Rilevazione di sentinella e non sentinella micrometastasi linfonodali di sezionamento di serie completa e analisi immunoistochimica per la rilevazione cancer

gastrica di sentinella e non sentinella micrometastasi linfonodali dal sezionamento di serie completa e analisi immunoistochimica per cancro gastrico
Abstract
sfondo
Abbiamo studiato la presenza e la distribuzione di Sentinel e le micrometastasi nodo non sentinella utilizzando sezionamento di serie completa e colorazione immunoistochimica (IHC), per ispezionare se micrometastasi linfonodali diffuso ai linfonodi sentinella prima.
Metodi
a totale di 35 pazienti, sottoposti a gastrectomia con una biopsia del linfonodo sentinella, linfa per il cancro gastrico, sono stati arruolati in questo studio. sono stati selezionati; totale di 1028 linfonodi di 35 pazienti che hanno il cancro gastrico, senza metastasi linfonodali per sezione permanente con ematossilina e eosina (E H &). Ci sono stati 252 nodi sentinella e l'altro 776 erano i nodi non-sentinella. Tutti i nodi sono stati sezionati in serie e colorate alternativamente con H & E e IHC. micrometastasi ai linfonodi è stata definita come dimostrando di essere positivo prima né l'IHC o il sezionamento di serie completo.
Risultati
micrometastasi sono stati individuati in 4 (11%) dei 35 pazienti, 6 (0,58%) di 1028 nodi. Di questi 4 pazienti, 3 avevano micrometastasi esclusivamente in linfonodo sentinella, e l'altro aveva micrometastasi in entrambi sentinella e nodi non-sentinella. Non c'era nessun paziente che ha avuto le micrometasitases solo nei nodi non-sentinella.
Conclusione
Questi risultati supportano il concetto che linfonodo micrometastasi del cancro gastrico si diffonde prima di sentinella nodi.
Sfondo
La prognosi di i pazienti con cancro gastrico è influenzato principalmente dalla presenza di metastasi linfonodali. Metastasi linfonodali in pazienti affetti da cancro gastrico con sottomucosa invasione si verificano in 15 al 20% dei pazienti; Pertanto, una dissezione linfonodale può essere inutile per il restante 80 al 85% dei pazienti [1]. Un indicatore preciso e affidabile per prevedere l'assenza di metastasi linfonodali eliminerebbe molti linfoadenectomia inutili [1]. Pertanto, una diagnosi preoperatoria e accurata di metastasi linfonodali rimane importante [2-4]. Una biopsia del linfonodo sentinella per il cancro gastrico è un metodo diagnostico intraoperatoria per rilevare metastasi linfonodali [5-7]. Nel 1992, Morton et al. [8] ha introdotto la tecnica di iniezione colorante intraoperatoria al sito del melanoma per identificare il nodo "sentinella", che è il primo nodo che i linfatici afferenti entrano dal sito del tumore. Miwa et al. [7, 9] impiegato questo tipo di tecnica di mappatura colorante per identificare i linfonodi sentinella di cancro gastrico, e ha riferito un alto valore predittivo positivo e precisione per la biopsia del linfonodo sentinella di cancro gastrico precoce. D'altra parte, la presenza di una micrometastasi in un linfonodo è un grave problema per l'applicazione clinica del linfonodo sentinella per il cancro gastrico precoce. micrometastasi linfonodali sono stati trovati in pazienti determinati ad essere nodo-negativo con l'esame istologico di routine. investigatori precedenti hanno riportato che micrometastasi linfonodali potrebbero essere rilevati utilizzando il sezionamento passo, colorazione immunoistochimica e la reazione a catena della polimerasi trascrittasi inversa-[10-12]. Tuttavia, ci sono state alcune segnalazioni circa la distribuzione di micrometastasi nei nodi sia la sentinella e non sentinella in linfonodi negativi pazienti affetti da cancro gastrico mediante un esame istologico di routine [13-15].
In questo studio, abbiamo studiato la retrospettivamente la presenza e la distribuzione di Sentinel e micrometastasi nodo non sentinella utilizzando sezionamento di serie completa e colorazione immunoistochimica. è stata eseguita Questi tecnica sono i metodi più accurati per rilevare micrometastasi nei nodi in modo da poter determinare se micrometastasi linfonodali avevano diffuso ai linfonodi sentinella primi.
