Katecholamin hochreguliert MMP-7-Expression durch die Aktivierung AP-1 und STAT3 in Magen cancer

Katecholamin hochreguliert MMP-7-Expression durch die Aktivierung AP-1 und STAT3 bei Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Stress, Angst und Depressionen können komplexe physiologische und neuroendokrine Veränderungen verursachen, was zu einem erhöhten Maß an Stress-Hormon Katecholamin, das eine primäre Mechanismus, mit dem bilden können physiologische Faktoren beeinflussen die Genexpression in Tumoren. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Auswirkungen der Katecholamin-Stimulation auf die MMP-7-Expression in Magenkrebszellen und aufgeklärt, die molekularen Mechanismen der Hochregulation von MMP-7 Niveau von Katecholamin durch einen adrenergen Signalweg.
Ergebnisse
erhöhte MMP-7-Expression wurde sowohl auf mRNA- und Protein-Spiegel in den Magenkrebszellen in Reaktion auf Isoproterenol Stimulation identifiziert. β2-AR antigonist effektiv Isoproterenol-induzierte MMP-7 Expression außer Kraft gesetzt. Die Aktivierung des STAT3 und AP-1 wurde prominent durch Isoproterenol induzierten Stimulation und AP-1 eine höhere Wirksamkeit als STAT3 in Isoproterenol-induzierte MMP-7 die Expression angezeigt. Mutagenese von drei STAT3-Bindungsstellen in MMP-7-Promotor konnte die Transaktivierung von MMP-7-Promotor zu unterdrücken und die Expression von STAT3 zum Schweigen zu bringen war nicht wirksam bei der Verhinderung Isoproterenol-induzierte MMP-7-Expression. Jedoch wurden Isoproterenol-induzierte MMP-7-Promotor-Aktivitäten vollständig verschwunden, wenn die AP-1-Stelle mutiert war. STAT3 und c-Jun konnte physisch interagieren und an die AP-1-Stelle binden, Verwicklung, dass das Zusammenspiel der beiden Transkriptionsfaktoren auf die AP-1-Stelle für Isoproterenol-stimulierte MMP-7-Expression in Magenkrebszellen verantwortlich ist. Die Expression von MMP-7 im Magenkrebsgewebe gefunden wurde an der Stelle, an dem β2-AR und die Niveaus von MMP-7 überexprimiert und β2-AR waren die höchsten in der metastatischen Locus von Magenkrebs.
Schlussfolgerungen
Up-Regulation von MMP-7-Expression durch β2-AR-vermittelten Signalweg ist in der Invasion und Metastasierung von Magenkrebs beteiligt.
Hintergrund
Magenkrebs ist die zweithäufigste führende Ursache von Krebs im Zusammenhang mit dem Tod, mit rund 700 000 Todesfälle pro Jahr [1, 2]. Einer der wichtigen Faktoren bei der Pathogenese von Magenkrebs ist eine chronische Infektion mit Helicobacter pylori
[3]. Allerdings entwickeln die meisten infizierten Personen nicht Bösartigkeit und das Ergebnis der Infektion ist abhängig von Host, Umwelt- und andere Faktoren [4]. Es gibt immer mehr Beweise für die Rolle der psychologischen Stress in der Magenkrebs-Entstehung und Entwicklung [5] zu unterstützen. Mehrere epidemiologische Studien haben gezeigt, dass psychische oder verhaltensrelevanten Stressfaktoren das Fortschreiten von Magenkrebs [6, 7] beschleunigen kann. Allerdings ist der genaue Mechanismus, durch den psychologischen Stress Magenkrebs Progression wirkt, ist unklar.
Spannung löst eine Reaktion des Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA), was zu erhöhten Katecholaminspiegel resultierende [8, 9]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Stimulation von Catecholamin mit bio-Verhalten von Tumorzellen interferiert direkt, vor allem durch β2-adrenergen Rezeptoren (β2-AR) -vermittelten Signalweg [10-14]. Neuere Beobachtungen zu einem potentiellen Mechanismus für das Fortschreiten der ovariellen zeigt, nasopharyngealen und Bauchspeicheldrüsenkrebs zeigen, dass die Expression von Katecholamin Matrixmetalloproteinase modulieren kann (MMP) -2 und MMP-9 durch Stroma und Tumorzellen [15-17]. Es wirft eine interessante Frage, die psychische Belastung durch Modulation der Expression von MMPs durch β2-AR-vermittelten Signalweg eine Rolle bei der Entwicklung und Progression von Magenkrebs spielen können. Kumulierte Beweislinien zeigen
, die MMP-7 in der beteiligt ist Invasion und Metastasierung von Magenkrebs [18-24]. MMP-7 ist die kleinste bekannte Mitglied der MMP-Familie und besitzt die höchste extrazelluläre Matrix (ECM) -degradative Aktivität gegen eine Reihe von ECM-Komponenten, einschließlich Elastin, Gelatine, Typ IV-Kollagen, Fibronectin, Vitronectin, Laminin, Entactin, Aggrecan und Proteoglykane unter den MMPs [25, 26]. Es ist auch in der Lage das Auslösen der Aktivierung einer Kaskade MMP [27]. Ein einzigartiges Merkmal von MMP-7 ist seine eingeschränkte Expression vorwiegend in Epithelzellen von Drüsengewebe einschließlich der normalen Brust-, Leber, Bauchspeicheldrüse, der Prostata und peribronchiale Drüsen [28].
