Catecolamine up-regola MMP-7 espressione attivando AP-1 e STAT3 in cancer

gastrica catecolamine up-regola MMP-7 espressione attivando AP-1 e STAT3 in cancro gastrico
Abstract
sfondo
Stress, ansia e la depressione può causare complessi fisiologici e neuroendocrini modifiche, con conseguente aumento del livello di ormone dello stress catecolamine relativi, che possono costituire un meccanismo primario attraverso il quale l'espressione genica fattori fisiologici impatto nei tumori. In questo studio, abbiamo studiato gli effetti della stimolazione catecolamine su MMP-7 espressione in cellule di cancro gastrico e chiarito i meccanismi molecolari del up-regolazione di MMP-7 livello di catecolamine attraverso un percorso di segnalazione adrenergico.
Risultati
Aumento della MMP-7 l'espressione è stato identificato sia a livello di mRNA che di proteine ​​nelle cellule di cancro gastrico in risposta alla stimolazione isoproterenolo. β2-AR antigonist effettivamente abrogato MMP-7 espressione isoproterenolo indotta. L'attivazione di STAT3 e AP-1 è stato ben visibile indotta dalla stimolazione isoproterenolo e AP-1 appare una maggiore efficacia di STAT3 in MMP-7 espressione isoproterenolo indotta. Mutagenesi di tre STAT3 siti di legame di MMP-7 promotore non è riuscito a reprimere la transattivazione di MMP-7 promotore e mettere a tacere l'espressione di STAT3 non è stato efficace nel prevenire MMP-7 espressione isoproterenolo indotta. Tuttavia, isoproterenolo indotta MMP-7 attività di promotore erano completamente scomparsi quando il sito AP-1 è stato mutato. STAT3 e c-Jun potrebbero interagire fisicamente e si legano al sito di AP-1, implicando che l'interazione di due fattori di trascrizione sul sito AP-1 è responsabile di MMP-7 espressione isoproterenolo stimolata in cellule di cancro gastrico. L'espressione di MMP-7 nei tessuti di cancro gastrico è risultato essere nel luogo in cui è stato sovraespresso β2-AR e dei livelli di MMP-7 e β2-AR sono stati i più alti del locus metastatico del cancro gastrico.
Conclusioni
up-regolazione di MMP-7 espressione attraverso percorso di segnalazione β2-AR-mediata è coinvolto nella invasione e metastasi del cancro gastrico.
Sfondo
cancro gastrico è la seconda causa più comune di morte per cancro correlato, con circa 700 000 decessi ogni anno [1, 2]. Uno dei fattori importanti nella patogenesi del cancro gastrico è un'infezione cronica da Helicobacter pylori
[3]. Tuttavia, la maggior parte degli individui infetti non sviluppano malignità e il risultato dell'infezione dipende ospitante, ambientale e altri fattori [4]. È sempre più evidente sostenere il ruolo dello stress psicologico nella insorgenza del cancro gastrico e sviluppo [5]. Diversi studi epidemiologici hanno dimostrato che i fattori di stress psicologici o comportamentali possono accelerare la progressione del cancro gastrico [6, 7]. Tuttavia, il meccanismo preciso con cui lo stress psicologico agisce nella progressione del cancro gastrico è chiaro.
Stress avvia una risposta dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene (HPA), con conseguente aumento del livello di catecolamine [8, 9]. Diversi studi hanno dimostrato che la stimolazione di catecolamine interferisce con bio-comportamenti delle cellule tumorali direttamente, principalmente attraverso i recettori beta2-adrenergici (β2-AR) mediata via di segnalazione [10-14]. Recenti osservazioni che punta a un potenziale meccanismo per la progressione di ovarico, tumori pancreatici nasofaringeo e indicano che catecolamine può modulare l'espressione di metalloproteinasi della matrice (MMP) -2 e MMP-9 da parte delle cellule dello stroma e tumorali [15-17]. Si pone una domanda interessante che lo stress psicologico può giocare un ruolo nello sviluppo e nella progressione del cancro gastrico modulando l'espressione di MMP attraverso β2-AR via di segnalazione mediata.
Linee cumulati di dimostrino che MMP-7 è coinvolto nella invasione e metastasi del cancro gastrico [18-24]. MMP-7 è il più piccolo membro della famiglia nota MMP e possiede il più alto matrice extracellulare (ECM) l'attività -degradative contro una varietà di componenti ECM, tra cui l'elastina, gelatina, collagene di tipo IV, fibronectina, vitronectina, laminina, entactina, aggrecan e proteoglicani , tra le MMPs [25, 26]. È anche in grado di innescare l'attivazione di una cascata MMP [27]. Una caratteristica unica di MMP-7 è la sua espressione limitata prevalentemente in cellule epiteliali di tessuto ghiandolare compreso mammaria normale, fegato, pancreas, prostata e ghiandole peribronchiali [28].
