Catecolaminas hasta regula MMP-7 expresión mediante la activación de AP-1 y STAT3 en el cáncer gástrico

Catecolaminas hasta regula la expresión de MMP-7 mediante la activación de AP-1 y STAT3 en el cáncer gástrico
Estrés
Antecedentes
, la ansiedad y la depresión pueden causar cambios fisiológicos neuroendocrinos y complejas, lo que resulta en un aumento de nivel de la hormona relacionada con el estrés catecolaminas, lo que puede constituir un mecanismo principal por el cual la expresión génica factores fisiológicos impacto en los tumores. En el presente estudio, se investigó los efectos de la estimulación de catecolaminas en MMP-7 expresión en células de cáncer gástrico y se aclararán los mecanismos moleculares de la regulación de nivel de MMP-7 por las catecolaminas a través de una vía de señalización adrenérgica.
Resultados
aumento de la expresión de MMP-7 se identificó tanto en los niveles de proteína mRNA y en las células de cáncer gástrico en respuesta a la estimulación isoproterenol. antigonist β2-AR abrogada efectivamente la expresión de MMP-7 inducida por el isoproterenol. La activación de STAT3 y AP-1 fue inducida por la estimulación prominente isoproterenol y AP-1 muestra una mayor eficacia que la STAT3 en MMP-7 expresión inducida por el isoproterenol. La mutagénesis de tres sitios de unión de STAT3 en MMP-7 promotor no pudo reprimir la transactivación de MMP-7 promotor y silenciamiento de la expresión STAT3 no era eficaz en la prevención de la expresión de MMP-7 inducida por el isoproterenol. Sin embargo, inducida por isoproterenol MMP-7 actividades promotoras se desapareció por completo cuando el sitio AP-1 fue mutado. STAT3 y c-Jun podrían interactuar físicamente y unirse al sitio de AP-1, lo que implica que la interacción de ambos factores de transcripción en el sitio AP-1 es responsable de MMP-7 expresión isoproterenol estimulada en células de cáncer gástrico. La expresión de MMP-7 en tejidos de cáncer gástrico se encontró que en el sitio donde se sobreexpresa β2-AR y los niveles de MMP-7 y β2-AR fueron las más altas en el locus metastásica del cáncer gástrico.
Conclusiones
Sobre regulación de MMP-7 expresión a través de la vía de señalización mediada por β2-AR está involucrada en la invasión y metástasis de cáncer gástrico.
Antecedentes
el cáncer gástrico es la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer, con alrededor de 700 000 muertes cada año [1, 2]. Uno de los factores importantes en la patogénesis del cáncer gástrico es la infección crónica por Helicobacter pylori
[3]. Sin embargo, la mayoría de los individuos infectados no desarrollan tumor maligno y el resultado de la infección depende de anfitrión, del medio ambiente y otros factores [4]. Existe una creciente evidencia que apoya el papel del estrés psicológico en la aparición del cáncer gástrico y el desarrollo [5]. Varios estudios epidemiológicos han demostrado que los factores de estrés psicológicos o de comportamiento pueden acelerar la progresión de cáncer gástrico [6, 7]. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual el estrés psicológico actúa en la progresión del cáncer gástrico no es claro.
Estrés inicia una respuesta del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), lo que resulta en un aumento de la concentración de catecolaminas [8, 9]. Varios estudios han demostrado que la estimulación de catecolaminas interfiere con bio-comportamientos de las células tumorales directamente, principalmente a través de receptores ß2-adrenérgicos (β2-AR) mediada por la vía de señalización [10-14]. Observaciones recientes apuntan a un mecanismo potencial para la progresión de cáncer de ovario, cánceres nasofaríngeos y pancreáticas indican que las catecolaminas puede modular la expresión de la metaloproteinasa de matriz (MMP) -2 y MMP-9 por estroma y células tumorales [15-17]. Se plantea una cuestión interesante que el estrés psicológico puede jugar un papel en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico mediante la modulación de la expresión de MMPs a través de β2-AR vía de señalización mediada.
Líneas acumuladas de pruebas muestran que MMP-7 está implicada en la invasión y metástasis de cáncer gástrico [18-24]. MMP-7 es el miembro más pequeño conocido de la familia MMP y posee la matriz extracelular más alta (ECM) la actividad -degradative contra una variedad de componentes de ECM, incluyendo la elastina, gelatina, colágeno tipo IV, fibronectina, vitronectina, laminina, entactina, aggrecan y proteoglicanos , entre las MMPs [25, 26]. También es capaz de desencadenar la activación de una cascada de MMP [27]. Una característica única de MMP-7 es su expresión restringida principalmente en las células epiteliales del tejido glandular mamario normal, incluyendo, hígado, páncreas, próstata y glándulas peribronquiales [28].
