Detekcia Sentinel a non-sentinelových lymfatických uzlín mikrometastáz úplným sériového krájanie a imunohistochemické analýzou pre rakovinu žalúdka

Detekcia sentinelových a non-sentinelových lymfatických uzlín mikrometastáz úplným sériového krájanie a imunohistochemické analýzou pre rakovinu žalúdka
abstraktné
pozadia
sme skúmali prítomnosť a distribúciu stráž a non-sentinelovej mikrometastatické s použitím kompletnou seriál krájanie a imunohistochemické farbenie (IHC), kontrolovať, či lymfatických uzlín mikrometastáz šíri do sentinelovej uzliny prvý.
Metódy
celkovo 35 pacientov, ktorí podstúpili gastrektómii s biopsiu sentinelovej lymfatickej uzliny u karcinómu žalúdka, boli zaradené v tejto štúdii. boli vybrané; celkom 1028 lymfatických uzlín u 35 pacientov s rakovinou žalúdka bez metastáz lymfatických uzlín trvalým časti s hematoxylínom a eosínu (H &E AMP). Tam bolo 252 sentinelových uzlín a druhá 776 non-sentinelových uzlín. Všetky uzly boli narezané sériovo a striedavo zafarbené H &E a IHC. Lymfatických uzlín mikrometastáz bola definovaná ako Ukazuje sa, že prvé pozitívne buď IHC alebo kompletné sériové krájanie.
Výsledky
mikrometastáz boli zistené u 4 (11%) z 35 pacientov, 6 (0,58%) 1028 uzlov. Z týchto 4 pacientov, 3 mal mikrometastáz výhradne v sentinelových uzlín, a druhý mal micrometastasis v oboch Sentinel a non-sentinelových uzlín. Nebolo pacienta, ktorý mal micrometasitases iba v non-sentinelových uzlín.
Záver
Tieto výsledky podporujú koncept, že lymfatické uzliny micrometastasis karcinómu žalúdka šíri prvý, sentinelových uzlín.
Pozadie
prognózu u pacientov s karcinómom žalúdka je ovplyvnená predovšetkým prítomnosť metastáz lymfatických uzlín. Metastázy do lymfatických uzlín v prípade pacientov s karcinómom žalúdka s submukóznu invázie dochádza v 15 až 20% pacientov; Preto uzol pitva lymfatická nemusí byť potrebné pre zvyšné 80 až 85% pacientov [1]. Presný a spoľahlivý indikátor pre predikciu neprítomnosť metastáz lymfatických uzlín by odstránilo mnoho zbytočných lymfadenektómiou [1]. Preto predoperačnej a presná diagnóza lymfatických uzlín zostáva dôležitou [2-4]. Biopsia sentinelovej uzliny u karcinómu žalúdka je operačne diagnostická metóda pre detekciu metastáz v lymfatických uzlinách [5-7]. V roku 1992 Morton et al. [8] predstavil techniku ​​intraoperačnej injekcie farbiva v mieste melanómu pre identifikáciu "sentinelovej" uzla, čo je prvý uzol, že aferentných lymfatických ciev vstup z miesta nádoru. Miwa et al. [7, 9] zamestnaný tento typ mapovania farbivo techniky na identifikáciu sentinelových uzlín rakoviny žalúdka, a vykázala vysokú pozitívnu prediktívnu hodnotu a presnosť biopsia sentinelovej uzliny včasného karcinómu žalúdka. Na druhej strane, prítomnosť micrometastasis v lymfatických uzlinách je vážny problém pre klinické aplikácie biopsia sentinelovej uzliny pre skoré rakoviny žalúdka. Lymfatických uzlín mikrometastáz bolo zistené, že u pacientov, ktoré sú definované ako negatívnymi uzlinami rutinné histologické vyšetrenie. Predchádzajúce bádatelia uvádzajú, že lymfatických uzlín mikrometastáz, ktorú je možné detekovať za použitia kroku krájanie, imunohistochemické farbenie a reverznej transkriptázy-PCR [10-12]. Avšak, tam bolo niekoľko správ o distribúcii mikrometastáz v oboch sentinelových a non-sentinelových uzlín u pacientov s rakovinou žalúdka s negatívnymi uzlinami pri rutinnom histologickom vyšetrení [13-15].