Metodi
Un linfonodo sentinella (linfonodi sentinella) biopsia per il cancro gastrico su 243 pazienti presso il Dipartimento di Chirurgia gastroenterologica, Kanazawa University Hospital dal 1993 al 2002. Prima della biopsia del linfonodo sentinella è stata eseguita, consenso informato scritto è stato ottenuto in accordo con gli standard etici della commissione per la sperimentazione umana di Kanazawa University Hospital. Di questi pazienti, abbiamo arruolato 35 che aveva un cancro che aveva invaso la sottomucosa o muscolare propria e non ha avuto metastasi linfonodali con l'esame istologico di routine per questo studio. Nessuno dei pazienti aveva ricevuto chemioterapia preoperatoria o radioterapia. In base alla classificazione giapponese di gastrico Carcinoma, tutti i 35 pazienti sono stati sottoposti a biopsia del linfonodo sentinella seguita da linfoadenectomia convenzionale per back-up dissezione [16]. Un totale di 1028 linfonodi sono stati rimossi dal 35 pazienti. Di questi, 252 linfonodi erano linfonodi sentinella e l'altra 776 erano non linfonodi sentinella. Tutte le 252 linfonodi sentinella sono risultati negativi per le metastasi sia sul intraoperatorio esame congelato sezione e sezione permanente con ematossilina e eosina (H & E). Gli altri 776 nodi sono risultati negativi per le metastasi in esame istologico di H & E di passo più sezionamento a intervalli di 0,2 cm. I dati clinico-patologici sono stati valutati secondo la classificazione giapponese di cancro gastrico [16]. Le caratteristiche dei pazienti sono elencate nella tabella 1. Per la rilevazione dei linfonodi sentinella, abbiamo utilizzato intraoperatoria endoscopica mappatura linfatica (IeLM), che consisteva di una iniezione intraoperatoria di blu brevetto 0,2 ml di 2% nello strato sottomucosa in quattro siti in tutto il carcinoma gastrico attraverso gastroscopio [9]. Il colorante subito apparso in superficie sierosa e macchiato i vasi linfatici e nodi [5, 9]. In questo studio, la SLN è stato definito come il linfonodo che macchiato blu 20 minuti dopo l'iniezione. I bacini linfatici sono stati definiti come l'area contenente i vasi linfatici macchiati, che potevano essere diviso in cinque categorie secondo le direzioni delle arterie circondato stomaco, come segue: la zona dell'arteria gastrica sinistra, destra dell'area arteria gastrica, il diritto zona gastroepiploica arteria, l'area dell'arteria gastroepiploica destra e l'area dell'arteria gastrica posteriore. I linfonodi sentinella asportati sono stati inviati per l'esame frozen-sezione. I linfonodi colorate con H & E su sezioni rappresentative sono stati tagliati lungo il piano con il più grande diametro che comprendeva il ilo nodo, ed esaminati intraoperatoria per le caratteristiche metastases.Table 1 Pazienti
età media (range)
62 (37-85)
Sesso
Maschio
23
femminile
12
profondità dell'invasione
SM
24
MP
11
tipo istologico
dissociati *
18
indifferenziato * *
17
Linfatici invasione
negativo
16
positivo
19
vascolare invasione
negativo
30
positivo 5
SM, sottomucosa; MP, muscolare propuria
* Il tipo di differenziata; papillare, bene e moderatamente differenziato adenocarcinomi tubolari
** Il tipo indifferenziato;. Adenocarcinoma scarsamente differenziato, adenocarcinoma mucinoso e carcinoma a cellule ad anello con castone
I tessuti congelati rimanenti erano scongelati, ed i tessuti e non-linfonodi sentinella sono stati sistematicamente tagliati a intervalli di 0,2 cm. Successivamente, le molteplici linfonodi sezionato e campioni asportati sono stati fissati in formalina al 10%, trattati attraverso etanolo graduato, e inclusi in paraffina per le sezioni permanenti. I linfonodi sono state colorate con H &. E e sono stati esaminati da due patologi
In questo studio, tutti i linfonodi asportati sono stati sezionati in serie a intervalli di 25 micron di spessore di 4 micron, in aggiunta e sia alternativamente colorate con H & E e colorazione immunoistochimica (IHC) utilizzando un anticorpo anti-citocheratina. La tecnica è stata usata ENVISION (DAKO, Carpinteria, CA) per IHC e abbiamo usato il monoclonale citocheratina 8/18 anticorpo anti-umano (Santa Cruz Biotechonology, California, USA) [17-19]. Tutti i principali campioni tumorali da 35 pazienti sono stati sottoposti a colorazione citocheratina e sono stati utilizzati come controllo positivo. Un micrometastasi linfonodo è stato definito come un nodo negativo per le metastasi dal nostro esame istologico di routine, ma positivo sia dalla IHC o metodi completi di sezionamento seriali.