Si è trovato che MMP-7 è sovraespresso in invasiva tumori di organi digestivi, ad esempio esofagea [29], gastrica [30], del pancreas [31, 32], del colon-retto [33-35], fegato [36] e di altri organi. Il livello di espressione di MMP-7 è significativamente associata con la trasformazione delle cellule tumorali, fenotipi di tumori aggressivi e stadio del tumore progressione [37], in particolare nei tumori del tratto gastrointestinale. La sovraespressione di MMP-7 viene spesso identificata in lesioni gastriche precancerose e carcinomi gastrici più [18-21, 24, 38]. Una correlazione positiva di MMP-7 livelli con l'invasione del tumore della parete gastrica, metastasi linfonodali, la diffusione peritoneale e la sopravvivenza dei pazienti affetti da cancro gastrico è stata documentata in diversi studi [23]. MMP-7 è stato riconosciuto come un importante mediatore di progressione del cancro e considerato come un indicatore prognostico indipendente per il cancro gastrico primario. Tuttavia, i possibili meccanismi molecolari di MMP-7 sovraespressione di cancro gastrico sono ancora in gran parte inesplorato.
Nel presente studio, abbiamo studiato gli effetti della stimolazione catecolamine su MMP-7 espressione in linee cellulari di cancro gastrico e chiarito i meccanismi molecolari di l'up-regolazione di MMP-7 livello di catecolamine attraverso un percorso di segnalazione adrenergico.
Risultati
stimolazione Isoproterenol up-regola l'espressione di MMP-7
E 'stato dimostrato che l'espressione di MMP-9 in ovarico cancro era significativamente migliorata nel tumore macrofagi associati nei pazienti con sintomi depressivi elevati [15] e catecolamine potenziato espressione LPS-indotta di MMP nei monociti umani [39]. Al fine di verificare se associa catecolamine con l'espressione di MMP-7 in cellule di cancro gastrico, in primo luogo abbiamo ispezionato gli effetti di β-AR agonisti isoproterenolo sulla trascrizione di MMP-7 gene in linee cellulari di cancro gastrico HGC-27 e MGC-803 . Le dosi di catecolamine utilizzata in questo studio sono stati selezionati per riflettere le condizioni fisiologiche di questo ormone nei tumori [40, 41]. Semi-quantitativa e real-time PCR analisi ha mostrato che MMP-7 l'espressione a livello trascrizionale è stata bassa in linee cellulari di cancro gastrico. Quando le cellule sono state esposte a 10 pM di isoproterenolo nei mezzi privi di siero per 12 h, MMP-7 livelli di mRNA sono stati notevolmente aumentati in entrambe le linee cellulari (Fig. 1A e 1B). Per determinare se l'aumento del livello di MMP-7 mRNA porta ad un aumento simile della produzione di proteine, MMP-7 espressione in HGC-27 e MGC-803 cellule è stata analizzata mediante Western Blot. Come mostrato in Fig. 1C, la stimolazione isoproterenolo determinato un significativo up-regolazione di MMP-7 espressione in HGC-27 e MGC-803 cellule. β2-AR, che media la maggior parte degli effetti delle catecolamine, è stato identificato in seno e cellule di cancro ovarico [11, 13]. Per chiarire il ruolo della segnalazione β2-AR-mediata in MMP-7 di espressione, abbiamo utilizzato un antagonista propranololo β-AR e antagonista selettivo β2-AR ICI-118.551 per verificare se l'effetto di isoproterenolo su MMP-7 espressione può essere inibita. I nostri dati hanno mostrato che il trattamento con propranololo e ICI-118.551 efficacemente bloccato isoproterenolo stimolata MMP-7 espressione (Fig. 1D, pannello superiore). Abbiamo poi esaminato se β2-AR è espresso in cellule di cancro gastrico. I dati hanno mostrato che l'espressione di β2-AR era rintracciabile in tre linee di cellule di cancro gastrico tra cui HGC-27, MGC-803 e MKN-45 (Fig. 1D, pannello inferiore). Questi dati hanno indicato che isoproterenolo stimolato la produzione di MMP-7 in linee cellulari di cancro gastrico e che l'up-regolazione di MMP-7 l'espressione da isoproterenolo è stata innescata principalmente da β2-AR segnalazione mediata. Figura 1 stimolazione Isoproterenol up-regola l'espressione di MMP-7. A e B, HGC-27 e MGC-803 cellule sono state incubate in terreno privo di siero e poi trattati con 2 o 10 pM isoproterenolo, rispettivamente. L'espressione di MMP-7 mRNA è stato analizzato mediante RT-PCR (A) e real-time PCR (B). C, HGC-27 cellule sono state stimolate con cellule 0, 1 o 2 pM isoproterenolo e MGC-803 con 0, 5 e 10 pM isoproterenolo dopo deprivazione di siero. L'espressione di MMP-7 proteina è stata analizzata mediante Western blot. D, MGC-803 cellule sono state trattate con 10 mM propranololo o 1 mM ICI-118.551 per 1 ora e poi con 10 pM isoproterenolo. MMP-7 l'espressione è stata analizzata mediante Western blot (pannello superiore); l'espressione di β2-AR in MGC-803, MKN-45 e HGC-27 cellule è stato rilevato dal Western Blot (pannello inferiore).