V tejto štúdii sme retrospektívne skúmali prítomnosť a distribúcia Sentinel a non-sentinelových uzlín mikrometastáz s použitím kompletnou sériového krájanie a imunohistochemické farbenie. Tieto techniky sú najviac presné metódy na detekciu mikrometastáz v uzloch, aby sme mohli určiť, či sa lymfatických uzlín mikrometastáz rozšírila do sentinelových lymfatických uzlín ako prvý.
Metódy
sentinelovej uzliny (SLNs) biopsia pre rakovinu žalúdka bola vykonaná na 243 pacientov na oddelení gastroenterologická chirurgia, Kanazawa fakultnej nemocnice od roku 1993 do roku 2002. Pred biopsia sentinelovej uzliny bola vykonaná, písomný informovaný súhlas bol získaný v súlade s etickými normami výboru pre experimentovanie človeka Kanazawa fakultnej nemocnice. Z týchto pacientov, sme sa zapísal 35, ktorý mal rakovinu, ktorý napadol na submukóze alebo muscularis propria a nemala žiadny lymfatických uzlín rutinnom histologickom vyšetrení pri tejto štúdii. Žiadny z pacientov dostávala predoperačné chemoterapiu alebo rádioterapiu. na japonskom klasifikácie karcinóm žalúdka základe všetkých 35 pacientov podstúpilo biopsiu sentinelovej uzliny po ktorej nasleduje obvyklá lymfadenektómia pre back-up pitvy [16]. Celkom 1028 lymfatických uzlín boli odstránené z 35 pacientov. Z nich, 252 lymfatické uzliny boli SLNs a druhý 776 non-SLNs. Všetky 252 SLNs boli negatívne na metastázy ako na intraoperačnej vyšetrenie mrazené sekcie a trvalé časti s hematoxylínom a eosínu (H &E). Ostatné 776 uzliny boli negatívne na metastáz na histologické vyšetrenie pomocou H &E roztrúsenou kroku krájanie na cm intervaloch 0,2. Tieto patologickým dáta bola vyhodnotená podľa japonskej klasifikácie rakoviny žalúdka [16]. Charakteristiky pacientov sú uvedené v tabuľke 1. Pre detekciu SLNs, použili sme intraoperačnej endoskopické lymfatické mapovanie (IELM), ktorá sa skladala z intraoperačnej injekcie 0,2 ml 2% patentovej modrej do submukóznu vrstvy na štyroch miestach po celom karcinómu žalúdka prostredníctvom gastroskop [9]. Farbivo okamžite objavil na serózna povrch a zafarbia lymfatických ciev a uzlín [5, 9]. V tejto štúdii sa SLN bol definovaný ako lymfatické uzliny, že sfarbené modro 20 minút po injekcii. Lymfatické nádrže bola definovaná ako oblasť, obsahujúca farebného lymfatické cievy, a ktoré boli schopné byť rozdelené do piatich kategórií podľa pokynov tepien obklopený žalúdka, a to nasledovne: ľavej časti žalúdočné artérií, pravá časť žalúdka tepna, pravá časť gastroepiploic tepna, pravá časť gastroepiploic tepna a zadná plocha žalúdočné tepny. Odstránené SLNs boli odoslané na mrazené sekcie vyšetrenie. Lymfatické uzliny zafarbené H &E na reprezentatívnych úsekoch boli rez pozdĺž roviny s najväčším priemerom, ktorá zahŕňala hilum uzla, a skúmal intrao- pre ukazovatele metastases.Table 1 Pacienti
Stredný vek (rozsah)
62 (37-85)
sex
Muž
23
Žena
12
Hĺbka invázie
SM
24
MP
11
Histologické typ
diferenciácie *
18
nediferencovanej * *
17
lymfatických ciev inváziu
Negatívne
16.
pozitívny
19
Cievne invázie
Negatívne
30.