Se ha encontrado que la MMP-7 se sobreexpresa en la invasivo cánceres de los órganos digestivos, como el esófago [29], gástrico [30], de páncreas [31, 32], colorrectal [33-35], el hígado [36] y otros órganos. El nivel de expresión de MMP-7 se asocia significativamente con la transformación de células tumorales, fenotipos de cánceres agresivos y etapa de progresión tumoral [37], especialmente en los tumores del tracto gastrointestinal. La sobreexpresión de MMP-7 se identifica con frecuencia en las lesiones gástricas premalignas y carcinomas gástricos [más 18-21, 24, 38]. Una correlación positiva de nivel de MMP-7 con la invasión tumoral de la pared gástrica, metástasis de ganglios linfáticos, diseminación peritoneal y la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico se ha documentado en varios estudios [23]. MMP-7 ha sido reconocido como un importante mediador de la progresión del cáncer y se considera como un marcador de pronóstico independiente para el cáncer gástrico primario. Sin embargo, los posibles mecanismos moleculares de la MMP-7 sobreexpresión en cáncer gástrico son todavía en gran parte sin explorar.
En el presente estudio, se investigó los efectos de la estimulación de catecolaminas en MMP-7 expresión en líneas celulares de cáncer gástrico y se aclararán los mecanismos moleculares de la sobre regulación de nivel de MMP-7 por las catecolaminas a través de una vía de señalización adrenérgica.
resultados
estimulación isoproterenol hasta regula la expresión de MMP-7
se demostró que la expresión de MMP-9 en los ovarios cáncer fue significativamente mayor en los macrófagos asociados a tumores en los pacientes con síntomas depresivos elevados [15] y catecolaminas potenció la expresión inducida por LPS de MMPs en monocitos humanos [39]. Con el fin de investigar si los asociados de catecolaminas con la expresión de MMP-7 en células de cáncer gástrico, que primero inspeccionados los efectos de la β-AR isoproterenol agonista sobre la transcripción del gen de la MMP-7 en las líneas celulares de cáncer gástrico HGC-27 y MGC-803 . Se seleccionaron las dosis de catecolamina utilizado en este estudio para reflejar las condiciones fisiológicas de esta hormona en tumores [40, 41]. Los análisis de PCR semi-cuantitativa y en tiempo real mostró que la MMP-7 de expresión a nivel transcripcional fue baja en líneas celulares de cáncer gástrico. Cuando las células se expusieron a 10 M de isoproterenol en el medio libre de suero durante 12 h, MMP-7 niveles de mRNA se incrementaron notablemente en ambas líneas celulares (Fig. 1A y 1B). Para determinar si el aumento del nivel de MMP-7 mRNA conduce a un incremento similar en la producción de proteínas, MMP-7 expresión en HGC-27 y MGC-803 células se analizó por transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 1C, la estimulación isoproterenol dio lugar a una significativa regulación de MMP-7 expresión en HGC-27 y MGC-803 células. β2-AR, que media la mayor parte de los efectos de las catecolaminas, ha sido identificado en células de mama y cáncer de ovario [11, 13]. Para aclarar el papel de la señalización mediada por β2-AR en MMP-7 de expresión, que utilizó un antagonista propranolol β-AR y el antagonista selectivo β2-AR ICI-118.551 de probar si el efecto de isoproterenol sobre la MMP-7 de expresión puede ser inhibida. Nuestros datos muestran que el tratamiento con propranolol e ICI-118.551 eficiente bloqueado MMP-7 isoproterenol expresión estimulada (Fig. 1D, panel superior). A continuación, examinó si β2-AR se expresa en células de cáncer gástrico. Los datos mostraron que la expresión de β2-AR fue detectable en tres líneas celulares de cáncer gástrico incluyendo HGC-27, MGC-803 y MKN-45 (Fig. 1D, panel inferior). Estos datos indicaron que isoproterenol estimuló la producción de MMP-7 en las líneas celulares de cáncer gástrico y que la regulación de MMP-7 expresión por isoproterenol fue provocada principalmente por la señalización mediada β2-AR. Figura 1 estimulación isoproterenol hasta regula la expresión de MMP-7. A y B, HGC-27 y MGC-803 células se incubaron durante la noche en medio libre de suero y después se trataron con 2 o 10 mM isoproterenol, respectivamente. La expresión de MMP-7 mRNA se analizó por RT-PCR (A) y PCR en tiempo real (B). C, HGC-27 Las células se estimularon con células isoproterenol 0, 1 o 2 M y MGC-803 con 0, 5 y 10 mM isoproterenol después de la privación de suero. La expresión de la proteína MMP-7 se analizó por transferencia Western. D, las células MGC-803 fueron tratados con 10 mM propranolol o 1 M ICI-118551 de 1 h y luego con 10 M de isoproterenol. MMP-7 expresión se analizó mediante Western blot (panel superior); la expresión de β2-AR en el MGC-803, MKN-45 y células HGC-27 se detectó por Western blot (panel inferior).