Es hat sich gezeigt, dass MMP-7 in der invasiven überexprimiert Krebserkrankungen der Verdauungsorgane, wie beispielsweise ösophageale [29], Magen- [30], [31, 32] Pankreas-, Dickdarm- [33-35], der Leber [36] und anderen Organen. Das Expressionsniveau von MMP-7 ist signifikant mit der Transformation von Tumorzellen, die Phänotypen von aggressive Krebsarten und Stadium der Tumorprogression [37], insbesondere in Tumoren des Magen-Darm-Trakt verbunden sind. Die Überexpression von MMP-7 wird in prämalignen Läsionen des Magens und Magenkarzinomen meisten häufig identifiziert [18-21, 24, 38]. Eine positive Korrelation von MMP-7-Ebene mit der Tumorinvasion der Magenwand, Lymphknotenmetastasen, Peritonealdialyse Verbreitung und das Überleben von Patienten mit Magenkrebs wurde in mehreren Studien belegt [23]. MMP-7 wurde als ein wichtiger Mediator der Tumorprogression und gilt als unabhängiger prognostischer Marker für primäre Magenkrebs erkannt. Allerdings sind die möglichen molekularen Mechanismen von MMP-7-Überexpression bei Magenkrebs immer noch weitgehend unerforscht.
In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Auswirkungen der Katecholamin-Stimulation auf die MMP-7-Expression in Magenkrebs-Zelllinien und erläutert die molekularen Mechanismen der die hoch~~POS=TRUNC von MMP-7 Niveau von Katecholamin durch einen adrenergen Signalweg.
Ergebnisse | Isoproterenol Stimulation hochreguliert die Expression von MMP-7
Es wurde gezeigt, dass die Expression von MMP-9 in ovarian Krebs wurde in Tumor-assoziierten Makrophagen in den Patienten mit erhöhten depressive Symptome signifikant erhöht [15] und Catecholamin potenziert LPS-induzierte Expression von MMPs in humanen Monozyten [39]. Um zu untersuchen, ob Catecholamin assoziiert mit der Expression von MMP-7 im Magenkrebszellen, werden zunächst die Wirkungen von β-AR-Agonist Isoproterenol auf die Transkription von MMP-7-Gens in Magenkrebszelllinien HGC-27 und MGC-803 inspiziert . Die Dosen von Catecholamin in dieser Studie verwendet wurden, um die physiologischen Bedingungen dieses Hormons in Tumoren widerzuspiegeln ausgewählte [40, 41]. Semi-quantitative und Echtzeit-PCR-Analysen zeigten, dass MMP-7-Expression auf Transkriptionsebene Magenkrebszelllinien war gering. Wenn die Zellen auf 10 uM Isoproterenol in dem serumfreien Medium für 12 h ausgesetzt waren, MMP-7-mRNA-Spiegel in beiden Zelllinien deutlich erhöht wurden (Fig. 1A und 1B). Um zu bestimmen, ob die erhöhte Pegel von MMP-7 mRNA führt zu einem ähnlichen Anstieg in der Proteinproduktion, MMP-7 die Expression in HGC-27 und MGC-803-Zellen wurde durch Western-Blot analysiert. Wie in gezeigt. 1C ergaben Isoproterenol Stimulation in einem signifikanten Hochregulierung der MMP-7 die Expression in HGC-27 und MGC-803-Zellen. β2-AR, die die meisten der Effekte von Katecholamin vermittelt wurde in Brust- und Eierstockkrebszellen [11, 13] identifiziert. Um die Rolle von β2-AR-vermittelten Signalgebung in MMP-7 die Expression klären, verwendeten wir ein β-AR-Antagonist Propranolol und selektiver β2-AR-Antagonisten ICI 118551, um zu testen, ob die Wirkung von Isoproterenol auf MMP-7 die Expression gehemmt werden kann. Unsere Daten zeigten, dass die Behandlung mit Propranolol und ICI 118551 effizient geblockt Isoproterenol-stimulierte MMP-7 Expression (Fig. 1D, oberes Feld). Wir untersuchten dann, ob β2-AR in Magenkrebszellen exprimiert wird. Die Daten zeigten, dass die Expression von β2-AR in drei Magenkrebszelllinien, einschließlich HGC-27 nachweisbar war, MGC-803 und MKN-45 (Fig. 1D, unteres Feld). Diese Daten zeigten, daß Isoproterenol die Produktion von MMP-7 im Magenkrebszelllinien stimuliert und dass die Hochregulierung der MMP-7 die Expression durch Isoproterenol wurde vor allem ausgelöst durch β2-AR-vermittelten Signalisierung. Figur 1 Isoproterenol Stimulation up-reguliert die Expression von MMP-7. A und B, HGC-27 und MGC-803-Zellen wurden über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert und dann mit 2 oder 10 &mgr; M Isoproterenol behandelt, respectively. Die Expression von MMP-7 mRNA wurde durch RT-PCR (A) und Echtzeit-PCR (B) analysiert. C, HGC-27-Zellen wurden mit 0, 1 oder 2 stimuliert uM Isoproterenol und MGC-803-Zellen mit 0, 5 und 10 uM Isoproterenol nach Serumentzug. Die Expression von MMP-7-Protein wurde durch Western-Blot analysiert. D, MGC-803-Zellen wurden mit 10 uM Propranolol behandelt oder 1 uM ICI 118551 für 1 h und dann mit 10 &mgr; M Isoproterenol. MMP-7-Expression wurde durch Western-Blot (oberes Bild) analysiert; die Expression von β2-AR in MGC-803, MKN-45 und HGC-27-Zellen wurde durch Western Blot (untere Tafel) nachgewiesen.