pozitívny
5
SM, Submucosa; MP, muscularis propuria
* Celkový diferencované typu; papilárne, dobre a stredne diferencovaný adenokarcinóm trubicové
** V nediferencovanej typu;. Zle diferencovaný adenokarcinóm, mucinózní adenokarcinóm a karcinóm Signet-ring bunka
zostávajúce mrazené tkaniva boli rozmrazí a tkaniva a non-SLNs boli rutinne delené cm intervaloch 0,2. Následne viacnásobné delené lymfatických uzlín a operaciindikováni vzorky boli fixované v 10% formalínu, spracované prostredníctvom etanolové, a vložené do parafínu pre trvalé sekcií. Lymfatické uzliny boli zafarbené H &. E a boli skúmané dvoma patológmi
V tejto štúdii, všetky operaciindikováni lymfatické uzliny boli narezané sériovo na 25 um intervaloch s hrúbkou 4 um navyše, a to buď striedavo zafarbené H &E a imunohistochemické farbenie (IHC) za použitia anti-cytokeratin protilátku. ENVISION bola použitá technika (Dako, Carpinteria, CA) pre IHC a sme použili monoklonálne anti-ľudskou cytokeratin 8/18 protilátky (Santa Cruz Biotechonology, California, USA) [17-19]. Všetky hlavné nádorové vzorky z 35 pacientov boli podrobené cytokeratin farbenie a boli použité ako pozitívna kontrola. Lymfatické uzliny micrometastasis bola definovaná ako uzol negatívny pre metastázy naším rutinné vyšetrenie histologické, ale pozitívny buď IHC alebo kompletné sériových rezov metód. Výsledky
Celkový počet sekcií skúmaná bola 24.094. Z nich 5986 bolo SLNs a 18.108 non-SLNs. Z 35 pacientov, 4 (11%) malo mikrometastáz. Micrometastasis bol nájdený v 6 uzlov 1028 (0,6%) a 60 úsekov (0,3%) na 24094 (obr. 1, 2). Z týchto 6 uzlov, na ktorých sa zúčastnilo micrometastasis, 4 boli SLNs a ďalšie dva non-SLNs v lymfatickom panvy. Žiadne mikrometastáz boli zistené mimo panvy (tabuľka 2). Podrobnosti o rozdelení vzoru, umiestnenia a veľkosti mikrometastáz sú uvedené v tabuľkách 3, 4 a 5. Z 4 pacientok, ktoré mali lymfatické uzliny micrometastasis, 3 pacienti mali mikrometastáz výhradne v SLNs. Druhý pacient mal micrometastasis v oboch SLN a non-SLNs v lymfatickom panvy. Žiadny pacient mal micrometastasis iba v non-SLNs. Žiadny pacient doteraz utrpel recidívu alebo zomrel v decembri, 2007.Table 2 počet a umiestnenie lymfatických uzlín s micrometastasis
Umiestnenie uzlov EU Počet uzlov

s micrometastasis
bez micrometastasis
SLNs
4
248
non-SLNs v lymfatickej povodí
2.
653
non-SLNs z panvice NETHRY.cz 0
121
všetkých uzloch
6
1022
SLNs, sentinel lymfatické uzliny
Tabuľka 3 Distribúcia vzor lymfatických uzlín micrometastasis
EU Počet prípadov
distribučné vzor micrometastasis
Bežná histologické vyšetrenie
kompletné serial krájaním a IHC
SLNs (-), non-SLNs (-)
35
31
SLNs (+), non-SLNs (-)
0
3
SLNs (+), non-SLNs (+) NETHRY.cz 0
1
SLNs (-), non-SLNs (+) NETHRY.cz 0
0
SLNs, Sentinel lymfatických uzlín; IHC, immunohistochemic farbenie
Tabuľka 4 Umiestnenie lymfatických uzlín micrometastasis
Prípad
Umiestnenie nádoru

Stained lymfatického umývadla EU Počet SLNs EU Počet micrometastsis
nádražie micrometastasis z SLNs
Station z micrometastasis zákazu SLNs
1
M, Menej
Left GA
8
1
No.3 LN -
2
M, Post
. left Right GA GEA
5
1
No.3 LN
-. Sims 3
M, Ant
Left GA
2
1
č.3 LN -
4
M, Menej
Left Right GA GEA
10 Sims 3
č.3 LN
č.3 LN
SLNs Sentinel lymfatických uzlín; M, Middle tretí žalúdka; Menej, menšie zakrivenie; Post.; zadnej steny; Ant. predná stena; GA, žalúdočné tepny; GEA, gastroepiploic tepna; No.3 LN LN pozdĺž menšie zakrivenie
Tabuľka 5 stránok a veľkosti lymfatických uzlín micrometastasis
Prípad
Typ lymfatických uzlín

Miesto v lymfatických uzlinách
Veľkosť micrometastasis (mm) foto 1
SLN
periférne sinus
1,2
2.