isoproterenol hasta regula la MMP-7 la actividad promotora y activa STAT3 y AP-1
Para explorar los mecanismos moleculares por los cuales las catecolaminas hasta regula la expresión de MMP-7, se determinó en primer lugar si la estimulación isoproterenol puede afectar directamente a la MMP-7 promotor de la actividad. Hemos construido un plásmido Pmmp-7 que contiene un gen indicador de luciferasa conducido por un 340 pb MMP-7 fragmento de promotor (-296 a 44) (Fig 2A.). MGC-803 células fueron transfectadas con Pmmp-7 y el efecto de isoproterenol en MMP-7 promotor de la actividad se evaluó mediante ensayos de luciferasa. Como se muestra en la Fig. 2B, después de la estimulación isoproterenol durante 1 h, las actividades de luciferasa comenzó a subir y mejorado de forma gradual. A las 6 h después de la exposición, la MMP-7 promotor de las actividades mostraron un incremento de dos veces más en comparación con las células control no estimulados, lo que sugiere que la estimulación isoproterenol podría inducir directamente la transactivación de MMP-7 promotor. Figura 2 isoproterenol hasta regula la MMP-7 la actividad promotora y activa STAT3 y AP-1. A, representación esquemática del plásmido Pmmp-7 que contiene un gen indicador de luciferasa conducido por un 340 pb MMP-7 fragmento del promotor. SBE, STAT3 sitio; ABE, AP-1 sitio. B, células MGC-803 fueron co-transfectadas con Pmmp-7 y PRL-TK. Después de la transfección durante 48 h, las células se incubaron en medio libre de suero durante 24 h más y después se estimularon con 10 M de isoproterenol para 0, 1, 2, 3, 6 o 9 h, respectivamente. MMP-7 actividades promotoras se evaluaron mediante ensayos de luciferasa. C y D, las células MGC-803 fueron tratados con 10 mM propranolol durante 1 h y luego con 10 mM isoproterenol para 0, 15, 30, 60, 120 o 180 min, respectivamente. La fosforilación de STAT3 y c-Jun se analizó por transferencia Western con anti-fósforo-STAT3 y policlonales contra fósforo-c-Jun-conejo. ISO, isoproterenol.
En nuestro estudio anterior [42, 43], hemos identificado un sitio de unión de AP-1 en la posición -67 a -61 y tres sitios de unión de STAT3 en las posiciones -137 a -122, -168 a -159 y -255 a -245 en el promotor de MMP-7 (Fig. 2A). Se demostró además que AP-1 y STAT3 obligados a AP-1 y uno de los STAT3 (-137 a -122) sitios, regulando positivamente MMP-7 transcripción. Un estudio reciente mostró que las catecolaminas tiene el potencial de activar STAT3. Para investigar si la catecolamina estimula MMP-7 transcripción a través de la activación de STAT3 y AP-1, se analizó la fosforilación de STAT3 y c-jun. Higo. 2C mostró que isoproterenol causó la fosforilación de STAT3 después de 30 min de estimulación, alcanzando un pico a las 2 h. Aunque la activación de c-Jun fue lento, iniciado en 60 min, una fosforilación máxima se alcanzó a las 2 h, así (Fig. 2D). Se significó que la estimulación isoproterenol produce una señal mediada por β2-AR que provocó la activación de STAT3 y AP-1. Elemento
STAT3 en MMP-7 promotor no se requiere y STAT3 no suficiente para la MMP-7 expresión inducida por el isoproterenol
con el fin de determinar si los elementos STAT3 son funcionales en isoproterenol inducida por MMP-7 la transcripción de genes, se realizó primero la mutagénesis de los tres sitios STAT3 a través de la mutación de las principales secuencias de sitios de STAT3 en base a Pmmp-7 (Fig. 3A) y construyó el plásmido Pmmp-7 ms. El plásmido se transfectó en células MGC-803. Después de la transfección durante 48 h, las células se incubaron en medio libre de suero durante la noche y después se estimularon con 10 M de isoproterenol durante 6 h. Hemos notado, sorprendentemente, que la mutación de los tres sitios de unión de STAT3 no tuvo ningún efecto importante sobre la transactivación de MMP-7 promotor. Como se muestra en la Fig. 3B, actividades de luciferasa se incrementaron gradualmente y se acercaron a un pico a las 6 horas después de la exposición. El resultado fue muy similar a la observada en las células transfectadas con el tipo salvaje MMP-7 promotor. Para identificar el papel de STAT3 en este caso, HGC-27 y