Isoproterenol up-reguliert MMP-7-Promotoraktivität und aktiviert STAT3 und AP-1
Um die molekularen Mechanismen, durch die Katecholamin hochreguliert MMP-7 Expression erkunden wir zunächst kann Aktivität direkt beeinflussen MMP-7-Promotor, wenn Isoproterenol Stimulation bestimmt. Wir konstruierten ein Plasmid PMMP-7 ein Luciferase-Reportergens durch ein 340 bp MMP-7-Promotorfragment (-296 - +44) angetrieben wird, die (Fig. 2A). MGC-803-Zellen wurden mit PMMP-7 transfiziert und die Wirkung von Isoproterenol auf MMP-7-Promotor-Aktivität wurde durch die Luciferase-Assays beurteilt. Wie in gezeigt. 2B, 1 h nach Isoproterenol Stimulation begannen die Luciferase-Aktivitäten zu steigen und nach und nach erweitert. Nach 6 Stunden nach der Exposition, MMP-7-Promotor-Aktivitäten zeigten eine mehr als zweifache Steigerung im Vergleich zu den nicht stimulierten Kontrollzellen, was darauf hindeutet, dass die Isoproterenol Stimulation konnten die Transaktivierung von MMP-7-Promotor direkt induzieren. Figur 2 Isoproterenol up-reguliert MMP-7-Promotoraktivität und aktiviert STAT3 und AP-1. Eine schematische Darstellung des Plasmids PMMP-7 ein Luciferase-Reportergens durch ein 340 bp MMP-7-Promotorfragment angetrieben enthält. SBE, STAT3 Ort; ABE, AP-1-Stelle. B, MGC-803-Zellen wurden kotransfiziert mit PMMP-7 und pRL-TK. Nach der Transfektion für 48 h wurden die Zellen in serumfreien Medium für weitere 24 h inkubiert und dann mit 10 &mgr; M Isoproterenol stimulierte für 0, 1, 2, 3, 6 oder 9 h, respectively. MMP-7-Promotor-Aktivitäten wurden durch die Luciferase-Assays beurteilt. C und D, MGC-803-Zellen wurden für 1 h mit 10 uM Propranolol behandelt und dann mit 10 &mgr; M Isoproterenol für 0, 15, 30, 60, 120 oder 180 min, respectively. Die Phosphorylierung von STAT3 und c-Jun wurde mit Anti-Phosphor-STAT3 und polyklonalen Antikörper anti-Phosphor-c-Jun Kaninchen durch Western-Blot analysiert. ISO, Isoproterenol.
In unserer früheren Studie [42, 43], identifizierten wir eine AP-1-Bindungsstelle an der Position -67 bis -61 und drei STAT3-Bindungsstellen an den Positionen -137 bis -122, -168 bis -159 und -255 bis -245 in MMP-7-Promotor (Fig. 2A). Wir zeigten auch, dass AP-1 und STAT3 zu AP-1 gebunden ist und einer der STAT3 (-137 bis -122) -Stellen, positiv MMP-7 die Transkription regulieren. Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass das Potenzial der Katecholamine STAT3 aktiviert hat. Um zu untersuchen, ob Catecholamin MMP-7 die Transkription über die Aktivierung von STAT3 und AP-1 stimuliert, analysierten wir die Phosphorylierung von STAT3 und c-Juni Feige. 2C gezeigt, dass Isoproterenol die Phosphorylierung von STAT3 nach 30 min Stimulation verursacht werden, einen Peak bei 2 h erreicht. Obwohl die Aktivierung von c-Jun langsam, bei 60 min eingeleitet wurde, wurde eine maximale Phosphorylierung bei 2 h und erreicht (Fig. 2D). Es bedeutet, daß Isoproterenol Stimulation einen β2-AR-vermittelten Signal erzeugt, das die Aktivierung von STAT3 und AP-1 ausgelöst.
