c-Jun aan de AP-1-plaats werd geanalyseerd door ChIP assays. Het PCR-product geselecteerd voor amplificatie uitstrekt van het -76 tot +165 gebied herbergt de AP-1-plaats in MMP-7 promoter. De immunoprecipitatie met anti-STAT3 en anti-c-Jun-antilichamen gevolgd door PCR leverde een verwachte 241 bp band uit de precipiterende isoproterenol na stimulatie gedurende 2,5 uur. De intensiteit van deze banden werden verzwakt na 4 uur. Daarentegen, in gestimuleerde controlecellen geen binding van STAT3 op deze plaats werd waargenomen en de binding van c-Jun nauwelijks detecteerbaar. Geen band werd geamplificeerd met behulp van immunoprecipitatie konijnen IgG (Fig. 5A). De gegevens werden bevestigd door real-time PCR (Fig. 5B). Deze gegevens toonden aan dat de associatie van STAT3 en c-Jun met MMP-7 promoter in vivo
was specifiek en isoproterenol stimulatie geïnduceerde binding van STAT3 /c-Jun aan de AP-1-element. Figuur 5 c-Jun en STAT3 synergetisch reguleren MMP-7-expressie. A en B werden MGC-803 cellen gestimuleerd met 10 uM isoproterenol voor 0, 2,5 of 4 uur, respectievelijk. De chromatine DNA /nucleair eiwit complexen werden bereid. Binding van STAT3 en c-Jun aan de AP-1-plaats werd geanalyseerd door immunoprecipitatie met anti-STAT3 en anti-AP-1-antilichamen gevolgd door PCR (A) en real-time PCR (B). C, MGC-803 cellen werden behandeld met 10 uM isoproterenol voor 0 of 2,5 uur respectievelijk. Het nucleaire extract werd bereid met een nucleair-Cytosol Extraction Kit. β-tubuline en AP-2α werden geanalyseerd door Western blot om de scheiding van cytoplasmatische en nucleaire eiwitten te onderzoeken. C, cytosolische eiwitten; N, kerneiwitten. D, 200 ug van nucleaire extracten geïncubeerd bij 4 ° C gedurende 4 uur met de gebiotinyleerde oligonucleotiden die AP-1 consensussequentie eerder gekoppeld met Dynabeads M-280 in aanwezigheid of afwezigheid van één, vijf of 15 voudige hoeveelheid van een dubbele -stranded oligonucleotide concurrenten. Incubatie van nucleaire eiwitten met de dubbelstrengs oligonucleotiden die een gemuteerd AP-1-plaats (Mut Oligo) of aspecifieke dubbelstrengs oligonucleotiden (NS Oligo) werd gebruikt als controles. Het eiwit /DNA-complexen werden gescheiden met een Dynal magneet en onderworpen aan SDS-PAGE. STAT3 en c-Jun werden gedetecteerd door Western blot met anti-STAT3 en anti-c-Jun antilichamen. E en F, MGC-803 cellen werden gecotransfecteerd met plasmiden PMMP-7mA en pCDNA3.1 /c-Jun of STAT3C en luciferase activiteiten werden geanalyseerd. Belgique Om verder te karakteriseren van de interactie van STAT3 /c-Jun met de AP-1-plaats, voerden we een DNA affiniteitsprecipitatie assay. Na MGC-803 cellen werden behandeld met isoproterenol gedurende 2,5 uur werd het nucleair extract bereid en de kwaliteit werd geëvalueerd (Fig. 5C). Het gebiotinyleerde oligonucleotiden overeenkomend met -74 tot -52 regio MMP-7 promoter geïncubeerd met 200 ug van nucleaire extracten van de pull-down tests. De streptavidine gecoate magnetische parels werden gebruikt om biotine-gelabelde dubbelstrengs oligonucleotiden en geassocieerde DNA bindende eiwitten precipiteren. De binding van de kerneiwitten om de gebiotinyleerde oligonucleotiden werd geanalyseerd in de aanwezigheid van één, vijf, of 15-voudige hoeveelheid dubbelstrengs oligonucleotide concurrenten die AP-1 consensussequenties. Incubatie van nucleaire eiwitten met de dubbelstrengs oligonucleotiden die een gemuteerd AP-1-plaats of aspecifieke dubbelstrengs oligonucleotiden werd als controle gebruikt. De resulterende DNA-eiwitcomplexen werden gescheiden door SDS-PAGE, gevolgd door Western blot met anti-c-Jun en anti-STAT3 antilichamen. De vereniging van beide transcriptiefactoren met de oligonucleotiden die AP-1 consensus sequenties kon duidelijk worden gedetecteerd in nucleaire extracten van isoproterenol-gestimuleerde cellen, maar niet van niet-gestimuleerde cellen. Concurrentie met vijftien voudige hoeveelheid van de concurrenten volkomen opgeheven de vorming van de gebiotinyleerde DNA /eiwitcomplexen (fig. 5D). Geen binding van c-Jun en STAT3 ofwel de oligonucleotiden die een gemuteerd AP-1-plaats of niet-specifieke oligonucleotiden werd gedetecteerd (Fig. 5D). Deze proef bepaalt in vitro bewijs dat STAT3 en c-Jun, onder catecholamine stimulatie bevestigen, kan fysieke interactie en binden aan de AP-1 plaats tot transactivatie van MMP-7 gen bij maagkanker cellen bereiken.