MGC-803 células fueron transfectadas con pGeneSuppressor expresar shRNA orientación STAT3 y HGC-27 /sh-STAT3 y MGC-803 /STAT3 células SH-establecidos. Higo. 3C mostró que la expresión de STAT3 se suprimió de manera eficiente tanto en las células. En consonancia con los datos anteriores, isoproterenol inducida por MMP-7 actividades promotoras parecían no verse afectada de manera significativa en MGC-803 /STAT3 células SH-(Fig. 3D). Además, isoproterenol inducida por MMP-7 expresión, tanto en los niveles de proteína mRNA y no fue afectada por la importante expresión STAT3 silenciar como se demostró por RT-PCR, PCR en tiempo real y Western blot (Fig. 3E, F y 3G). Los resultados sugieren que el elemento de STAT3 en MMP-7 promotor no es necesaria y STAT3 no suficiente para la MMP-7 expresión inducida por el isoproterenol. Figura 3 elemento de STAT3 en MMP-7 promotor no es necesaria y STAT3 no suficiente para la MMP-7 expresión inducida por el isoproterenol. A, representación esquemática del plásmido Pmmp-7 ms que contiene tres sitios mutados STAT3 en las posiciones -255 a -245, -168 a -159 y -137 a -122. B, las células MGC-803 fueron co-transfectadas con Pmmp-7 ms y pRL-TK, hambre, y después se estimularon con 10 M de isoproterenol para 0, 1, 2, 3, 6 o 9 h, respectivamente. MMP-7 actividades promotoras se evaluaron mediante ensayos de luciferasa. Las células C, HGC-27 y MGC-803 fueron transfectadas establemente con pGeneSuppressor expresar shRNA STAT3. La expresión de STAT3 se analizó por Western blot en HGC-27 células /sh-STAT3 MGC-803 /STAT3-sh y. D, MMP-7 actividades promotoras se ensayaron en células /sh-STAT3 MGC-803 después de la estimulación con 10 M de isoproterenol para 0, 1, 2, 3, 6 o 9 h, respectivamente. E a G, HGC-27 /células /STAT3-SH-803 MGC STAT3-sh y se estimularon con 2 M o 10 M de isoproterenol, respectivamente. La expresión de MMP-7 se analizó por RT-PCR (E), PCR en tiempo real (F) y Western blot (G).
AP-1 juega un papel crítico en la MMP-7 expresión inducida por el isoproterenol
Los datos anteriores fue inesperado, ya que STAT3 puede ser activado por la estimulación isoproterenol. Además, en nuestro estudio anterior [42, 43], hemos demostrado que STAT3 y AP-1 participaron en la regulación de la señalización mediada-Her2 la expresión de MMP-7 en células de cáncer de mama. Luego trató de investigar si la AP-1 influye isoproterenol inducida por MMP-7 expresión. células MGC-803 se transfectaron con el plásmido Pmmp-7mA que contiene una mutación de AP-1 sitio en la posición -67 a -61 en las actividades de MMP-7 promotor y luciferasa medida (Fig. 4A). Sorprendentemente, la MMP-7 actividades promotoras inducida por el isoproterenol se desaparecieron por completo en todos los puntos (Fig. 4B), lo que sugiere que el sitio AP-1 fue crucial en la expresión de MMP-7 inducida por el isoproterenol. Figura 4 AP-1 juega un papel crítico en la MMP-7 expresión inducida por el isoproterenol. A, representación esquemática del plásmido Pmmp-7mA que contiene un AP-1 sitio mutado en la posición -67 a -61. B, las células MGC-803 fueron co-transfectadas con Pmmp-7 mA y pRL-TK, hambre y después se estimularon con 10 M de isoproterenol para 0, 1, 2, 3, 6 o 9 h, respectivamente. MMP-7 actividades promotoras se evaluaron mediante ensayos de luciferasa. C, MGC-803 células co-transfectadas con TAM67, Pmmp-7 y PRL-TK se indujeron con 10 M de isoproterenol. MMP-7 actividades promotoras se analizaron mediante ensayos de luciferasa. D, MGC-803 células expresan de forma estable se establecieron shRNA orientación c-Jun (MGC-803 /c-Jun-sh) y la expresión de c-Jun se analizó por transferencia Western. E, MMP-7 actividades promotoras se ensayaron en MGC-803 células /c-Jun-SH después de la estimulación con 10 M de isoproterenol para 0, 1, 2, 3, 6 o 9 h, respectivamente. F, MMP-7 expresión se analizó en MGC-803 células /c-Jun-SH después de la estimulación con 0, 2 o 10 mM isoproterenol, respectivamente. G, los plásmidos que expresan c-Jun y STAT3C se transfectaron en células MGC-803 /c-Jun-SH, respectivamente. MMP-7 actividades promotoras se analizaron mediante ensayos de luciferasa.