STAT3 Element in MMP-7-Promotor ist nicht erforderlich und STAT3 nicht ausreichend für Isoproterenol-induzierte MMP-7 die Expression
um zu bestimmen, ob die STAT3 Elemente funktionsfähig sind in Isoproterenol-induzierte MMP-7 Gentranskription, unternahmen wir zuerst die Mutagenese von drei STAT3 Seiten durch Mutieren der Kern-Sequenzen von STAT3 Seiten basierend auf PMMP-7 (Fig. 3A) und konstruiert, um das Plasmid PMMP-7MS. Das Plasmid wurde in MGC-803-Zellen transfiziert. Nach der Transfektion für 48 h wurden die Zellen über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert und dann mit 10 &mgr; M Isoproterenol für 6 h stimuliert. Wir bemerkt, überraschenderweise, dass die Mutation aller drei STAT3-Bindungsstellen auf der Transaktivierung von MMP-7-Promotor keine herausragende Wirkung. Wie in gezeigt. 3B wurden Luciferase-Aktivitäten nach und nach erhöht und näherte sich nach der Belichtung mit einem Peak bei 6 h. Das Ergebnis war sehr ähnlich, die in den Zellen, die mit Wildtyp-MMP-7-Promotors beobachtet. Zur Identifizierung wurden die Rolle von STAT3 in diesem Fall HGC-27 und MGC-803-Zellen, die mit pGeneSuppressor exprimieren shRNA Targeting STAT3 und HGC-27 /STAT3-sh und MGC-803 /STAT3-SH-Zellen etabliert. Feige. 3C gezeigt, dass die Expression von STAT3 effizient in beiden Zellen unterdrückt wurde. In Übereinstimmung mit obigen Daten Isoproterenol-induzierte MMP-7 erschienen Promotoraktivitäten nicht signifikant in MGC-803 /STAT3-SH-Zellen (Fig. 3D) beeinträchtigt werden. Weiterhin Isoproterenol-induzierte MMP-7 die Expression sowohl auf mRNA- und Proteinebene wurde nicht wichtiger durch Silencing-STAT3-Expression betroffen wie nachgewiesen durch RT-PCR in Echtzeit-PCR und Western-Blot (Fig. 3E, F und 3G). Die Ergebnisse legen nahe, dass Element STAT3 in MMP-7-Promotor wird MMP-7 Expression nicht erforderlich und STAT3 nicht ausreichend für Isoproterenol induziert. Figur 3 STAT3 Element in MMP-7-Promotor ist nicht erforderlich und STAT3 nicht ausreichend für Isoproterenol-induzierte MMP-7 die Expression. Eine schematische Darstellung des Plasmids PMMP-7MS drei mutiertes STAT3 Stellen an den Positionen -255 bis -245, -168 bis -159 und -137 bis -122 enthält. B, MGC-803-Zellen wurden kotransfiziert mit PMMP-7MS und pRL-TK, ausgehungert und dann mit 10 &mgr; M Isoproterenol stimulierte für 0, 1, 2, 3, 6 oder 9 h, respectively. MMP-7-Promotor-Aktivitäten wurden durch die Luciferase-Assays beurteilt. C, HGC-27 und MGC-803-Zellen wurden stabil mit pGeneSuppressor exprimierenden STAT3 shRNA. Die Expression von STAT3 wurde durch Western-Blot in HGC-27 analysiert /STAT3-sh und MGC-803 /STAT3-SH-Zellen. D, MMP-7-Promotor-Aktivitäten wurden für 0 in MGC-803 /STAT3-SH-Zellen nach Stimulation mit 10 uM Isoproterenol untersucht, 1, 2, 3, 6 oder 9 h, respectively. E bis G, HGC-27 /STAT3-SH und MGC-803 /STAT3-SH-Zellen wurden mit 2 uM oder 10 uM Isoproterenol stimulierte, respectively. Die Expression von MMP-7 wurde durch RT-PCR (E) analysiert werden, Echtzeit-PCR (F) und Western Blot (G).