We toonden aan dat isoproterenol geïnduceerde MMP-7 promoter activatie niet verstoord door de mutagenese van de kern-sequenties van drie STAT3 locaties suggereert dat de STAT3 elementen niet kan optreden isoproterenol-geïnduceerde MMP-7 gentranscriptie bij maagkanker cellen. Om de rol van AP-1-element verder te verifiëren, het plasmide-PMMP 7mA werd gecotransfecteerd in 803 MGC-cellen met hetzij pCDNA3.1 /c-Jun of STAT3C respectievelijk. Interessant is dat de mutatie van AP-1 bindingsplaats grondig blokkeerde de activatie van MMP-7 promoter in getransfecteerde cellen tot overexpressie ofwel c-Jun of STAT3C (fig. 5E en 5F), wat aangeeft dat de AP-1 plaats is een belangrijk regulerend element en de synergetische regulering van isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie door STAT3 en AP-1 is gebaseerd op dit element.
β2-AR en MMP-7 werden colocalized bij maagkanker weefsels Ondernemingen de overexpressie van MMP-7 was vaak de invasieve voor menselijke maagkanker en is rechtstreeks verbonden met de prognose bij patiënten met maagkanker. De correlatie van β2-AR niveau MMP-7-expressie in menselijke maagkanker bestuderen, verzamelden we vijf maagkanker weefselmonsters en de expressie van β2-AR en MMP-7 geanalyseerd door immunohistochemische labeling. Interessant is dat de sterke expressie van β2-AR en MMP-7 ontstaan ​​op hetzelfde gebied van de tumorweefsels (Fig. 6A), suggereert een nauwe relatie tussen MMP-7 en β2-AR. Om verder de rol van MMP-7 en β2-AR in de metastase van maagkanker, analyseerden we de expressie MMP-7 en β-AR's in de kankercellen, peri-kwaadaardige en metastatische weefsels van een patiënt met maagkanker. Zoals getoond in Fig. 6B, de expressie van β1-AR, β2-AR en MMP-7 op eiwitniveau hoger in kankerweefsel dan in peri-cancereus weefsel. De hoogste expressie daarvan werd gevonden in het metastatisch weefsel. Bovendien werd MMP-7 mRNA ook overexpressie in de metastatische weefsels (fig. 6C). Deze gegevens sterk impliceren een nauwe band tussen MMP-7, β2-AR en metastase van maagkanker. Figuur 6 β2-AR en MMP-7 werden overexpressie in maagkanker weefsels. Een werden vijf maagkanker weefselmonsters verzameld. De expressie van β2-AR en MMP-7 werd onderzocht door immunohistochemie. B, de expressie van MMP-7, β1-AR en β2-AR in de kankercellen, peri-kwaadaardige en metastatische weefsels werd geanalyseerd door Western blot. C, het niveau van MMP-7 mRNA in de kankercellen, peri-kwaadaardige en metastatische weefsels werd geanalyseerd door real-time PCR.