Para confirmar isoproterenol inducida por MMP-7 expresión es controlada por AP-1, se examinó a continuación si la transactivación de MMP-7 promotor inducida por isoproterenol puede ser inhibida por un dominante negativo mutante de c-Jun TAM67, que carece del dominio de transactivación 5'-c-Jun, pero posee una cremallera de leucina de c-Jun funcional y dominio de unión al ADN. Después de la transfección transitoria con TAM67 en células MGC-803, la transactivación inducida por el isoproterenol de MMP-7 promotor se analizó mediante ensayos de luciferasa. Como se muestra en la Fig. 4C, la expresión de la dominante negativo c-Jun exhibió un efecto moderador visible en las actividades de MMP-7 promotoras. A fin de verificar el papel crítico de la AP-1, hemos probado si el bloqueo de forma endógena expresó c-Jun puede inhibir la expresión de MMP-7. Las células /c-Jun-sh MGC-803 se establecieron (Fig. 4D) y MMP-7 promotor de las actividades analizadas por ensayos de luciferasa. Los datos en la Fig. 4E mostraron que la actividad de MMP-7 promotor se redujeron notablemente por knock-down de la expresión de c-jun. El análisis de transferencia Western demostró también que isoprotereol inducida por MMP-7 expresión se redujo notablemente en MGC-803 células /c-Jun-SH, mientras que se detectó una sustancialmente gran cantidad de proteína MMP-7 en las células parentales después de la estimulación isoproterenol (Fig. 4F). Cabe destacar que la sobreexpresión de exógena c-Jun restaurado drásticamente MMP-7 promotor de las actividades en 803 MGC células /c-Jun-sh, pero constitutivamente activada STAT3 STAT3C mutante sólo mínimamente activa promotor de MMP-7, cuando la expresión de c-Jun fue silenciada (Fig . 4G). Estos datos demostraron que AP-1 dominaron la expresión de MMP-7 inducida por el isoproterenol.
C-jun y STAT3 sinérgicamente regulan MMP-7 expresión en respuesta a la estimulación isoproterenol
Cooperación de Stat3 y c-Jun en la regulación de una variedad de la transcripción de genes ha sido reportado. Nuestro estudio anterior demuestra que la activación de MMP-9 promotor depende de la interacción de Stat3 y AP-1 [44]. Como se mencionó anteriormente, la estimulación isoproterenol inducida por la activación de STAT3 y AP-1 al mismo tiempo. Especulamos que Stat3 y AP-1 pueden participar de forma sinérgica en la regulación de la expresión de MMP-7 isoproterenol estimulada. Se ha indicado que AP-1 coopera con STAT3 en interleucina 6 transactivación inducida por el elemento de respuesta de IL-6 en ausencia de directo AP-1 de unión a ADN [45]. Esto nos llevó a probar la posible unión cooperativa de la AP-1 /STAT3 al sitio AP-1.