AP-1 spielt eine kritische Rolle bei der Isoproterenol-induzierte MMP-7 die Expression
Die obigen Daten war unerwartet, da STAT3 durch Isoproterenol Stimulation aktiviert werden konnte. Außerdem in unserer früheren Studie [42, 43] haben wir gezeigt, dass STAT3 und AP-1 bei der Regulierung der Her2 beteiligt Signalisierungs vermittelten MMP-7 die Expression in Brustkrebszellen. Wir versuchten dann zu untersuchen, ob AP-1 Einflüsse MMP-7 Expression Isoproterenol induziert. MGC-803-Zellen wurden mit dem Plasmid transfiziert PMMP-7 mA ein mutiertes AP-1-Stelle an der Position -67 bis -61 in MMP-7-Promotor und die Luciferase-Aktivitäten gemessen enthält (Fig. 4A). Überraschenderweise wurden Isoproterenol-induzierte MMP-7 Promotoraktivitäten vollständig zu allen Zeitpunkten verschwunden (Fig. 4B), was darauf hindeutet, dass die AP-1-Stelle entscheidend war in Isoproterenol-induzierte MMP-7 die Expression. Figur 4 AP-1 spielt eine kritische Rolle bei der Isoproterenol-induzierte MMP-7 die Expression. Eine schematische Darstellung des Plasmids PMMP-7 mA ein mutiertes AP-1-Stelle an der Position -67 bis -61 enthält. B, MGC-803-Zellen wurden kotransfiziert mit PMMP-7 mA und pRL-TK, ausgehungert und dann mit 10 &mgr; M Isoproterenol stimulierte für 0, 1, 2, 3, 6 oder 9 h, respectively. MMP-7-Promotor-Aktivitäten wurden durch die Luciferase-Assays beurteilt. C, MGC-803-Zellen co-transfiziert mit TAM67, PMMP-7 und pRL-TK wurden mit 10 &mgr; M Isoproterenol induziert. MMP-7-Promotor-Aktivitäten wurden durch die Luciferase-Assays analysiert. D, MGC-803-Zellen shRNA Targeting c-Jun stabil exprimieren (MGC-803 /c-Jun-sh) gegründet und c-Jun-Expression wurde durch Western-Blot analysiert. E, MMP-7-Promotor-Aktivitäten wurden für 0 in MGC-803 /c-Jun-SH-Zellen nach Stimulation mit 10 uM Isoproterenol untersucht, 1, 2, 3, 6 oder 9 h, respectively. F, MMP-7-Expression wurde in MGC-803 /c-Jun-SH-Zellen nach Stimulation mit 0, 2 oder 10 &mgr; M Isoproterenol, jeweils analysiert. G, die Plasmide, c-Jun und STAT3C exprimieren, wurden transfizierte in MGC-803 /c-Jun-SH-Zellen. MMP-7-Promotor-Aktivitäten durch das Luciferase-Assays wurden analysiert.
Um Isoproterenol-induzierte MMP-7 Expression bestätigen wird von AP-1 gesteuert, die wir untersucht dann, ob die Transaktivierung von MMP-7-Promotor induziert durch Isoproterenol durch eine dominante gehemmt werden könnte, negativ c-Jun-Mutante TAM67, das die c-Jun-5'-trans~~POS=TRUNC fehlt, besitzt aber eine funktionelle c-Jun Leucin-zipper und DNA-Bindungsdomäne. Nach transienter Transfektion mit TAM67 in MGC-803-Zellen, Isoproterenol-induzierte Transaktivierung von MMP-7-Promotor wurde von Luciferase-Assays analysiert. Wie in gezeigt. 4C, die Expression des dominanten negativen c-Jun eine auffällige dämpfenden Effekt auf die MMP-7-Promotor-Aktivitäten zeigten. Um die kritische Rolle von AP-1 zu überprüfen, haben wir getestet, ob Blockieren endogen exprimierten c-Jun, die Expression von MMP-7 hemmen können. Die MGC-803 /c-Jun-SH-Zellen wurden etabliert (Abb. 4D) und MMP-7-Promotor durch Luciferasetests analysiert Aktivitäten. Die Daten in Fig. 4E gezeigt, dass die Aktivitäten von MMP-7-Promotor durch Knock-down von c-Jun-Expression auffallend reduziert. Western-Blot-Analyse zeigte auch, dass isoprotereol induzierte MMP-7 die Expression deutlich wurde in MGC-803 /c-Jun-SH-Zellen verringert, während eine im wesentlichen große Menge von MMP-7-Protein wurde in den parentalen Zellen nach Isoproterenol Stimulation (Fig detektiert. 4F). Bemerkenswerterweise wurde die Überexpression von exogenen c-Jun dramatisch MMP-7-Promotor-Aktivitäten in MGC-803 /c-Jun-SH-Zellen wieder hergestellt, aber konstitutiv aktivierte STAT3 Mutante STAT3C nur minimal aktivierte MMP-7-Promotor, wenn c-Jun-Expression zum Schweigen gebracht (Abb . 4G). Diese Daten beweisen, dass AP-1 Isoproterenol-induzierte MMP-7 Expression dominiert.
C-Jun und STAT3 synergistisch regulieren MMP-7-Expression als Antwort auf Isoproterenol Stimulation
Kooperation von Stat3 und c-Jun in der Regulation einer Vielzahl von Gentranskription wurde berichtet. Unsere früheren Studie zeigt, dass die Aktivierung von MMP-9-Promotor auf der Wechselwirkung von Stat3 und AP-1 [44] abhängig ist. Wie oben erwähnt, induziert Isoproterenol Stimulation der Aktivierung von STAT3 und AP-1 gleichzeitig. Wir spekulierten, dass Stat3 und AP-1 synergistisch bei der Regulation der Isoproterenol-stimulierten MMP-7 die Expression teilnehmen. Es wurde angedeutet, dass AP-1 mit STAT3 kooperiert 6-induzierte Transaktivierung des IL-6-Reaktionselement in interleukin in Abwesenheit von direkter AP-1-DNA-Bindung [45]. Es hat uns veranlasst, die mögliche kooperative Bindung von AP-1 /STAT3 an die AP-1-Stelle zu testen.