Isoproterenol up-regola MMP-7 attività del promotore e attiva STAT3 e AP-1
Per esplorare i meccanismi molecolari con cui catecolamine una up-regulation MMP-7 di espressione, in primo luogo abbiamo determinato se la stimolazione isoproterenolo può influenzare direttamente MMP-7 attività del promotore. Abbiamo costruito un plasmide PMMP-7 contenente un gene reporter luciferasi azionato da un 340 bp MMP-7 promotore frammento (-296 - +44) (Fig. 2a). MGC-803 cellule sono state trasfettate con PMMP-7 e l'effetto di isoproterenolo su MMP-7 promotore attività è stata valutata mediante saggi di luciferasi. Come mostrato in Fig. 2B, dopo stimolazione isoproterenolo per 1 ora, le attività luciferasi ha cominciato a salire e gradualmente migliorata. Al 6 ore dopo l'esposizione, MMP-7 attività promotrici hanno mostrato un eccesso di duplice aumento rispetto alle cellule di controllo non stimolate, il che suggerisce che la stimolazione isoproterenolo potrebbe indurre direttamente la transattivazione di MMP-7 promotore. Figura 2 Isoproterenol up-regola MMP-7 attività del promotore e attiva STAT3 e AP-1. Una rappresentazione schematica del plasmide PMMP-7 contenente un gene reporter luciferasi azionato da un 340 bp MMP-7 frammento di promotore. SBE, sito STAT3; ABE, AP-1 sito. B, MGC-803 cellule sono state co-trasfettate con PMMP-7 e prl-TK. Dopo trasfezione per 48 ore, le cellule sono state incubate in terreno privo di siero per altre 24 h quindi stimolate con 10 pM isoproterenolo per 0, 1, 2, 3, 6 o 9 ore, rispettivamente. MMP-7 attività di promotore sono stati valutati mediante saggi luciferasi. C e D, MGC-803 cellule sono state trattate con 10 mM propranololo per 1 ora e poi con 10 pM isoproterenolo per 0, 15, 30, 60, 120 o 180 min rispettivamente. La fosforilazione di STAT3 e c-Jun è stato analizzato mediante Western blot con anti-fosforo-STAT3 e anti-fosforo-c-Jun coniglio anticorpi policlonali. ISO, isoproterenolo.