A determinar si ese STAT3 y AP-1 pueden ser reclutados para el sitio AP-1 en MMP-7 promotor in vivo , células MGC-803 se estimularon con 10 M de isoproterenol de 0, 2,5 o 4 h, respectivamente. El ADN de la cromatina /complejos de proteínas nucleares se prepararon y unión de STAT3 y c-Jun en el sitio AP-1 se analizó mediante ensayos de chip. El producto de PCR para la amplificación seleccionada se extiende desde la región de -76 a 165 que alberga el sitio AP-1 en MMP-7 promotor. La inmunoprecipitación con anti-STAT3 y anti-c-Jun anticuerpos seguido de PCR produjo una banda esperado 241 pb de los precipitantes después de la estimulación isoproterenol durante 2,5 h. Las intensidades de estas bandas se debilitaron después de 4 h. Por el contrario, en las células control no estimuladas no unión de STAT3 a este sitio y se observó la unión de c-Jun apenas detectable. Ninguna banda se amplificó por inmunoprecipitación usando IgG de conejo (Fig. 5A). Los datos fueron confirmados por PCR en tiempo real (Fig. 5B). Estos datos demostraron que la asociación de STAT3 y c-Jun con MMP-7 promotor in vivo
era específico y que la estimulación inducida por isoproterenol unión de STAT3 /c-Jun al elemento de AP-1. Figura 5 c-Jun y STAT3 sinérgicamente regulan la MMP-7 expresión. A y B, las células MGC-803 se estimularon con 10 M de isoproterenol de 0, 2,5 o 4 h, respectivamente. El ADN de la cromatina /se prepararon complejos de proteínas nucleares. La unión de STAT3 y c-Jun al sitio AP-1 se analizó por la inmunoprecipitación con anti-STAT3 y anti-AP-1 anticuerpos seguido de PCR (A) y PCR en tiempo real (B). C, las células MGC-803 fueron tratados con 10 M de isoproterenol de 0 o 2,5 h, respectivamente. El extracto nuclear se preparó con un Kit de Extracción nucleares citosol. β-tubulina y AP-2α se analizaron por Western blot para examinar la separación de las proteínas citoplasmáticas y nucleares. C, proteínas citosólicas; N, proteínas nucleares. D, 200 g de los extractos nucleares se incubó a 4 ° C durante 4 h con los oligonucleótidos biotinilados que contienen AP-1 secuencia de consenso anteriormente acoplado a Dynabeads M-280 en presencia o ausencia de uno, cinco o 15 cantidad de plegado de la doble competidores de oligonucleótidos -cables. La incubación de las proteínas nucleares con los oligonucleótidos de doble cadena que contienen un mutado AP-1 sitio (Mut Oligo) o los oligonucleótidos de doble hebra no específicos (NS oligo) se utilizó como control. Los complejos proteína /ADN se separaron con un imán Dynal, y se sometieron a SDS-PAGE. STAT3 y c-Jun se detectaron por transferencia Western con anti-STAT3 y los anticuerpos anti-c-jun. E y F, MGC-803 células fueron co-transfectadas con los plásmidos Pmmp-7 mA y pCDNA3.1 /c-jun o se analizaron las actividades luciferasa y STAT3C.
Para caracterizar mejor la interacción de STAT3 /c-Jun con el AP-1 sitio, se realizó un ensayo de precipitación de afinidad de ADN. Después las células MGC-803 fueron tratados con isoproterenol durante 2,5 h, el extracto nuclear se preparó y su calidad se evaluó (Fig. 5C). Los oligonucleótidos biotinilados correspondientes a -74 a -52 región de MMP-7 promotor se incubaron con 200 g de los extractos nucleares para los ensayos pull-down. Las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina se utilizaron para precipitar oligonucleótidos de doble cadena marcados con biotina y ADN vinculante proteínas asociadas. La unión de las proteínas nucleares a los oligonucleótidos biotinilados se analizó en presencia de uno, cinco, o 15 veces la cantidad de competidores de doble cadena de oligonucleótidos que contienen AP-1 secuencias de consenso. La incubación de las proteínas nucleares con los oligonucleótidos de doble cadena que contienen una mutación de AP-1 sitio o los oligonucleótidos de doble hebra no específica se utilizaron como controles. Los complejos de ADN-proteína resultantes se resolvieron mediante SDS-PAGE, seguido de transferencia Western con anticuerpos anti-STAT3 anti-c-Jun y. La asociación de los dos factores de transcripción con los oligonucleótidos que contienen AP-1 secuencias de consenso se pudo detectar claramente en los extractos nucleares de células isoproterenol estimulada, pero no a partir de células no estimuladas. La competencia con quince cantidad de plegado de los competidores completamente abolió la formación de los complejos de ADN /proteína biotinilada (Fig. 5D). Sin unión de c-Jun y STAT3 a cualquiera de los oligonucleótidos se detectó que contienen una mutación de AP-1 sitio u oligonucleótidos no específicos (Fig. 5D). Este experimento proporciona evidencia in vitro para confirmar que STAT3 y c-Jun, bajo la estimulación de catecolaminas, puede interactuar físicamente y unirse al sitio de AP-1 para alcanzar la transactivación de MMP-7 de genes en células de cáncer gástrico.