Um festzustellen, ob das STAT3 und AP-1 kann auf die AP-1-Stelle in MMP-7-Promotor in vivo rekrutiert werden wurden MGC-803-Zellen für 0, 2,5 oder 4 h mit 10 &mgr; M Isoproterenol stimulierte, respectively. Das Chromatin DNA /Kernprotein-Komplexe wurden hergestellt, und die Bindung von STAT3 und c-Jun an die AP-1-Stelle wurde von ChIP-Assays analysiert. Das PCR-Produkt für die Amplifikation ausgewählt erstreckt sich von der -76 bis +165 Region, um die AP-1-Stelle in MMP-7-Promotor beherbergen. Die Immunpräzipitation mit Anti-STAT3 und anti-c-Jun-Antikörpern durch PCR, gefolgt ergab eine erwartete 241 bp-Bande aus den Fällungs nach Isoproterenol Stimulation für 2,5 h. Die Intensitäten dieser Banden wurden nach 4 h geschwächt. Im Gegensatz dazu keine Bindung in nicht-stimulierten Kontrollzellen von STAT3 zu dieser Stelle wurde beobachtet, und die Bindung von c-Jun kaum nachweisbar. Keine Bande wurde durch Immunpräzipitation unter Verwendung von Kaninchen IgG amplifiziert (Fig. 5A). Die Daten wurden durch Echtzeit-PCR (Fig. 5B) bestätigt. Diese Daten zeigten, dass die Assoziation von STAT3 und c-Jun mit MMP-7-Promotor in vivo
spezifisch war und dass Isoproterenol Stimulation induziert die Bindung von STAT3 /c-Jun an die AP-1-Element. Abbildung 5 c-Jun und STAT3 synergistisch MMP-7 Expression regulieren. A und B wurden MGC-803-Zellen für 0, 2,5 oder 4 h mit 10 &mgr; M Isoproterenol stimulierte, respectively. Das Chromatin DNA /Kernprotein-Komplexe wurden hergestellt. Bindung von STAT3 und c-Jun an die AP-1-Stelle wurde durch Immunpräzipitation mit Anti-STAT3-und Anti-AP-1-Antikörper, gefolgt von PCR (A) und Echtzeit-PCR (B) analysiert. C, MGC-803-Zellen wurden mit 10 uM Isoproterenol behandelt für 0 oder 2,5 h, respectively. Der Kernextrakt wurde mit einem Nuclear-Cytosol-Extraktions-Kits bereit. β-Tubulin und AP-2α wurden durch Western-Blot analysiert, um die Trennung von cytoplasmatischen und Kernproteine ​​zu untersuchen. C, Cytosolproteine; N, Kernproteine. D, 200 &mgr; g der Kernextrakten wurde 4 h mit dem biotinylierten Oligonukleotiden enthaltend AP-1-Konsensussequenz zuvor bei 4 ° C inkubiert gekoppelt Dynabeads M-280 in Gegenwart oder Abwesenheit von einem, fünf oder 15 fachen Menge des Doppel -litzen Oligonukleotid-Konkurrenten. Inkubation der Kernproteine ​​mit den doppelsträngigen Oligonukleotiden ein mutiertes AP-1-Stelle (Mut Oligo) oder nicht-spezifische doppelsträngige Oligonukleotide (NS Oligo) enthielt, wurde als Kontrolle verwendet. Die Protein /DNA-Komplexe wurden mit einem Dynal Magneten getrennt und einer SDS-PAGE. STAT3 und c-Jun wurden durch Western-Blot mit Anti-STAT3 und anti-c-Jun-Antikörper nachgewiesen werden. E und F, MGC-803-Zellen mit den Plasmiden PMMP-7mA und pCDNA3.1 /c-Jun oder STAT3C und Luciferase-Aktivitäten wurden getestet cotransfiziert wurden.