Risultati
Il numero totale di sezioni esaminato era 24.094. Di questi, 5986 erano linfonodi sentinella e 18.108 erano non-linfonodi sentinella. Dei 35 pazienti, 4 (11%) avevano micrometastasi. Un micrometastasi è stato trovato in 6 di 1028 nodi (0,6%) e 60 sezioni (0,3%) di 24.094 (Figg. 1, 2). Di questi 6 nodi che coinvolgono una micrometastasi, 4 erano linfonodi sentinella e gli altri 2 erano non-linfonodi sentinella nel bacino linfatico. Non micrometastasi sono stati rilevati fuori del bacino (Tabella 2). I dettagli del modello di distribuzione, la posizione e le dimensioni delle micrometastasi sono riportati nelle tabelle 3, 4 e 5. Tra i 4 pazienti che avevano una micrometastasi linfonodo, 3 pazienti avevano micrometastasi nei linfonodi sentinella esclusiva. L'altro paziente aveva una micrometastasi sia nel linfonodo sentinella e non linfonodi sentinella nel bacino linfatico. Nessun paziente ha avuto una micrometastasi solo nel non-linfonodi sentinella. Nessun paziente ha ancora subito una recidiva o è morto a partire da dicembre, 2007.Table 2 Numero e posizione dei linfonodi con micrometastasi
Localizzazione di nodi
Numero di nodi

con micrometastasi
senza micrometastasi
linfonodi sentinella 4
248
non linfonodi sentinella nel bacino linfatico Pagina 2
653
non linfonodi sentinella su bacino
0
121
Tutti i nodi
6
1022
linfonodi sentinella, linfonodo sentinella
Tabella 3 modello di distribuzione di linfonodale micrometastasi

Numero di casi
modello di distribuzione di micrometastasi
esame istologico di routine
completo sezionamento di serie e IHC
linfonodi sentinella (-), non linfonodi sentinella (-)
35
31
linfonodi sentinella (+), non linfonodi sentinella (-)
0
3
linfonodi sentinella (+), non linfonodi sentinella (+)
0
1 linfonodi sentinella (-), non linfonodi sentinella (+)
0 0

linfonodi sentinella, linfonodo sentinella; IHC, immunohistochemic colorazione
Tabella 4 Posizione di linfonodo micrometastasi
caso
sede del tumore

macchiato bacini linfatici
numero di linfonodi sentinella
Numero di micrometastsis
stazione di micrometastasi di linfonodi sentinella
stazione di micrometastasi di non linfonodi sentinella

1 M, Meno
sinistra GA
8
1 No.3 LN
- 2
M, post
. sinistra Destra GA GEA
5
1 No.3 LN
-. 3
M, Formica
sinistra GA 2
1
No.3 LN
- 4
M, Meno
sinistra Destra GA GEA 10
3
No.3 LN
No.3 LN
linfonodi sentinella, linfonodo sentinella; M, terzo medio dello stomaco; Meno, piccola curvatura; Inviare.; parete posteriore; Formica. parete anteriore; GA, arteria gastrica; GEA, arteria gastroepiploica; No.3 LN, LN lungo la curvatura minore
Tabella 5 del sito e la dimensione del linfonodo micrometastasi
caso
Tipo di linfonodo

sito nel linfonodo
Dimensioni di micrometastasi (mm)
1
SLN
seno periferico
1.2 2
SLN
seno periferico
0.3 3
SLN
seno periferico
0,2 4
SLN
seno periferico
0,6
non SLN sinusale periferico
1.0
non SLN
seno periferico
1.0
SLN, linfonodo sentinella
figura 1 linfonodale mircrometastasis come rilevato dalla colorazione immunoistochimica con un anticorpo citocheratina. (× 400).
Figura 2 non le cellule tumorali sono state identificate in questa sezione con l'esame istologico di routine. (Ematossilina & eosina, × 40). (B) linfonodale micrometastasi nella sezione rappresentante per l'intero metodo sezionamento seriale. (Colorazione immunoistochimica, × 40). (C) micrometastasi linfonodali nella sezione rappresentativo dell'intero metodo di sezionamento seriale. (Colorazione immunoistochimica, × 400)
Discussione
Miwa et al. introdotto il concetto di biopsia del linfonodo sentinella per cancro gastrico [7]. L'uso clinico della biopsia del linfonodo sentinella per determinare l'approccio chirurgico per cancro gastrico richiede la verifica di questo concetto a livello dei linfonodi micrometastasi nodo. In questo studio, abbiamo studiato la presenza e la distribuzione di micrometastasi linfonodali in pazienti con cancro gastrico che aveva una biopsia del linfonodo sentinella. Di recente, la presenza di micrometastasi linfonodali non rilevabili con l'esame istologico di routine è stata riportata in mammella, del polmone, esofago, stomaco, colon e della cistifellea tumori. E 'stato riferito che una micrometastasi linfonodo era un povero indicatore prognostico nel mammella, del polmone, e tumori del colon [20-22]. Alcuni autori hanno riportato che una micrometastasi linfonodo era un povero fattore prognostico nei pazienti affetti da cancro gastrico [23, 24]. Così, l'importanza del rilevamento di una micrometastasi linfonodali è stata evidenziata per varie malattie neoplastiche.