Demostramos que isoproterenol inducida por MMP-7 activación del promotor no se vio interrumpido por la mutagénesis del núcleo de secuencias de los tres sitios de STAT3, lo que sugiere que los elementos de STAT3 no pueden actuar de isoproterenol inducida por MMP-7 transcripción de genes en células de cáncer gástrico. A fin de verificar el papel de AP-1 elemento, el plásmido Pmmp-7 mA fue co-transfectadas en MGC-803 células con pCDNA3.1 /c-Jun o STAT3C, respectivamente. Curiosamente, la mutación de AP-1 sitio de unión bloqueado completamente la activación de MMP-7 promotor en las células transfectadas que sobreexpresan ya sea c-Jun o STAT3C (Fig. 5E y 5F), que indica que el sitio de AP-1 es un elemento regulador importante y la regulación sinérgica de isoproterenol inducida por MMP-7 por la expresión de STAT3 y AP-1 se basa en este elemento.
β2-AR y MMP-7 fueron colocalized en tejidos de cáncer gástrico comentario el sobreexpresión de MMP-7 era con frecuencia en el frente invasivo del cáncer gástrico humano y directamente relacionado con el pronóstico en pacientes con cáncer gástrico. Para estudiar la correlación del nivel de β2-AR con MMP-7 de expresión en el cáncer gástrico humano, se recogieron cinco muestras de tejido de cáncer gástrico y analizamos la expresión de β2-AR y MMP-7 mediante marcaje inmunohistoquímico. Curiosamente, la fuerte expresión de β2-AR y MMP-7 surgió en la misma región de los tejidos tumorales (Fig. 6A), lo que sugiere una íntima relación entre MMP-7 y β2-AR. Para investigar más a fondo el papel de la MMP-7 y β2-AR en la metástasis de cáncer gástrico, analizamos la expresión de MMP-7 y ß-ARS en los tejidos cancerosos, peri-cancerosas y metástasis de un paciente con cáncer gástrico. Como se muestra en la Fig. 6B, la expresión de β1-AR, β2-AR y MMP-7 a nivel de proteína fue mayor en tejido canceroso que en tejido peri-cancerosas. Sin embargo, la expresión más alta de ellas se encuentra en el tejido metastásico. Además, MMP-7 mRNA también se sobreexpresa en los tejidos metastásicos (Fig. 6C). Estos datos implican fuertemente una estrecha relación entre MMP-7, β2-AR y la metástasis de cáncer gástrico. Figura 6 β2-AR y MMP-7 se sobreexpresa en tejidos de cáncer gástrico. A, se recogieron cinco muestras de tejido de cáncer gástrico. La expresión de β2-AR y MMP-7 se analizó mediante inmunohistoquímica. B, la expresión de MMP-7, β1-AR y β2-AR en los tejidos cancerosos, peri-cancerosas y metastásicas se analizó por transferencia Western. C, el nivel de MMP-7 mRNA en los tejidos cancerosos, peri-cancerosas metastásicas y se analizó por PCR en tiempo real.
Discusión Francia El presente estudio se basa en la hipótesis de que el estrés psicosocial puede ser un factor predisponente en el cáncer gástrico. El estrés, la ansiedad y la depresión pueden causar cambios fisiológicos y neuroendocrinos complejos que influyen en múltiples sistemas, incluyendo el sistema digestivo. Los pacientes de cáncer a menudo experimentan una considerable angustia emocional. La asociación de estrés fisiológico con la elevación de la secreción de ácido gástrico y dolor de estómago mucho tiempo se ha notado [46, 47]. Se ha informado de que el estrés crónico puede agravar las úlceras de estómago. En una encuesta de población reciente involucró a 2014 sujetos, el estrés fue considerado como el más potente factor de riesgo en el cáncer gástrico [48]. Los resultados de los estudios experimentales sugieren que el aumento de actividad del sistema nervioso simpático puede constituir un mecanismo principal por el cual la expresión de genes factores fisiológicos impacto en tumores [49]. Hasta la fecha, la mayoría de estudios que investigan los mecanismos que conectan el estrés y la progresión del cáncer se ha relacionado con efectos indirectos a través de la inmunosupresión [8]. En varios estudios recientes, las proteínas y las vías relacionadas con el estrés estaban vinculados directamente a la alteración del comportamiento de las células malignas [10-17]. Sin embargo, hay una escasez de datos que delinean los mecanismos moleculares implicados.