Nel nostro precedente studio [42, 43], abbiamo identificato un sito di legame AP-1 nella posizione -67 a -61 e tre STAT3 siti di legame nelle posizioni -137 a -122, -168 a -159 e -255 a -245 in MMP-7 promotore (Fig. 2A). Abbiamo inoltre dimostrato che AP-1 e STAT3 tenuti ad AP-1 e uno dei STAT3 (-137 a -122) siti, regolando positivamente MMP-7 trascrizione. Un recente studio ha dimostrato che catecolamine ha il potenziale per attivare STAT3. Per studiare se catecolamine stimola MMP-7 trascrizione attraverso l'attivazione di STAT3 e AP-1, abbiamo analizzato la fosforilazione di STAT3 e c-giugno Figura. 2C mostrato che isoproterenolo causato la fosforilazione di STAT3 dopo 30 min di stimolazione, raggiungendo un picco a 2 h. Sebbene l'attivazione di c-Jun era lento, iniziata a 60 min, una fosforilazione massimo è stato raggiunto a 2 h, nonché (Fig. 2D). Significava che la stimolazione isoproterenolo ha prodotto un segnale β2-AR-mediata che ha innescato l'attivazione di STAT3 e AP-1. Elemento
STAT3 in MMP-7 promotore non è necessaria e STAT3 non sufficiente per MMP-7 espressione isoproterenolo indotta
al fine di determinare se gli elementi STAT3 sono funzionali in isoproterenolo indotta MMP-7 trascrizione del gene, in primo luogo abbiamo intrapreso la mutagenesi dei tre siti di STAT3 attraverso mutare le principali sequenze di siti STAT3 basati su PMMP-7 (Fig. 3A) e costruito il plasmide PMMP-7ms. Il plasmide è stato trasfettato in cellule MGC-803. Dopo trasfezione per 48 ore, le cellule sono state incubate in terreno privo di siero notte e quindi stimolate con 10 pM di isoproterenolo per 6 h. Abbiamo notato, a sorpresa, che la mutazione di tutti e tre i siti di legame STAT3 non ha avuto effetti di rilievo sulla transattivazione di MMP-7 promotore. Come mostrato in Fig. 3B, attività luciferasi sono stati progressivamente aumentati e si avvicinò un picco a 6 ore dopo l'esposizione. Il risultato è stato molto simile a quello osservato nelle cellule trasfettate con wild type MMP-7 promotore. Per identificare il ruolo di STAT3 in questo evento, HGC-27 e MGC-803 cellule sono state trasfettate con pGeneSuppressor esprimere shRNA mira STAT3 e HGC-27 /STAT3-sh e MGC-803 /cellule STAT3-sh stabiliti. Figura. 3C ha mostrato che l'espressione di STAT3 è stata soppressa in modo efficiente in entrambe le cellule. In accordo con i dati di cui sopra, MMP-7 attività di promotore isoproterenolo indotta sembravano non essere significativamente ridotta in MGC-803 /cellule STAT3-sh (Fig. 3D). Inoltre, isoproterenolo indotta MMP-7 di espressione sia a livello di mRNA che di proteine ​​non è stato soprattutto influenzato da tacere espressione di STAT3, come dimostrato mediante RT-PCR, real-time PCR e Western Blot (Fig. 3E, F e 3G). I risultati suggeriscono che elemento STAT3 in MMP-7 promotore non è richiesto e STAT3 non sufficiente per MMP-7 espressione isoproterenolo indotta. Figura 3 elemento STAT3 in MMP-7 promotore non è richiesto e STAT3 non sufficiente per MMP-7 espressione isoproterenolo indotta. A, rappresentazione schematica del plasmide PMMP-7MS contenente tre siti mutati STAT3 nelle posizioni -255 a -245, -168 a -159 e -137 a -122. B, MGC-803 cellule sono state co-trasfettate con PMMP-7MS e pRL-TK, fame, e quindi stimolate con 10 pM isoproterenolo per 0, 1, 2, 3, 6 o 9 ore, rispettivamente. MMP-7 attività di promotore sono stati valutati mediante saggi luciferasi. C, HGC-27 e MGC-803 cellule sono state stabilmente trasfettate con pGeneSuppressor esprimere STAT3 shRNA. L'espressione di STAT3 è stata analizzata mediante Western blot in HGC-27 /STAT3-sh e le cellule /STAT3-sh MGC-803. D, MMP-7 attività promotore sono stati dosati in MGC-803 cellule /STAT3-sh dopo stimolazione con isoproterenolo 10 pM per 0, 1, 2, 3, 6 o 9 ore, rispettivamente. E a G, HGC-27 /STAT3-sh e le cellule /STAT3-SH-803 MGC sono state stimolate con 2 micron o 10 micron isoproterenolo, rispettivamente. L'espressione di MMP-7 è stata analizzata mediante RT-PCR (E), real-time PCR (F) e Western Blot (G).