Weiter Um die Interaktion von STAT3 /c-Jun mit der Charakterisierung AP-1-Stelle, führten wir eine DNA Affinitätspräzipitation Assay. Nach MGC-803 Zellen mit Isoproterenol für 2,5 h behandelt wurden, wurde der Kernextrakt wurde hergestellt und seine Qualität beurteilt (Fig. 5C). Die biotinylierten Oligonukleotide -74 bis -52 Region von MMP-7-Promotor entsprechen, wurden mit 200 &mgr; g der Kernextrakten für die Pull-down-Assays inkubiert. Die mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen wurden verwendet, biotinmarkierten doppelsträngigen Oligonukleotiden und der zugehörigen DNA-Bindungsproteine ​​auszufällen. Die Bindung der Kernproteinen an die biotinylierten Oligonukleotiden in Gegenwart von einem, fünf oder 15 fachen Menge an doppelsträngigen Oligonukleotids Konkurrenten enthält, AP-1 Konsensus-Sequenzen analysiert. Inkubation der Kernproteine ​​mit den doppelsträngigen Oligonukleotiden ein mutiertes AP-1-Stelle oder nicht-spezifische doppelsträngige Oligonucleotide enthielt, wurde als Kontrolle verwendet. Die resultierenden DNA-Protein-Komplexe wurden durch SDS-PAGE, Western-Blot mit anti-c-Jun und Anti-STAT3-Antikörper gefolgt gelöst. Die Vereinigung der beiden Transkriptionsfaktoren, die mit den Oligonukleotiden AP-1 Konsensus-Sequenzen enthalten, sind deutlich in den Kernextrakten von Isoproterenol-stimulierten Zellen detektiert werden, nicht aber von nicht-stimulierten Zellen. Der Wettbewerb mit fünfzehn fachen Menge der Wettbewerber abgeschafft völlig die Bildung der biotinylierten DNA /Protein-Komplexe (Fig. 5D). Keine Bindung von c-Jun und STAT3 entweder die Oligonukleotide ein mutiertes AP-1-Stelle oder unspezifische Oligonukleotide enthielt, wurde nachgewiesen (Fig. 5D). Dieses Experiment in-vitro-Nachweis liefert, dass STAT3 und c-Jun, unter Katecholamin-Stimulation, um zu bestätigen, kann physikalisch interagieren und an die AP-1-Stelle binden Transaktivierung von MMP-7-Gens in Magenkrebszellen zu erreichen.
Wir zeigten, dass Isoproterenol -induzierte MMP-7 Promotoraktivierung wurde nicht durch die Mutagenese der Kern-Sequenzen aller drei STAT3 Seiten gestört, was darauf hindeutet, dass die STAT3 Elemente wirken nicht in Isoproterenol-induzierte MMP-7 Gentranskription in Magenkrebszellen. Um weiter die Rolle von AP-1-Element überprüfen, wurde das Plasmid PMMP-7 mA war, co-transfiziert in MGC-803-Zellen entweder mit pCDNA3.1 /c-Jun oder STAT3C, respectively. Interessanterweise blockiert die Mutation von AP-1-Bindungsstelle gründlich die Aktivierung von MMP-7-Promotor in den transfizierten Zellen überexprimieren, entweder c-Jun oder STAT3C (Fig. 5E und 5F), was darauf hinweist, dass die AP-1-Stelle ein wichtiges regulatorisches Element ist und die synergistische Regulation der Isoproterenol-induzierte MMP-7 die Expression von STAT3 und AP-1 stützt sich auf dieses Element.
β2-AR und MMP-7 wurden in Magenkrebsgewebe kolokalisiert
die Überexpression von MMP-7 war häufig an der invasiven Front des menschlichen Magenkrebs und direkt mit der Prognose bei Patienten mit Magenkrebs assoziiert. Um die Korrelation von β2-AR-Ebene mit MMP-7 Expression in menschlichen Magenkrebs untersuchen, haben wir für fünf Magenkrebs Gewebeproben und analysiert, um die Expression von β2-AR und MMP-7 von immunhistochemischen Markierung. Interessanterweise tauchte die starke Expression von β2-AR und MMP-7 in der gleichen Region von Tumorgewebe (Abb. 6A), eine intime Beziehung zwischen MMP-7 und β2-AR hindeutet. Um die Rolle von MMP-7 und β2-AR bei der Metastasierung von Magenkrebs zu untersuchen, analysierten wir die Expression von MMP-7 und β-ARs in den Krebs, peri-kanzerösen und metastatischen Gewebe von einem Patienten mit Magenkrebs. Wie in gezeigt. 6B ist die Expression von β1-AR, β2-AR und MMP-7 auf Proteinebene wurde in Krebsgewebe höher als in peri-Krebsgewebe. Jedoch wurde die höchste Expression von ihnen in dem metastatischen Gewebe. Außerdem MMP-7 mRNA wurde auch in den metastatischen Geweben (Fig. 6C) überexprimiert. Diese Daten stark eine enge Verbindung zwischen MMP-7 bedeuten, β2-AR und die Metastasierung von Magenkrebs. Abbildung 6 β2-AR und MMP-7 wurden in Magenkrebsgewebe überexprimiert. A, fünf Magenkrebsgewebeproben wurden gesammelt. Die Expression von β2-AR und MMP-7 wurde durch Immunhistochemie analysiert. B, die Expression von MMP-7, β1-AR und β2-AR in den Krebs, peri-kanzerösen und metastatischen Gewebe wurde durch Western-Blot analysiert. C, das Niveau der MMP-7 mRNA in den Krebs, peri-kanzerösen und metastatischen Geweben durch real-time PCR analysiert.
