Påvisning av sentinel og ikke-sentinel lymfeknute mikrometastaser fra hele serie seksjonering og immunhistokjemisk analyse for magekreft

Påvisning av sentinel og ikke-sentinel lymfeknute mikrometastaser fra hele serie seksjonering og immunhistokjemisk analyse for magekreft
Abstract
Bakgrunn
Vi undersøkte tilstedeværelse og distribusjon av sentinel og de ikke-sentinel node mikrometastaser ved hjelp av hele serie seksjonering og immunhistokjemisk farging (IHC), for å kontrollere om lymfeknutemikrometastaser spres til sentinel lymfeknuter først.
Metoder
totalt 35 pasienter, som gjennomgikk gastrektomi med en sentinel lymfeknute biopsi for magekreft, ble innrullert I denne studien. Totalt 1028 lymfeknuter av 35 pasienter med magekreft uten metastasering av lymfeknute ved permanent del med hematoxylin og eosin farging (H & E) ble valgt. Det var 252 fast punkt noder og den andre 776 var ikke-sentinel noder. Alle noder ble seksjonert serielt og farget vekselvis med H & E og IHC. Lymfeknutemikrometastaser ble definert som viser seg å være positiv først enten IHC eller hele seriesnitte.
Resultatene
mikrometastaser ble påvist i fire (11%) av de 35 pasienter, 6 (0,58%) av 1028 noder. Av disse 4 pasienter, tre hadde mikrometastaser utelukkende i sentinel noder, og den andre hadde micrometastasis i begge sentinel og ikke-sentinel noder. Det var ingen pasienter som hadde micrometasitases bare i ikke-sentinel noder.
Konklusjon
Disse resultatene støtter ideen om at lymfeknute micrometastasis av magekreft sprer første Sentinel noder.
Bakgrunn
prognose pasienter med magekreft påvirkes primært av tilstedeværelsen av lymfeknutemetastaser. Lymfeknutemetastaser i magekreftpasienter med submucosal invasjon forekommer hos 15 til 20% av pasientene; Derfor kan en lymfeknute disseksjon være unødvendig for de resterende 80 til 85% av pasientene [1]. En nøyaktig og pålitelig indikator for å forutsi fravær av lymfeknutemetastaser vil eliminere mange unødvendige lymphadenectomies [1]. Derfor er en preoperativ og nøyaktig diagnose av lymfeknutemetastaser er fortsatt viktig [2-4]. En sentinel node biopsi for magekreft er en intraoperativ diagnostisk metode for å påvise lymfeknutemetastaser [5-7]. I 1992 Morton et al. [8] innført teknikken for intraoperativ fargestoff injeksjons på stedet av melanom for å identifisere den "Sentinel" node, som er den første noden som de afferente lymfekar går inn fra tumorstedet. Miwa et al. [7, 9] ansatt denne type fargestoff kartlegging teknikk for å identifisere sentinel noder av magekreft, og rapporterte en høy positiv prediktiv verdi og nøyaktighet for sentinel node biopsi av tidlig magekreft. På den annen side, nærværet av en micrometastasis i en lymfeknute er et alvorlig problem for den kliniske anvendelse av utvalgte node biopsi for tidlig magekreft. Lymfeknutemikrometastaser har blitt funnet hos pasienter bestemt på å være node-negative ved rutinemessig histologisk undersøkelse. Tidligere etterforskere har rapportert at lymfeknutemikrometastaser kunne påvises ved hjelp av trinn seksjonering, immunhistokjemisk farging og revers transkriptase-polymerase chain reaction [10-12]. Men det har vært noen rapporter om distribusjon av mikrometastaser i både fast punkt og ikke-fast punkt noder i nodenegativ mage kreftpasienter ved rutine histologisk undersøkelse [13-15].
I denne studien har vi retrospektivt undersøkt tilstedeværelse og distribusjon av sentinel og ikke-sentinel node mikrometastaser som bruker hele serie seksjonering og immunhistokjemisk farging. Disse teknikk er de mest nøyaktige metoder for å påvise mikrometastaser i nodene slik at vi kunne avgjøre om lymfeknutemikrometastaser hadde spredd seg til sentinel lymfeknuter første.