AP-1 gioca un ruolo critico nella MMP-7 espressione isoproterenolo indotta
I dati sopra riportati è stato inaspettato, dato che STAT3 potrebbe essere attivata dalla stimolazione isoproterenolo. Inoltre, nel nostro studio precedente [42, 43], abbiamo dimostrato che STAT3 e AP-1 hanno partecipato nella regolazione Her2 segnalazione mediata MMP-7 espressione in cellule del cancro al seno. Abbiamo quindi cercato di indagare se AP-1 influenze isoproterenolo indotta MMP-7 espressione. MGC-803 cellule sono state trasfettate con il plasmide PMMP-7mA contenente un mutato AP-1 sito nella posizione -67 a -61 in attività MMP-7 promotore e luciferasi misurata (Fig. 4A). Sorprendentemente, MMP-7 attività di promotore isoproterenolo indotta erano completamente scomparse in tutti i tempi (Fig. 4B), suggerendo che il sito AP-1 è stata fondamentale in MMP-7 espressione isoproterenolo indotta. Figura 4 AP-1 gioca un ruolo critico nella MMP-7 espressione isoproterenolo indotta. Una rappresentazione schematica del plasmide PMMP-7mA contenente un mutato AP-1 sito nella posizione -67 a -61. B, MGC-803 cellule sono state co-trasfettate con PMMP-7mA e pRL-TK, fame e quindi stimolate con 10 pM isoproterenolo per 0, 1, 2, 3, 6 o 9 ore, rispettivamente. MMP-7 attività di promotore sono stati valutati mediante saggi luciferasi. C, MGC-803 cellule co-trasfettate con TAM67, PMMP-7 e prl-TK sono stati indotti con 10 micron isoproterenolo. MMP-7 attività di promotore sono stati analizzati mediante saggi luciferasi. D, MGC-803 cellule che esprimono stabilmente shRNA mira c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) sono stati stabiliti e l'espressione c-giugno è stata analizzata mediante Western Blot. E, MMP-7 attività promotore sono stati dosati in cellule /c-Jun-sh MGC-803 dopo stimolazione con isoproterenolo 10 pM per 0, 1, 2, 3, 6 o 9 ore, rispettivamente. F, MMP-7 è stata analizzata l'espressione di MGC-803 cellule /c-Jun-sh dopo stimolazione con 0, 2 o 10 micron isoproterenolo, rispettivamente. G, i plasmidi che esprimono c-Jun e STAT3C sono state trasfettate in MGC-803 cellule /c-Jun-sh, rispettivamente. MMP-7 attività di promotore sono stati analizzati mediante saggi luciferasi.
Per confermare MMP-7 espressione isoproterenolo indotta è controllato da AP-1, abbiamo poi esaminato se la transattivazione di MMP-7 promotore indotto da isoproterenolo potrebbe essere inibita da una posizione dominante negativo c-Jun mutante TAM67, che manca il c-Jun dominio 5'-transattivante ma possiede un funzionale leucina cerniera c-Jun e il dominio di legame al DNA. Dopo trasfezione transiente con TAM67 in MGC-803 cellule, transattivazione isoproterenolo indotta di MMP-7 promotore è stata analizzata mediante saggi di luciferasi. Come mostrato in Fig. 4C, l'espressione del dominante negativo c-Jun esposto un impatto frenante cospicua sulle attività MMP-7 promotore. Per verificare ulteriormente il ruolo critico di AP-1, abbiamo testato se il blocco in modo endogeno espresso c-Jun in grado di inibire l'espressione di MMP-7. Le cellule /c-Jun-sh MGC-803 sono stati stabiliti (Fig. 4D) e MMP-7 attività promotore analizzati mediante saggi luciferasi. I dati in Fig. 4E ha mostrato che le attività di MMP-7 promotore sono stati sorprendentemente ridotti di knock-down dell'espressione c-giugno analisi Western blot inoltre dimostrato che MMP-7 espressione isoprotereol indotta era marcatamente diminuita in MGC-803 cellule /c-Jun-sh, che sostanzialmente grande quantità di MMP-7 proteina è stata rilevata nelle cellule parentali dopo la stimolazione con isoproterenolo (Fig. 4F). In particolare, la sovraespressione di esogeno c-Jun drammaticamente restaurato MMP-7 attività promotore-803 MGC cellule /c-Jun-sh, ma costitutivamente attivato STAT3 mutante STAT3C solo in minima attivato MMP-7 promotore quando l'espressione di c-Jun è stato messo a tacere (Fig . 4G). Questi dati hanno dimostrato che AP-1 dominata MMP-7 espressione isoproterenolo indotta.
C-Jun e STAT3 regolano sinergicamente MMP-7 espressione in risposta alla stimolazione isoproterenolo
cooperazione di Stat3 e c-Jun nel regolare una varietà di la trascrizione del gene è stato segnalato. Il nostro precedente studio dimostra che l'attivazione di MMP-9 promotore dipende dalla interazione di Stat3 e AP-1 [44]. Come accennato in precedenza, la stimolazione isoproterenolo indotto l'attivazione di STAT3 e AP-1 simultaneamente. Abbiamo ipotizzato che Stat3 e AP-1 possono sinergicamente partecipare alla regolazione della MMP-7 espressione isoproterenolo-stimolata. È stato indicato che AP-1 coopera con STAT3 in interleuchina 6 transattivazione indotta della risposta elemento IL-6 in assenza di diretta AP-1 DNA binding [45]. Essa ci ha spinto a testare l'eventuale legame cooperativo di AP-1 /STAT3 al sito AP-1.