En el presente estudio, se apreció un incremento de MMP-7 expresión en las líneas celulares de cáncer gástrico en respuesta a la estimulación de estrés relacionados con la hormona catecolamina. Se estima que la concentración de catecolamina puede ser más de 100 veces mayor en el microambiente tumoral que en los tejidos normales y de plasma circulante. MMP-7 es único en su expresión restringida en las células tumorales, lo que indica que MMP-7 expresión es de un modo asociado a un tumor. Nos dimos cuenta de que la estimulación isoproterenol significativamente hasta reguladas MMP-7 de expresión, tanto en los niveles de proteína en células de cáncer gástrico y el ARNm. antigonist β2-AR abrogada eficazmente la expresión de MMP-7 inducida por el isoproterenol regulación, lo que sugiere que la vía β2-AR mediada está implicado en el proceso.
MMP-7 expresión está estrechamente controlada a nivel de la transcripción. Nuestro estudio anterior demostró que la inducida por heregulina-β la expresión de MMP-7 estaba regulado por STAT3 mediada por la activación de HER2 y AP-1 en líneas celulares de cáncer de mama humano [42, 43]. También se identificaron los sitios de unión funcionales AP-1 y STAT3 en la primera de 350 pb del sitio de inicio de la transcripción de MMP-7 promotor humanos [42, 43]. Otro estudio indicó que FGF-2 podría regular positivamente directamente MMP-7 la expresión génica en líneas celulares tumorales humanas y las células endoteliales de la vena umbilical a través de AP-1 y STAT3 [50]. La acumulación de pruebas apoya firmemente que STAT3 sirve como un nodo de regulación central sobre el que convergen múltiples vías de señalización oncogénica [51]. la activación aberrante de STAT3 se ha demostrado jugar un papel crítico en el desarrollo del cáncer gástrico [52, 53]. Un estudio reciente y nuestros datos al descubierto la asociación de catecolaminas con la activación de STAT3 en células de cáncer de ovario y de mama [12, 13]. En el presente estudio, hemos demostrado que la estimulación isoproterenol inducida prominentemente la activación de STAT3 en células de cáncer gástrico, lo que implica que las catecolaminas puede acelerar la progresión maligna del cáncer gástrico. Nuestros datos no publicados también demostró que isoproterenol estimula la expresión de MMP-2 y MMP-9 en células de cáncer gástrico principalmente a través de la activación de STAT3. Sin embargo, en este estudio, se encontró que AP-1 muestra una mayor eficacia que la STAT3 en isoproterenol inducida por MMP-7 transcripción de genes y los elementos de STAT3 eran no-funcional, como silenciamiento de la expresión STAT3 no era eficaz en la prevención de MMP inducida por el isoproterenol 7 expresión y mutagénesis de tres sitios de unión de STAT3 no pudieron reprimir la transactivación de MMP-7 promotor en respuesta a la inducción isoproterenol. En contraste, el sitio AP-1 y c-Jun rigen este proceso. Curiosamente, STAT3 y c-Jun se encontraron para enlazar con el único AP-1 sitio en MMP-7 promotor simultáneamente, lo que implica que la interacción de ambos factores de transcripción en un sitio de unión es responsable de MMP-7 expresión isoproterenol estimuladas en el cáncer gástrico Células. Hemos demostrado que STAT3 y AP-1 son importantes reguladores de la transcripción de MMP-7 y MMP-9 en células de cáncer de mama humano previamente y STAT3 y AP-1 ejercer funciones de regulación de la transcripción mediante la unión a sus respectivos elementos de [42-44]. No.

Sequences

P1
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACC-3'
P2
5'-CCCAAGCTTTGCCGTCCAGAGACAATTG-3'
P3
5'-CGGGGTACCATAATGTCCTGAATGATACCTATGAGAGCAGTCATTTGACGCTGGCAAAA-3'
P4
5'-CATTGTGTGCTCCCTGCCACTAACGATGTAATACTT-3'
P5
5'-TTGTCTTTCAAAGGATT-3'
P6
5'-TACTTCCTCGTCCTAGCCAATGCAAAATAACACATAC-3'
P7
5' 3'
P8
5'-GAAAACACTCAAACGAGTGACCTATTTCCACAT-3'
P9
5'-TTTCTTTTTAGAGTCTACAG-3'
P10
5'-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3'
P11
5'-GTGAGCATCTCCTCCGAGAC-3'
P12
5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
P13
5'-CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
P14
5'-ACACATACTTTCAAAGTTCTGTAGACTCT-3'
P15
5'-ACGGTGAGTCGCATAGCT-3'

• alteración de proteómica en los adenocarcinomas de gastic patients
• Un paciente con cáncer gástrico con carcinomatosis peritoneal tratados con quimioterapia intraperitoneal que sobrevivieron más de 5 años de recibir exámenes laparoscópicas repetidas: un caso rep…