Metoder, En sentinel lymfeknute (SLNs) biopsi for magekreft ble utført på 243 pasienter ved Institutt for Gastroenterologic kirurgi, Kanazawa universitetssykehus fra 1993 til 2002. Før sentinel node biopsi ble utført, ble skriftlig informert samtykke innhentes i samsvar med etiske normer i komiteen om menneskelig eksperimentering av Kanazawa universitetssykehus. Av disse pasientene, innrullert vi 35 som hadde en kreft som hadde invadert til submucosa eller muskularis propria og hadde ingen lymfeknutemetastase ved rutinemessig histologisk undersøkelse for denne studien. Ingen av pasientene hadde fått preoperativ kjemoterapi eller strålebehandling. Basert på den japanske Klassifisering av magekarsinom, alle 35 pasienter gjennomgikk en sentinel node biopsi fulgt av konvensjonell lymphadenectomy for back-up disseksjon [16]. Totalt 1028 lymfeknuter ble fjernet fra de 35 pasientene. Av disse 252 lymfeknuter var SLNs og den andre 776 var ikke-SLNs. Alle 252 SLNs var negative for metastaser både på intraoperativ frossen-seksjonen undersøkelse og permanent del med hematoxylin og eosin farging (H & E). De andre 776 noder var negative for metastaser på histologisk undersøkelse av H & E av flere trinn seksjonering 0.2 cm mellomrom. De clinicopathologic data ble evaluert i henhold til den japanske Klassifisering av magekreft [16]. Pasientenes egenskaper er angitt i tabell 1. For å detektere SLNs, anvendte vi intraoperativ endoskopisk lymfatisk kartlegging (IELM), som besto av en intraoperativ injeksjon av 0,2 ml 2% patent blå inn i submucosal laget ved fire steder rundt om i gastrisk karsinom via en gastroscope [9]. Fargestoffet umiddelbart dukket opp på serøse overflaten og farget lymfekar og noder [5, 9]. I denne studien ble det SLN definert som lymfeknute som farget blå 20 minutter etter injeksjonen. De lymfatiske bassenger ble definert som området inneholder farget lymfekar, og som var i stand til å deles inn i fem kategorier i henhold til retningslinjene i arteriene omgitt magen, som følger: venstre mage arterie område, rett mage arterie området, den høyre arterie gastroepiploic område, høyre arterie gastroepiploic område og den bakre gastrisk arterien område. De skåret SLNs ble sendt for frossen-seksjonen eksamen. Lymfeknutene farget med H & E på representative seksjoner ble kuttet langs planet med størst diameter som inkluderte noden hilus, og undersøkt intraoperativt for metastases.Table 1 pasienter egenskaper
Median alder (spredning)
62 (37-85)
Sex
Mann fra 23
Kvinne
12
Dybde invasjon
SM
24
MP
11
Histologisk typen
Differensiert *
18
Undifferentiated * *
17
lymfekar invasjon
Negativ
16
positiv
19
Vaskulær invasjon
Negativ
30
positiv
5
SM, submucosa; MP, muskularis propuria product: * Den differensierte type; papillær, godt og moderat differensierte rørformede adenokarsinomer
** Den udifferensiert type;. Dårlig differensiert adenokarsinom, mucinous adenokarsinom og signet-ring cell carcinoma
De resterende frosne vev var tint, og vev og ikke-SLNs ble rutinemessig kuttet på 0,2 cm mellomrom. Deretter ble de multiple seksjonert lymfeknuter og resekterte prøver fiksert i 10% formalin, behandlet gjennom gradert etanol, og innstøpt i parafin for faste deler. Lymfeknutene ble farget med H &. E og ble undersøkt ved to patologer
I denne studien ble alle resekterte lymfeknuter i snitt serielt på 25-um intervaller av 4-mikrometer tykkelse i tillegg og enten vekselvis farget med H & E og immunhistokjemisk farging (IHC) ved anvendelse av et anti-cytokeratin antistoff. Envision teknikken ble brukt (DAKO, Carpinteria, CA) for IHC og vi brukte det monoklonale anti-human cytokeratin 8/18 antistoff (Santa Cruz Biotechonology, California, USA) [17-19]. Alle hovedtumorprøver fra 35 pasienter ble underkastet cytokeratin farging og ble anvendt som en positiv kontroll. En lymfeknute micrometastasis ble definert som en node negative for metastasering av vår rutine histologisk undersøkelse, men positive ved enten IHC eller hele seriesnitt metoder.