Per determinare se che STAT3 e AP-1 possono essere reclutati per il sito AP-1 in MMP-7 promotore in vivo , MGC-803 cellule sono state stimolate con 10 pM di isoproterenolo per 0, 2,5 o 4 h, rispettivamente. Il DNA della cromatina /complessi proteici nucleari erano pronti e vincolante di STAT3 e c-Jun al sito AP-1 è stata analizzata mediante saggi chip. Il prodotto di PCR per l'amplificazione selezionata estende dal -76 a +165 regione ospitare il sito AP-1 in MMP-7 promotore. L'immunoprecipitazione con anti-STAT3 e anti-c-Jun anticorpi seguita da PCR ha prodotto una banda 241 bp previsto dalle precipitanti dopo stimolazione isoproterenolo per 2,5 ore. Le intensità di queste bande sono state indebolite dopo 4 ore. Al contrario, in cellule di controllo non stimolate non vincolante di STAT3 a questo sito è stata osservata e il legame di c-Jun appena rilevabile. Nessun gruppo è stato amplificato mediante immunoprecipitazione utilizzando il coniglio IgG (Fig. 5A). I dati sono stati confermati da real-time PCR (Fig. 5B). Questi dati hanno dimostrato che l'associazione di STAT3 e c-Jun con MMP-7 promotore in vivo
era specifico e che la stimolazione isoproterenolo indotta legame di STAT3 /c-Jun all'elemento AP-1. Figura 5 c-Jun e STAT3 sinergicamente regolano MMP-7 espressione. A e B, MGC-803 cellule sono state stimolate con 10 pM di isoproterenolo per 0, 2,5 o 4 h, rispettivamente. Il DNA della cromatina /complessi proteici nucleari sono stati preparati. Il legame di STAT3 e c-Jun al sito AP-1 è stata analizzata dalla immunoprecipitazione con anticorpi anti-STAT3 ed anti AP-1-anticorpi seguita da PCR (A) e real-time PCR (B). C, MGC-803 cellule sono state trattate con 10 mM isoproterenolo per 0 o 2,5 h, rispettivamente. L'estratto nucleare è stato preparato con un kit Nucleare-Cytosol estrazione. β-tubulina e AP-2α sono stati analizzati mediante Western blot per esaminare la separazione delle proteine ​​citoplasmatiche e nucleari. C, proteine ​​citosoliche; N, proteine ​​nucleari. D, 200 mg di estratti nucleari è stata incubata a 4 ° C per 4 h con gli oligonucleotidi biotinilati contenenti AP-1 sequenza consenso precedentemente accoppiato Dynabeads M-280 in presenza o assenza di uno, cinque o 15 quantità piega del doppio concorrenti oligonucleotide -stranded. L'incubazione delle proteine ​​nucleari con gli oligonucleotidi a doppio filamento contenenti un mutato AP-1 sito (Mut Oligo) o non specifici oligonucleotidi a doppio filamento (NS Oligo) è stato utilizzato come controllo. Le proteine ​​/complessi di DNA sono stati separati con un magnete Dynal, e sottoposti a SDS-PAGE. STAT3 e c-Jun sono stati rilevati mediante Western blot con anti-STAT3 e anti-c-jun. E e F, MGC-803 cellule sono state co-trasfettate con i plasmidi PMMP-7mA e pcDNA3.1 /c-Jun o attività STAT3C e luciferasi sono stati analizzati.
Per caratterizzare ulteriormente l'interazione di STAT3 /c-Jun con il AP-1 sito, abbiamo eseguito un test di affinità di precipitazione del DNA. Dopo MGC-803 cellule sono state trattate con isoproterenolo per 2,5 h, l'estratto nucleare è stato preparato e la sua qualità è stata valutata (Fig. 5C). Gli oligonucleotidi biotinilati corrispondenti a -74 a -52 regione della MMP-7 promotore sono state incubate con 200 mg di estratti nucleari per i saggi di pull-down. Le sfere magnetiche rivestite di streptavidina sono stati usati per precipitare oligonucleotidi a doppio filamento biotina marcata e DNA-binding protein associati. Il legame delle proteine ​​nucleari ai oligonucleotidi biotinilati sono stati analizzati in presenza di uno, cinque, o 15 volte quantità di concorrenti a doppio filamento oligonucleotidi contenenti AP-1 sequenze consensus. L'incubazione delle proteine ​​nucleari con gli oligonucleotidi a doppio filamento contenente una mutato AP-1 posto o non specifici oligonucleotidi a doppio filamento è stato usato come controllo. I risultanti complessi DNA-proteina sono state risolte mediante SDS-PAGE, seguita da Western blot con anti-c-Jun e gli anticorpi anti-STAT3. L'associazione di entrambi i fattori trascrizionali con oligonucleotidi contenenti AP-1 sequenze consenso potrebbe essere chiaramente individuato negli estratti nucleari di cellule isoproterenolo-stimolato, ma non da cellule non stimolate. Competizione con quindici quantità piega dei concorrenti del tutto abolita la formazione dei complessi DNA /proteina biotinilati (Fig. 5d). Nessun legame di c-Jun e STAT3 a uno è stato rilevato l'oligonucleotidi contenenti un mutato AP-1 sito o oligonucleotidi non specifici (Fig. 5D). Questo esperimento fornisce in evidenza vitro per confermare che STAT3 e c-Jun, sotto stimolazione catecolamine, può interagire fisicamente e si legano al sito di AP-1 per ottenere transattivazione di MMP-7 gene in cellule di cancro gastrico.