SLN
periférne sinus
0,3 Sims 3
SLN
periférne sinus
0.2
4.
SLN
periférne sinus
0,6
non-SLN
periférne sinus 1,0
non-SLN
obvodové dutiny 1,0
SLN, sentinelovej lymfatické uzliny
Obrázok 1 uzlina mircrometastasis ako detekovanej imunohistochemické farbením cytokeratin protilátku. (X 400).
Obrázok 2 žiadne rakovinové bunky boli identifikované v tejto časti rutinnom histologickom vyšetrení. (Hematoxylin-& eozín, x 40). Uzol micrometastasis (b) lymfatických v reprezentatívnom úseku pri celej metódy sériového krájanie. (Imunohistochemické farbenie, x 40). (C) Micrometastasis lymfatických uzlín v reprezentatívnom úseku pri celej metódy sériového krájanie. (Imunohistochemické farbenie, × 400)
Diskusia
Miwa et al. predstavil koncept biopsia sentinelovej uzliny u karcinómu žalúdka [7]. Klinické použitie biopsia sentinelovej uzliny určiť chirurgický prístup na rakovinu žalúdka vyžaduje overenie tohto konceptu na úrovni lymfatických uzlín mikrometastáz. V tejto štúdii sme skúmali prítomnosť a distribúciu lymfatických uzlín mikrometastáz u pacientov s rakovinou žalúdka, ktorý mal biopsiu sentinelovej uzliny. V poslednej dobe sa prítomnosť lymfatických uzlín mikrometastáz nedetegovateľné rutinné histologické vyšetrenie bola hlásená pri prsníku, pľúc, pažeráka, žalúdka, hrubého čreva a žlčníka rakoviny. Bolo oznámené, že lymfatické uzliny micrometastasis bol chudobný prognostickým indikátorom v prsníku, pľúc, hrubého čreva a rakoviny [20-22]. Niekoľko autorov hlásil, že uzlina micrometastasis bol zlý prognostický faktor u pacientov s rakovinou žalúdka [23, 24]. To znamená, že význam detekcie lymfatických uzlín micrometastasis bola zdôraznená rôznych nádorových ochorení.
Celú radu metód pre detekciu lymfatických uzlín mikrometastáz existujú, vrátane IHC a polymerázová reťazová reakcia testoch. Matsumoto et al. preukázali, že reverzná transkriptáza-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR) sú oveľa citlivejšie ako IHC pre detekciu mikrometastáz [2]. Avšak, Yamamoto et al. [25] naznačujú, že pozitívne výsledky s molekulovú testu, ako je RT-PCR, nemusí byť indikatívne pre prítomnosť životaschopných nádorových buniek, ale skôr prítomnosť nádoru DNA a teda môže byť spojené s výrazne zvýšeným falošne pozitívnych výsledkov, aj napriek vyššiu citlivosť molekulárnej testu. Na druhej strane, bolo popísané, že sériovo krájanie zvýšila identifikáciu nádorových buniek v periférnych lymfatických uzlín dutín v [26]. Predpokladá sa, že sériové rezy s IHC je najpresnejší metóda pre detekciu lymfatických uzlín mikrometastáz. Preto sme podrobili celú vzorku do sériového krájanie a IHC. Protilátka použitá pre IHC bola monoklonálna protilátka proti ľudskému cytokeratin 8/18 protilátka, ktorá je citlivejšia, špecifický, jednoduchý, presný a ekonomickejšie ako iné protilátok pre IHC.