Una varietà di metodi per rilevare esistono micrometastasi linfonodali, compresi IHC e dosaggi reazione a catena della polimerasi. Matsumoto et al. dimostrato che la reazione inversa a catena transcriptasi-polimerasi (RT-PCR) è più sensibile IHC per la rilevazione di micrometastasi [2]. Tuttavia, Yamamoto et al. [25] ha suggerito che i risultati positivi con un saggio molecolare come RT-PCR possono non essere indicativi della presenza di cellule tumorali vitali, ma la presenza di DNA tumorale e, quindi, può essere associato ad un notevolmente aumentato tasso di falsi positivi nonostante la maggiore sensibilità del test molecolare. D'altra parte, è stato riportato che la serie di sezionamento aumentato l'identificazione di cellule tumorali nei seni periferici di linfonodi [26]. Si pensa che sezionamento seriale con IHC è il metodo più accurato per la rilevazione di micrometastasi linfonodali. Pertanto, abbiamo sottoposto l'intero campione a sezionamento di serie e IHC. L'anticorpo utilizzato per IHC era un anti-umano citocheratina 8/18 anticorpo monoclonale che è più sensibile, preciso, semplice, preciso ed economico rispetto ad altri anticorpi per IHC.
Depositi tumorali all'interno linfonodi sono state classificate e messo in scena in base al nuovi orientamenti fissati dalla Union Against Cancer (UICC) 6 ° edizione. Secondo questo sistema di classificazione, le metastasi meno di 0,2 cm sono stati considerati micrometastasi (MMS), e le cellule tumorali isolate (ITC) sono state le cellule tumorali singoli o piccoli gruppi di cellule che hanno misurato non superiore a 0,2 mm e sono stati di solito rilevati dal IHC o metodi molecolari , ma può essere verificata con H & e. ITC non mostrano in genere prove di attività metastatica dalla proliferazione, l'induzione di una reazione stromale, o la penetrazione di vascolare o linfatica invasione parete del seno [27, 28]. Nakajo et al. [23] e Siewert et al. [29] hanno riportato che il coinvolgimento dei linfonodi è classificato in formazione di cluster o forme unicellulari, secondo i risultati di IHC per citocheratina. I loro risultati hanno suggerito che singole cellule non possono proliferare in linfonodi perché sono stati già uccisi da immunociti locali e generali. Un cluster di celle con una reazione stromale può facilmente proliferare e quindi hanno il potenziale metastatico. Nel nostro reparto, linfonodi asportati sono regolarmente tagliate a intervalli di 0,2 cm e i linfonodi sono esaminati per metastasi. Quindi, in questo studio, la definizione di linfonodo micrometastasi differiva dalla classificazione UICC. Per questo studio è stato definito come un nodo, negativa per le metastasi dal nostro esame istologico di routine delle sezioni tagliate ad intervalli di 0,2 cm, ma positivo sezionamento seriale completo di H & E e IHC. Inoltre, tutti i tipi di cellule singole e tipi di cluster di piccole dimensioni, senza una reazione stromale dalla colorazione positiva citocheratina non sono state riconosciute come le cellule tumorali nel prossimo H & E vetrino colorato. Così, abbiamo escluso tutte le celle singole e piccoli gruppi, senza una reazione stromale, che sono classificati come ITC nel sistema di classificazione UICC, dal gruppo linfonodo positivo micrometastasi [27, 28].
Sono stati esclusi i pazienti affetti da cancro gastrico cui tumori aveva invaso alla mucosa in questo studio perché facendo sezionamento di serie completa e colorazione immunoistochimica è stato un sacco di lavoro; Inoltre, il tasso di micrometastasi linfonodo era basso. Di conseguenza abbiamo arruolato 35 che aveva un cancro gastrico che aveva invaso la sottomucosa o muscolare propria e non ha avuto evidenza di metastasi linfonodali con l'esame istologico per questo studio.