Abbiamo dimostrato che isoproterenolo indotta MMP-7 attivazione del promotore non è stato interrotto dalla mutagenesi dei core-sequenze di tutti e tre i siti STAT3, il che suggerisce che gli elementi di STAT3 non possono agire in isoproterenolo indotta MMP-7 trascrizione genica in cellule di cancro gastrico. Per verificare ulteriormente il ruolo di AP-1 elemento, il plasmide PMMP-7mA è stato co-trasfettato in MGC-803 cellule sia con pcDNA3.1 /rispettivamente c-Jun o STAT3C,. È interessante notare che la mutazione di AP-1 sito di legame accuratamente bloccato l'attivazione di MMP-7 promotore nelle cellule trasfettate sovraespressione o c-Jun o STAT3C (Fig. 5E e 5F), indicando che il sito AP-1 è un elemento regolatore importante e la regolazione sinergica di isoproterenolo indotta MMP-7 l'espressione da STAT3 e AP-1 si basa su questo elemento.
β2-AR e MMP-7 sono stati colocalized nei tessuti di cancro gastrico
il sovraespressione di MMP-7 è stato spesso nella parte anteriore invasiva del cancro gastrico umano e direttamente associati con la prognosi nei pazienti con cancro gastrico. Per studiare la correlazione tra livello di β2-AR con MMP-7 di espressione nel carcinoma gastrico umano, abbiamo raccolto cinque campioni di tessuto cancro gastrico e analizzato l'espressione di β2-AR e MMP-7 mediante l'etichettatura immunoistochimica. È interessante notare che la forte espressione di β2-AR e MMP-7 emerso alla stessa regione dei tessuti tumorali (Fig. 6A), suggerendo un intimo rapporto tra MMP-7 e β2-AR. Per studiare ulteriormente il ruolo della MMP-7 e β2-AR nella metastasi del cancro gastrico, abbiamo analizzato l'espressione di MMP-7 e beta-AR nei tessuti cancerosi, peri-cancerose e metastatici da un paziente con cancro gastrico. Come mostrato in Fig. 6B, l'espressione di β1-AR, β2-AR e MMP-7 a livello proteico era più alta nel tessuto canceroso che nei tessuti peri-cancerose. Tuttavia, la più alta espressione di loro è stato trovato nel tessuto metastatico. Inoltre, MMP-7 mRNA è stato anche sovraespresso nei tessuti metastatici (Fig. 6C). Questi dati implicano fortemente uno stretto legame tra MMP-7, β2-AR e le metastasi del cancro gastrico. Figura 6 β2-AR e MMP-7 sono stati overexpressed nei tessuti di cancro gastrico. A, sono stati raccolti cinque campioni di tessuto di cancro gastrico. L'espressione di β2-AR e MMP-7 è stata analizzata mediante immunoistochimica. B, l'espressione di MMP-7, β1-AR e β2-AR nei tessuti cancerosi, peri-cancerose e metastatici è stata analizzata mediante Western Blot. C, il livello di MMP-7 mRNA nei tessuti cancerosi, peri-cancerose e metastatici è stata analizzata mediante real-time PCR.