Resultater
totale antall seksjoner undersøkt var 24 094. Av disse 5986 var SLNs og 18 108 var ikke-SLNs. Av de 35 pasienter, 4 (11%) hadde mikrometastaser. En micrometastasis ble funnet i 6 av 1028 noder (0,6%) og 60 deler (0,3%) av 24 094 (fig. 1, 2). Av disse 6 noder som involverer en micrometastasis, 4 var SLNs og den andre 2 var ikke-SLNs i lymfesystemet bassenget. Ingen mikrometastaser ble oppdaget utenfor bassenget (tabell 2). Detaljene i fordelingsmønsteret, plassering og størrelse av mikrometastaser er vist i tabellene 3, 4 og 5. Av de 4 pasienter som hadde en lymfeknute micrometastasis, 3 pasienter hadde mikrometastaser utelukkende i SLNs. Den andre pasienten hadde en micrometastasis i både SLN og ikke-SLNs i lymfesystemet bassenget. Ingen pasienter hadde en micrometastasis bare i ikke-SLNs. Ingen pasienter har ennå lidd en gjentakelse eller har dødd som i desember, 2007.Table 2 Antall og plassering av lymfeknuter med micrometastasis
Plassering av noder
Antall noder

med micrometastasis
uten micrometastasis
SLNs
4
248
ikke-SLNs i lymfesystemet bassenget
2
653
ikke-SLNs av bassenget
0
121
Alle noder
6
1022
SLNs, sentinel lymfeknuter
Tabell 3 Fordeling mønster av lymfeknute micrometastasis

Antall tilfeller
Fordeling mønster av micrometastasis
Rutine histologisk undersøkelse
komplett seriesnitt og IHC
SLNs (-), ikke-SLNs (-)
35
31
SLNs (+), ikke-SLNs (-)
0
3
SLNs (+), ikke-SLNs (+)
0
1 SLNs (-), ikke-SLNs (+)
0
0
SLNs, sentinel lymfeknuter; IHC, immunohistochemic flekker
Tabell 4 Plassering av lymfeknute micrometastasis
case
Plassering av tumor

Stained lymfatiske servanter

Antall SLNs
Antall micrometastsis
Station av micrometastasis av SLNs
Station av micrometastasis av ikke-SLNs

1 M, Mindre
Venstre GA
8
1 No.3 LN -
2
M, Post
. venstre GA Høyre GEA
5
1 No.3 LN
-.
3
M, Ant
venstre GA
2
1 No.3 LN -
4
M, Mindre
Venstre GA Høyre GEA
10
3
No.3 LN
No.3 LN
SLNs, sentinel lymfeknuter; M, Midtre tredjedel av magen; Mindre, mindre krumning; Stolpe.; posterior veggen; Maur. fremre vegg; GA, mage arterie; GEA, gastroepiploic arterien; No.3 LN, LN langs mindre kurvatur
Tabell 5 Side og størrelse på lymfeknute micrometastasis
case
Type lymfeknute

Site i lymfeknute
Størrelse micrometastasis (mm)
en
SLN
perifer sinus
1,2
2
SLN
perifer sinus
0,3
3
SLN
perifer sinus
0,2
4
SLN
perifer sinus
0,6
ikke-SLN
perifer sinus
1,0
ikke-SLN
perifer sinus
1,0
SLN, sentinel lymfeknute
Figur 1 lymfeknute mircrometastasis som oppdages ved immunhistokjemisk farging med en cytokeratin antistoff. (× 400).