In questo studio, abbiamo osservato una micrometastasi linfonodo in 4 pazienti (11%), con un cancro gastrico che aveva invaso la sottomucosa e muscolare propria. Nel cancro gastrico, Isozaki et al. [30] e Natsugoe et al. [31] hanno riportato che micrometastasi linfonodali sono stati identificati in 10 al 30% dei campioni passo-sezionamento o IHC. I nostri risultati sono stati il ​​più preciso di tutti gli studi passati e hanno dimostrato le circostanze effettive di linfonodo micrometastasi di tumori gastrici che avevano invaso la sottomucosa e muscolare propria.
In questo studio, abbiamo esaminato le micrometastasi linfonodali di linfonodi sentinella e non -SLNs. Abbiamo trovato micrometastasi linfonodali nei linfonodi sentinella di 4 pazienti. Un paziente aveva anche una micrometastasi in un non-SLN del bacino linfatico, anche se non micrometastasi di non linfonodi sentinella sono state individuate al di fuori del bacino. Inoltre, nessun paziente aveva una micrometastasi linfonodali solo in un non-SLN. I nostri risultati hanno rivelato che i pazienti che non hanno avuto una micrometastasi linfonodo nei linfonodi sentinella, inoltre, non avevano una micrometastasi nei linfonodi sentinella non. Questi risultati possono sostenere il concetto che la linfa micrometastasi nodo diffuse prima ai linfonodi sentinella, poi ai non linfonodi sentinella nel bacino linfatico e, infine, per i non linfonodi sentinella al di fuori del bacino. Pertanto, sulla base di questo concetto, è sufficiente esaminare solo i linfonodi sentinella per determinare se ci sono linfa micrometastasi nodi in pazienti con cancro gastrico.
Non è ancora chiaro se una micrometastasi linfonodo è un fattore prognostico nel cancro gastrico . Tuttavia, una micrometastasi linfonodo è stato trovato in pazienti affetti da cancro gastrico che non avevano evidenza di metastasi linfonodali mediante colorazione di routine. Questo risultato suggerisce che dovremmo cautela ridurre l'estensione delle dissezioni linfonodali. Il intraoperatoria assenza di una micrometastasi SLN suggerisce che l'estensione della dissezione linfonodale può essere tranquillamente ridotti, perché è improbabile che per i non linfonodi sentinella di avere micrometastasi senza micrometastasi SLN. Nel caso del cancro al seno, la necessità per la diagnosi intraoperatoria di micrometastasi linfonodali non è essenziale, perché ulteriori dissezione dei linfonodi ascellari può essere eseguita facilmente. Tuttavia, la successiva dissezione dei linfonodi è difficile in cancro gastrico; Pertanto, la diagnosi intraoperatoria della linfa micrometastasi nodo è fondamentale. Abbiamo creduto che quando un micrometastasi linfonodo era presente, si deve eseguire una dissezione linfonodale al presente. Il nostro studio ha utilizzato i metodi più accurati, ma non siamo riusciti a ottenere i risultati abbastanza rapidamente per una diagnosi itraoperative. Pertanto, abbiamo bisogno di stabilire un metodo accurato per una rapida identificazione intraoperatoria. Matsumoto et al. ha affermato che intraoperatoria rapida immunostaining era una tecnica semplice e utile per la rilevazione di micrometastasi linfonodali [32]. Un ultra-rapida sistema RT-PCR, che può completare la rilevazione delle cellule tumorali entro circa 70 minuti, è stato sviluppato. Nel prossimo futuro, saranno applicati questi metodi per rilevare micrometastasi linfonodali in linfonodi sentinella durante l'intervento [33].
Conclusione
abbiamo dimostrato la capacità di rilevare micrometastasi linfonodali sottoponendo l'intero campione per completare sezionamento e di serie IHC per i pazienti di cancro gastrico con linfonodi negativi che hanno avuto una biopsia del linfonodo sentinella. Questi risultati supportano il concetto che la linfa micrometastasi nodo si diffonde prima ai linfonodi sentinella. Inoltre, la diagnosi intraoperatoria e rapida di micrometastasi linfonodali in linfonodi sentinella può aiutare a guidare la dissezione dei linfonodi appropriato in pazienti affetti da cancro gastrico. Pertanto, una diagnosi intraoperatoria rapida e accurata di micrometastasi linfonodali in linfonodi sentinella sarà necessario e dovrebbe essere al centro di studi futuri.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Gli autori sono grati al professor Tetsuo Ohta a Kanazawa Università per questo studio. E abbiamo anche grazie al pre-professore Koichi Miwa.
Autori fascicoli presentati originali per
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