Ložiská nádoru v rámci lymfatických uzlín boli klasifikované a postupné v závislosti na revidované usmernenia stanovené Medzinárodnou únie proti rakovine (UICC) 6 ročník. Podľa tohto systému klasifikácie, metastáz menšia ako 0,2 cm boli považované za mikrometastáz (MMS), a izolované nádorové bunky (ITC) boli jednotlivé nádorové bunky alebo malé zhluky buniek, ktoré namerané nie väčšie ako 0,2 mm a boli zvyčajne detekované IHC alebo molekulárnych metód , ale môže byť overená pomocou H &E. ITC nie sú typicky vykazovať známky metastatické aktivity proliferácie, indukciu stromálny reakcie alebo preniknutiu cievne alebo lymfatickej sinus stenu inváziu [27, 28]. Nakajo et al. [23] a Siewert et al. [29] uviedli, že zapojenie lymfatických uzlín je zaradený do vzniku klastrov alebo jednotlivých foriem buniek, podľa výsledkov IHC pre cytokeratin. Ich výsledky naznačujú, že jednotlivé bunky nemôžu množiť v lymfatických uzlinách, pretože už boli zabité miestnych a celkových imunocytov. Zhluk buniek s stromálny reakcie môžu ľahko množiť, a preto majú metastatické potenciál. V našom oddelení, operaciindikováni lymfatické uzliny sú stále rez v cm intervaloch 0,2 a lymfatické uzliny sú skúmané pre metastáz. Takže, v tejto štúdii, je definícia lymfatických uzlín micrometastasis líšila od klasifikácie UICC. V tejto štúdii bola definovaná ako uzol, negatívne na metastáz našej rutinné histologického vyšetrenia výrezy v cm intervaloch 0,2, ale pozitívny úplné sériové rezy s H &E a IHC. Okrem toho sú všetky jednotlivé typy buniek a malé typy klastrovej bez stromálny reakcie cytokeratin pozitívne farbenie neboli rozpoznané ako nádorových buniek v budúcom H &E zafarbené sklíčko. Preto sme vylúčili všetky jednotlivé bunky a malé zhluky, bez toho aby sa stromálne reakcií, ktoré sú klasifikované ako ITC v systéme klasifikácie UICC, zo micrometastasis skupiny pozitívnych lymfatických uzlín [27, 28].
Vylúčili sme pacientov s rakovinou žalúdka, ktorých nádory napadol na sliznicu v tejto štúdii preto, že robí kompletné sériové krájanie a imunohistochemické farbenie bolo veľa práce; Okrem toho, rýchlosť z lymfatických uzlín micrometastasis bola nízka. V súlade s tým sme predmetu 35, ktorý mal žalúdočné rakovina, ktorý napadol na submukóze alebo muscularis propria a nemala žiadny dôkaz o lymfatických uzlín od histologické vyšetrenie pre túto štúdiu.
V tejto štúdii sme pozorovali lymfatických uzlín micrometastasis u 4 pacientov (11%) s rakovinou žalúdka, ktorý napadol na submukóze alebo muscularis propria. V prípade rakoviny žalúdka, Isozaki et al. [30] a Natsugoe et al. [31] uvádzajú, že lymfatických uzlín mikrometastáz boli identifikované v 10 až 30% vzoriek za krokom-krájanie alebo IHC. Naše výsledky boli čo najpresnejšie zo všetkých minulých štúdiách a ukázala skutočné okolnosti lymfatických uzlín micrometastasis žalúdočných rakovín, ktorý napadol na Submucosa alebo muscularis propria.