Figur 2 Ingen kreftceller ble identifisert i denne delen av rutinen histologisk undersøkelse. (Hematoxylin & eosin farging, × 40). (B) lymfeknute micrometastasis i representative delen av hele serie seksjonering metode. (Immunhistokjemisk farging, x 40). (C) Micrometastasis lymfeknute i representative delen av hele serie seksjonering metode. (Immunhistokjemisk farging, × 400)
Diskusjon
Miwa et al. introduserte begrepet sentinel node biopsi for magekreft [7]. Den kliniske anvendelse av Sentinel node biopsi for å bestemme den kirurgiske metode for magekreft krever en bekreftelse på dette konseptet på nivået av lymfeknutemikrometastaser. I denne studien undersøkte vi tilstedeværelsen og fordeling av lymfeknutemikrometastaser hos pasienter med magekreft som hadde en Sentinel node biopsi. Nylig har tilstedeværelsen av lymfeknutemikrometastaser ikke målbare ved rutinemessig histologisk undersøkelse rapportert i bryst, lunge, spiserør, magesekk, tykktarm og galleblæren kreft. Det har blitt rapportert at en lymfeknute micrometastasis var en dårlig prognostisk indikator i bryst, lunge, og coloncancere [20-22]. Noen forfattere har rapportert at en lymfeknute micrometastasis var et dårlig prognostisk faktor i magekreftpasienter [23, 24]. Dermed har viktigheten av å detektere en lymfeknute micrometastasis blitt understreket av forskjellige neoplastiske sykdommer., En rekke metoder for å påvise lymfeknutemikrometastaser eksisterer, inkludert IHC og polymerasekjedereaksjon analyser. Matsumoto et al. viste at revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) er mer følsom enn IHC for påvisning av mikrometastaser [2]. Imidlertid, Yamamoto et al. [25] har foreslått at positive resultater med en molekyl analysen, slik som RT-PCR ikke kan være en indikasjon på nærvær av levedyktige tumorceller, men snarere tilstedeværelsen av tumor-DNA, og således, kan være forbundet med en sterkt øket falsk positiv hastighet til tross for høyere følsomhet av den molekylære assay. På den annen side har det blitt rapportert at de i serie seksjonering økte identifikasjon av tumorceller i de perifere bihulene av lymfeknuter [26]. Det er antatt at serie snitting med IHC er den mest nøyaktige metoden for påvisning av lymfeknutemikrometastaser. Derfor har vi utsatt hele prøven til serie seksjonering og IHC. Antistoffet som brukes for IHC ble et monoklonalt anti-human cytokeratin 8/18 antistoff som er mer følsom, spesifikk, enkel, nøyaktig og økonomisk enn andre antistoffer for IHC.
Tumorforekomster i løpet av lymfeknuter ble klassifisert og trinnvise ifølge reviderte retningslinjer fastsatt av International Union Against Cancer (UICC) 6 th Edition. Ifølge denne klassifiseringssystemet, metastaser mindre enn 0,2 cm ble vurdert mikrometastaser (MMS), og isolerte tumorceller (ITCS) var enkelttumorceller eller små klynger av celler som målte ikke større enn 0,2 mm og vanligvis ble oppdaget av IHC eller molekylære metoder , men kan verifiseres med H & E. ITCS vanligvis ikke viser tegn på metastatisk aktivitet av proliferasjon, induksjon av en stromal reaksjon, eller penetrering av vaskulære eller lymfatiske sinus vegg invasjon [27, 28]. Nakajo et al. [23] og Siewert et al. [29] rapporterte at lymfeknute engasjement er klassifisert i klynge formasjon eller enkeltcelleformer, i henhold til resultatene av IHC for cytokeratin. Deres resultater antydet at enkeltceller ikke kan spre seg i lymfeknuter, fordi de allerede var drept av lokale og generelle immunocyttene. En klynge av celler med en stromal reaksjon lett kan spre seg og derfor har metastatisk potensial. I vår avdeling er resected lymfeknuter rutinemessig kuttet på 0,2 cm mellomrom og lymfeknutene undersøkes for metastaser. Så, i denne studien, definisjonen av lymfeknute micrometastasis skilte seg fra UICC klassifisering. For denne studien ble det definert som en node, negativ for metastasering av vår rutine histologisk undersøkelse av de delene skåret 0.2 cm mellomrom, men positive ved hele serie seksjonering med H & E og IHC. I tillegg ble alle enkeltcelletyper og små klase typer uten stromal reaksjon ved cytokeratin positiv farging ikke anerkjent som kreftceller i neste H & E farget lysbilde. Dermed utelukkes vi alle enkeltceller og små klynger uten stromal reaksjon, som er klassifisert som ITCS i UICC klassifiseringssystemet, fra den positive lymfeknute micrometastasis gruppe [27, 28].
Vi ekskluderte mage kreftpasienter med tumorer hadde invadert til slimhinnen i denne studien fordi du gjør hele serie seksjonering og immunhistokjemisk farging var mye arbeid; i tillegg, frekvensen av en lymfeknute micrometastasis var lav. Følgelig vi registrert 35 som hadde en magekreft som hadde invadert til submucosa eller muskularis propria og hadde ingen bevis for en lymfeknutemetastase ved histologisk undersøkelse for denne studien.