Discussie De onderhavige studie was gebaseerd op de hypothese dat psychosociale stress een predisponerende factor zijn bij maagkanker. Stress, angst en depressie kunnen complexe fysiologische en endocriene veranderingen die meerdere systemen, zoals het spijsverteringsstelsel veroorzaken beïnvloeden. De patiënten met kanker ervaren vaak aanzienlijke emotionele nood. De associatie van fysiologische stress met een verhoging van de afscheiding van maagzuur en buikpijn is al lang opgevallen [46, 47]. Vermeld is dat chronische stress maagzweren kan verergeren. In een recente populatie-gebaseerde enquête deelnamen 2014 proefpersonen werd spanning beschouwd als de meest krachtige risicofactor voor maagkanker [48]. De resultaten van experimentele studies suggereren dat verhoogde activiteit van het sympathische zenuwstelsel een primaire mechanisme waardoor fysiologische factoren invloed genexpressie in tumoren [49] kan vormen. Tot op heden heeft de meeste studies die de mechanismen verbinden stress en progressie van kanker gerelateerd indirecte effecten bij de immuunsuppressie [8]. In verschillende recente studies, werden stress-gerelateerde eiwitten en trajecten direct gekoppeld aan de gedrags verandering van kwaadaardige cellen [10-17]. Er is echter een gebrek aan gegevens afbakening van de moleculaire mechanismen.
In deze studie, die we verhoogde MMP-7-expressie in het maagkanker cellijnen als reactie op het stimuleren van stressgerelateerde hormonen catecholamine. Geschat wordt dat de concentratie van catecholamine meer dan 100 maal hoger in de tumor micro dan in normale weefsels en circulerende plasma zijn. MMP-7 is uniek in zijn beperkte expressie in tumorcellen, hetgeen aangeeft dat MMP-7-expressie in een tumor geassocieerde manier. We hebben gemerkt dat isoproterenol stimulatie aanzienlijk up-gereguleerd MMP-7-expressie op zowel mRNA en eiwit niveaus bij maagkanker cellen. β2-AR antigonist effectief opgeheven isoproterenol-geïnduceerde MMP-7-expressie up-regulatie, suggereert dat β2-AR-gemedieerde route is betrokken bij het proces.
MMP-7-expressie wordt streng gecontroleerd op het niveau van transcriptie. Onze eerdere studie toonde aan dat hereguline-β-geïnduceerde MMP-7-expressie werd gereguleerd door HER2-gemedieerde STAT3 en AP-1 activering in humane borstkankercellijnen [42, 43]. Bovendien blijken de functionele AP-1 en STAT3 bindingsplaatsen in de eerste 350 bp van de transcriptie startplaats in menselijke MMP-7 promoter [42, 43]. Een ander onderzoek liet zien dat FGF-2 kan rechtstreeks upregulate MMP-7 genexpressie in humane tumorcellijnen en navelstreng endotheel cellen door AP-1 en STAT3 [50]. Accumuleren bewijs ondersteunt sterk dat STAT3 fungeert als centrale regelgeving knooppunt waarop meerdere oncogene signaalwegen convergeren [51]. Afwijkende activering van STAT3 is bewezen dat een cruciale rol speelt bij maagkanker ontwikkeling [52, 53]. Een recente studie en onze data blootgelegd de associatie van catacholamine met STAT3 activering in eierstokkanker en borstkanker cellen [12, 13]. In deze studie hebben we aangetoond dat isoproterenol stimulatie prominent induceerde de activering van STAT3 in maagkanker cellen, wat impliceert dat catecholamine kan de maligne progressie van maagkanker versnellen. De gepubliceerde gegevens blijkt ook dat isoproterenol stimuleerde de expressie van MMP-2 en MMP-9 bij maagkanker cellen voornamelijk door STAT3 activeert. Echter, in deze studie bleek dat AP-1 vertoonden een grotere werkzaamheid dan STAT3 in isoproterenol-geïnduceerde MMP-7 gentranscriptie en STAT3 elementen waren niet-functioneel als silencing STAT3 expressie effectief in het voorkomen isoproterenol geïnduceerde MMP niet 7 expressie en mutagenese van drie STAT3 bindingsplaatsen niet de transactivatie van MMP-7 promoter onderdrukken als reactie op isoproterenol inductie. In tegenstelling, de AP-1-plaats en c-Jun geregeld proces. Interessant STAT3 en c-Jun bleken gelijktijdig naar één AP-1-plaats in MMP-7 promoter bindt, wat impliceert dat de wisselwerking tussen beide transcriptiefactoren bij één bindingsplaats is verantwoordelijk voor isoproterenol gestimuleerde MMP-7-expressie in maagkanker cellen. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• Proteomics verandering in gastic adenocarcinomen van de Japanse patiënten
• Een patiënt met maagkanker met peritoneale carcinomatosa behandeld met intraperitoneale chemotherapie die overleefden meer dan 5 jaar ontvangen herhaalde laparoscopische examens: een case report