Diskussion
Die vorliegende Studie wurde die Hypothese zugrunde, dass psychosoziale Stress ein Risikofaktor sein kann, bei Magenkrebs. Stress, Angst und Depression können komplexe physiologische und neuroendokrine Veränderungen verursachen, die mehrere Systeme beeinflussen, einschließlich des Verdauungssystems. Die Krebspatienten erleben oft erhebliche seelische Belastung. Der Verband der physiologischen Stress mit Erhöhung der Sekretion von Magensäure und Magenschmerzen ist seit langem bemerkt worden [46, 47]. Es wurde berichtet, dass chronischer Stress Magengeschwüre verschlimmern kann. In einer kürzlich Bevölkerungsumfrage 2014 Probanden eingeschrieben wurde Stress als das stärkste Risikofaktor für Magenkrebs angesehen [48]. Die Erkenntnisse aus experimentellen Studien deuten darauf hin, dass eine erhöhte Aktivität des sympathischen Nervensystems eine primäre Mechanismus, mit dem darstellen Ausdruck physiologische Faktoren Auswirkungen Gen in Tumoren [49]. Bis heute sind die meisten Studien, die die Mechanismen verbinden Stress und Progression von Krebs untersucht wurde indirekten Auswirkungen durch die Immunsuppression [8]. In mehreren aktuellen Studien, Stress verwandte Proteine ​​und Wege wurden direkt an die Verhaltensänderung von malignen Zellen [10-17] verknüpft. Jedoch ein Mangel an Daten besteht, die molekularen Mechanismen beteiligt Abgrenzen. In der vorliegenden Studie
identifizierten wir MMP-7-Expression in den Magenkrebszelllinien in Reaktion auf die Stimulation von stressbedingten Hormon Katecholamin erhöht. Es wird geschätzt, dass die Konzentration der Catecholamine über 100 mal höher in der Tumor-Mikroumgebung als in normalen Geweben und zirkulierende Plasma sein könnte. MMP-7 ist einzigartig in seiner beschränkten Expression in Tumorzellen, die anzeigt, dass MMP-7 die Expression in einer Tumorassoziierten Mode ist. Wir haben festgestellt, dass die Isoproterenol Stimulation signifikant hochreguliert MMP-7 Expression sowohl auf mRNA und Protein-Ebene in Magenkrebszellen. β2-AR antigonist effektiv Isoproterenol-induzierte MMP-7 Expression Hochregulation außer Kraft gesetzt, dass β2-AR-vermittelten Weg darauf hindeutet, in den Prozess involviert ist. MMP-7 Expression
fest auf der Ebene der Transkription kontrolliert wird. Unsere früheren Studie zeigte, dass Heregulin-β-induzierte MMP-7 Expression von HER2-vermittelte STAT3 und AP-1-Aktivierung in menschlichen Brustkrebszelllinien [42, 43] geregelt wurde. Wir identifizierten auch die funktionellen AP-1 und STAT3-Bindungsstellen in den ersten 350 bp von der Transkriptionsstartstelle in der menschlichen MMP-7-Promotor [42, 43]. Eine andere Studie zeigte, dass FGF-2 kann direkt MMP-7-Genexpression in menschlichen Tumorzelllinien und Endothelzellen der Nabelvene durch AP-1 und STAT3 [50] hochzuregulieren. Thesaurierend Beweise unterstützt nachdrücklich, dass STAT3 als zentrale Regulierungsknoten dient, auf denen mehrere onkogene Signalwege zusammenlaufen [51]. Aberrante Aktivierung von STAT3 wurde eine kritische Rolle bei Magenkrebs Entwicklung spielen erwiesen [52, 53]. Eine aktuelle Studie und unsere Daten aufgedeckt die Assoziation von catacholamine mit STAT3-Aktivierung in Eierstock- und Brustkrebs-Zellen [12, 13]. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass Isoproterenol Stimulation prominent die Aktivierung von STAT3 in Magenkrebszellen induziert, dass Katecholamine Verwicklung kann die maligne Progression von Magenkrebs zu beschleunigen. Unsere nicht veröffentlichte Daten auch bewiesen, dass die Expression von Isoproterenol MMP-2 und MMP-9 in Magenkrebszellen, hauptsächlich durch die Aktivierung STAT3 stimuliert. Jedoch in dieser Studie fanden wir, dass AP-1 eine höhere Wirksamkeit als STAT3 in Isoproterenol-induzierte MMP-7 Gentranskription und die STAT3 Elemente waren nicht funktionalen angezeigt, wie Silencing-STAT3-Expression war nicht wirksam Isoproterenol-induzierte MMP bei der Verhütung 7 Expression und Mutagenese von drei STAT3-Bindungsstellen konnte die Transaktivierung von MMP-7-Promotor als Antwort auf Isoproterenol Induktion zu unterdrücken. Im Gegensatz dazu bestimmt die AP-1-Stelle und c-Jun diesen Prozess. Interessanterweise wurden STAT3 und c-Jun fanden gleichzeitig an den einzelnen AP-1-Stelle in MMP-7-Promotor zu binden, Verwicklung, dass das Zusammenspiel der beiden Transkriptionsfaktoren an eine Bindungsstelle für Isoproterenol-stimulierte MMP-7-Expression in Magenkrebs verantwortlich ist Zellen. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

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