I denne studien ble det observert en lymfeknute micrometastasis hos 4 pasienter (11%) med et magekreft som hadde invadert til submukosa eller muscularis propria. I magekreft, Isozaki et al. [30] og Natsugoe et al. [31] rapporterte at lymfeknutemikrometastaser ble identifisert i 10 til 30% av prøvene ved trinn-snitting eller IHC. Våre resultater var den mest nøyaktige av alle de siste studiene og beviste de faktiske omstendighetene lymfeknute micrometastasis av mage kreft som hadde invadert til submucosa eller muskularis propria.
I denne studien undersøkte vi de lymfeknutemikrometastaser av SLNs og ikke -SLNs. Vi fant lymfeknutemikrometastaser i SLNs av 4 pasienter. En pasient hadde også en micrometastasis i en ikke-SLN av lymfesystemet bassenget, men ingen mikrometastaser til ikke-SLNs ble identifisert utenfor bassenget. Videre ingen pasienter hadde en lymfeknute micrometastasis bare i en ikke-SLN. Våre resultater viste at pasientene som ikke har en lymfeknute micrometastasis i SLNs ikke har også en micrometastasis i de ikke-SLNs. Disse resultatene kan støtte ideen om at lymfeknute mikrometastaser spre første til SLNs, deretter til de ikke-SLNs i lymfesystemet bassenget og til slutt til ikke-SLNs utenfor bassenget. Derfor, basert på dette konseptet, er det tilstrekkelig å undersøke bare SLNs å avgjøre hvorvidt det er lymfeknutemikrometastaser hos pasienter med magekreft.
Det er fortsatt uklart om en lymfeknute micrometastasis er en prognostisk faktor i magekreft . Men en lymfeknute micrometastasis ble funnet i magekreftpasienter som ikke hadde noen bevis for en lymfeknutemetastase ved rutinefarging. Dette resultatet tyder på at vi bør forsiktig redusere omfanget av lymfeknute disseksjoner. Intraoperative Fraværet av en SLN micrometastasis antyder at graden av lymfeknute kan trygt reduseres, fordi det er lite sannsynlig for ikke-SLNs å ha mikrometastaser uten en SLN micrometastasis. I tilfelle av brystkreft, er behovet for intraoperativ diagnostisering av lymfeknutemikrometastaser ikke avgjørende, fordi ytterligere disseksjon av aksillær lymfeknuter kan utføres enkelt. Imidlertid er den etterfølgende disseksjon av lymfeknuter vanskelig i magekreft; Derfor er den intraoperativ diagnostisering av lymfeknutemikrometastaser avgjørende. Vi har antatt at når en lymfeknute micrometastasis var til stede, bør vi utføre en lymfeknute på det nåværende. Vår studie benyttet de mest nøyaktige metoder, men vi kunne ikke få de resultatene raskt nok for en itraoperative diagnose. Derfor trenger vi å etablere en nøyaktig metode for rask intraoperativ identifikasjon. Matsumoto et al. hevdet at intraoperativ rask farging var en enkel og nyttig teknikk for å påvise lymfeknutemikrometastaser [32]. En ultra-raske RT-PCR system, som kan fullføre påvisning av kreftceller innen ca 70 minutter, har blitt utviklet. I nær fremtid, vil disse metodene brukes til å påvise lymfeknutemikrometastaser i SLNs under operasjonen [33].
Konklusjon
vi har vist evne til å oppdage lymfeknutemikrometastaser ved å utsette hele prøven for å fullføre serie seksjonering og IHC for node-negative mage kreftpasienter som har hatt en sentinel node biopsi. Disse resultatene støtter ideen om at lymfeknute mikrometastaser sprer første til SLNs. I tillegg kan den intraoperativ og rask diagnose av lymfeknutemikrometastaser i SLNs bidra til å guide den aktuelle lymfeknute i magekreftpasienter. Derfor vil en rask og nøyaktig intraoperativ diagnostikk av lymfeknutemikrometastaser i SLNs være nødvendig og bør være fokus for fremtidige studier.
Erklæringer
Takk
Forfatterne er takknemlige til professor Tetsuo Ohta i Kanazawa Universitetet for dette studere. Og vi har også takket være pre-professor Koichi Miwa.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 13046_2008_7_MOESM1_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 1 13046_2008_7_MOESM2_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 2

• Kreft-assosiert fibroblaster er positivt korrelert med metastatisk potensial av humane gastriske cancere
• Long ikke-kodende RNA uttrykk profil i human magekreft og klinisk significances