V tejto štúdii sme skúmali lymfatických uzlín mikrometastatické z SLNs a non -SLNs. Zistili sme, lymfatických uzlín mikrometastatické v SLNs zo 4 pacientov. Jeden pacient mal tiež micrometastasis v non-SLN lymfatického panvy, hoci žiadne mikrometastáz ne-SLNs boli identifikované mimo povodia. Okrem toho, žiadny pacient mal lymfatických uzlín micrometastasis len v non-SLN. Naše výsledky ukázali, že pacienti, ktorí nemali lymfatické uzliny micrometastasis v SLNs tiež nemal micrometastasis v nepodnikateľskej SLNs. Tieto výsledky môžu podporovať koncepciu, že lymfatické uzliny mikrometastáz rozšírila najprv do SLNs, potom non-SLNs v lymfatickom panvy a nakoniec non-SLNs mimo povodia. Preto, na základe tejto koncepcie, postačí skúmať iba SLNs na určenie, či sú alebo nie sú prítomné lymfatických uzlín mikrometastáz u pacientov s rakovinou žalúdka.
Je stále nejasné, či uzlina micrometastasis je prognostickým faktorom u karcinómu žalúdka , Avšak, lymfatických uzlín micrometastasis bolo zistené u pacientov s karcinómom žalúdka, ktorí mali žiadny dôkaz o lymfatických uzlín u rutinným farbením a. Tento výsledok naznačuje, že by sme mali opatrne znížiť rozsah lymfatických uzlín pitvy. Pri operácii Absencia SLN micrometastasis naznačuje, že rozsah lymfadenektómia môže byť bezpečne znížená, pretože je nepravdepodobné, že pre non-SLNs mať mikrometastatické bez SLN micrometastasis. V prípade rakoviny prsníka, že je potrebné pre intraoperačnej diagnostiku lymfatických uzlín mikrometastáz nie je podstatné, pretože ďalší disekcia axilárnych lymfatických uzlín môže byť vykonané ľahko. Avšak, nasledujúce disekcia lymfatických uzlín je ťažké v karcinómu žalúdka; Preto, pri operácii diagnóza lymfatických uzlín mikrometastáz je rozhodujúci. Verili sme, že keď bol prítomný lymfatických uzlín micrometastasis, mali by sme vykonať uzlín v súčasnosti. V našej štúdii sme využili najpresnejších metód, ale nemohli sme získať výsledky dostatočne rýchlo pre itraoperative diagnózu. Preto je potrebné stanoviť presný spôsob pre rýchle peroperačný identifikáciu. Matsumoto et al. tvrdil, že počas operácie rýchleho imunologické bola jednoduchá a užitočná metóda na detekciu lymfatických uzlín mikrometastatické [32]. Ultra-rýchle RT-PCR systém, ktorý môže splniť detekciu nádorových buniek počas asi 70 minút, bol vyvinutý. V blízkej budúcnosti, budú použité tieto metódy pre detekciu lymfatických uzlín mikrometastatické v SLNs počas chirurgického zákroku [33].
Záver
sme preukázali schopnosť detekovať lymfatických uzlín mikrometastatické vystavením celá vzorka na dokončenie sériového krájanie a IHC pre pacientov s rakovinou žalúdka s negatívnymi uzlinami, ktorí podstúpili biopsiu sentinelovej uzliny. Tieto výsledky podporujú koncept, ktorý sa šíri do lymfatických uzlín mikrometastáz prvého do SLNs. Okrem toho sa počas operácie a rýchla diagnostika lymfatických uzlín mikrometastáz v SLNs môže pomôcť viesť zodpovedajúce disekcia lymfatických uzlín u pacientov s rakovinou žalúdka. Z tohto dôvodu bude potrebné rýchla a presná peroperačný diagnóza lymfatických uzlín mikrometastáz v SLNs a mal by byť zameraný na budúce štúdie.
Vyhlásenie
Poďakovanie
Autori ďakujú profesorom Tetsuo Ohta v Kanazawa univerzity za to študovať. A tiež vďaka pre-profesor Koichi Miwa.
Autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodných predložených súbory pre obrazy. "Pôvodný súbor na obrázku 1 13046_2008_7_MOESM2_ESM.tiff autorského 13046_2008_7_MOESM1_ESM.tiff autorov pôvodného súboru na obrázku 2

• fibroblasty s rakovinou spojené so pozitívnu koreláciu s metastatickým potenciálom ľudských karcinómov žalúdka
• Dlhá nekódujúca RNA profil expresie v ľudskom žalúdku rakoviny a jej klinické významov