Discussione
Il presente studio si è basato sull'ipotesi che lo stress psico-sociale può essere un fattore predisponente nel cancro gastrico. Stress, ansia e depressione possono causare complessi fisiologici e neuroendocrini modifiche che influenzano più sistemi, compreso il sistema digestivo. I pazienti affetti da cancro spesso esperienza notevole stress emotivo. L'associazione di stress fisiologico con l'elevazione della secrezione acida gastrica e mal di stomaco è stato a lungo notato [46, 47]. E 'stato riportato che lo stress cronico può aggravare le ulcere allo stomaco. In un recente sondaggio, basato sulla popolazione ha arruolato 2014 soggetti, lo stress è stato considerato come il più potente fattore di rischio per il cancro gastrico [48]. I risultati di studi sperimentali suggeriscono che un'aumentata attività del sistema nervoso simpatico può costituire un meccanismo primario attraverso il quale l'espressione genica fattori fisiologici impatto nei tumori [49]. Fino ad oggi, la maggior parte degli studi che hanno valutato i meccanismi che collegano la progressione stress e cancro è stata relativa a effetti indiretti attraverso l'immunosoppressione [8]. In diversi studi recenti, le proteine ​​e percorsi legati allo stress sono stati collegati direttamente alla alterazione del comportamento delle cellule maligne [10-17]. Tuttavia, vi è una scarsità di dati che delineano i meccanismi molecolari coinvolti.
Nel presente studio, abbiamo identificato aumentato MMP-7 espressione nelle linee di cellule di cancro gastrico in risposta alla stimolazione dell'ormone catecolamine legati allo stress. Si stima che la concentrazione di catecolamine potrebbe essere più di 100 volte superiore nel microambiente tumorale rispetto al tessuto normale e plasma circolante. MMP-7 è unico nella sua espressione limitata in cellule tumorali, indicando che MMP-7 espressione è in un modo tumore-associata. Abbiamo notato che la stimolazione isoproterenolo significativamente up-regolata MMP-7 di espressione sia a livello di mRNA che di proteine ​​nelle cellule di cancro gastrico. β2-AR antigonist effettivamente abrogato MMP-7 espressione isoproterenolo indotta up-regulation, suggerendo che via β2-AR-mediata è coinvolto nel processo.
MMP-7 espressione è strettamente controllata a livello della trascrizione. Il nostro precedente studio ha dimostrato che heregulin-β-indotta MMP-7 espressione è stata regolata da STAT3 HER2-mediata e AP-1 attivazione in linee cellulari di cancro al seno umano [42, 43]. Abbiamo anche individuato i siti di legame funzionali AP-1 e STAT3 nel primo 350 bp del sito di inizio della trascrizione in MMP-7 promotore umano [42, 43]. Un altro studio ha indicato che FGF-2 potrebbe upregulate direttamente MMP-7 l'espressione genica in linee cellulari tumorali umane e cellule endoteliali della vena ombelicale attraverso AP-1 e STAT3 [50]. prove accumulando sostiene con forza che STAT3 funge da nodo di regolamentare centrale su cui molteplici vie di segnalazione oncogeno convergono [51]. attivazione aberrante di STAT3 è stato dimostrato di giocare un ruolo fondamentale nello sviluppo del cancro gastrico [52, 53]. Un recente studio ed i nostri dati hanno scoperto l'associazione di catacholamine con l'attivazione di STAT3 in cellule di cancro ovarico e della mammella [12, 13]. Nel presente studio, abbiamo dimostrato che la stimolazione isoproterenolo prominente indotto l'attivazione di STAT3 in cellule di cancro gastrico, implicando che catecolamine può accelerare la progressione maligna di cancro gastrico. I nostri dati non pubblicati anche dimostrato che isoproterenolo stimolato l'espressione di MMP-2 e MMP-9 in cellule di cancro gastrico principalmente attraverso l'attivazione di STAT3. Tuttavia, in questo studio, abbiamo scoperto che AP-1 appare una maggiore efficacia di STAT3 in isoproterenolo indotta MMP-7 gene trascrizione e gli elementi di STAT3 erano non-funzionali, come il silenziamento espressione di STAT3 non è stato efficace nel prevenire MMP- isoproterenolo indotta 7 espressione e mutagenesi dei tre siti di legame STAT3 non è riuscito a reprimere la transattivazione di MMP-7 promotore in risposta ad induzione isoproterenolo. Al contrario, il sito AP-1 e c-Jun regolate questo processo. È interessante notare che, STAT3 e c-giugno sono stati trovati per legare al singolo AP-1 sito in MMP-7 promotore contemporaneamente, implicando che l'interazione di due fattori di trascrizione in un sito di legame è responsabile di MMP-7 espressione isoproterenolo stimolata a cancro gastrico cellule. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• alterazione proteomica in adenocarcinomi gastic da pazienti giapponesi
• Un paziente con cancro gastrico con carcinosi peritoneale trattati con chemioterapia intraperitoneale che è sopravvissuto più di 5 anni che riceve esami laparoscopica ripetuti: un caso clinico