PLOS ONE: Canabinóide HU210 Protege estômago de ratos isolados contra as perturbações ligadas ao soro de ratos com Experimental aguda Pancreatitis

Abstract

A pancreatite aguda (AP), pancreatite aguda especialmente grave muitas vezes provoca complicações extra-pancreáticas, como aguda lesão da mucosa gastrointestinal (AGML) que é acompanhado por uma consideravelmente elevada mortalidade, no entanto, a patogênese da AGML induzido por AP ainda não está completamente entendido. Neste relatório, nós investigamos as alterações de componentes do soro e endócrino gástrica e funções exócrinas em ratos com pancreatite aguda experimental, e estudou as possíveis contribuições dessas alterações na patogênese da AGML. Além disso, exploramos os efeitos da intervenção de agonista do receptor canabinóide HU210 e antagonista AM251 no estômago isolado e perfundido com soro de rato. Os nossos resultados mostraram que a AGML ocorreu após 5 h de replicação do AP, e a homeostase corporal foi perturbado no AP de rato, com o aumento dos níveis de enzimas pancreáticas, lipopolissacárido (LPS), citocinas proinflammtory e quimiocinas no sangue, e um desequilíbrio do gástrica função de secreção. Irrigando o estômago isolado de rato com o soro de rato AP causou alterações morfológicas no estômago, acompanhadas com um incremento significativo de pepsina e [H ^{+] lançamento, e aumento da gastrina e diminuição da secreção de somatostatina. HU210 inverteu as alterações patológicas de rato AP-induzida por soro, incluindo a reversão de transformação da morfologia gástrico para certo grau. Os resultados deste estudo provar que as respostas inflamatórias e o desequilíbrio da secreção gástrica, durante o desenvolvimento de AP são responsáveis ​​pela patogénese da AGML, e sugerem o potencial terapêutico do HU210 para AGML associada a pancreatite aguda.}

citação: Cao MH, Li Yy, Xu J, Feng Yj, Lin Xh, Li K, et al. (2012) Canabinóide HU210 Protege estômago de ratos isolados contra as perturbações ligadas ao soro de ratos com Experimental Pancreatite Aguda. PLoS ONE 7 (12): e52921. doi: 10.1371 /journal.pone.0052921

editor: Vinod K. Yaragudri, Nathan Kline Instituto de Pesquisa Psiquiátrica e da Nova School of Medicine York, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de maio, 2012; Aceito: 21 de novembro de 2012; Publicação: 28 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Cao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (Grant No. 81270477 e 81141050 com o Dr. Yong-yu Li). http://www.nsfc.gov.cn/. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a pancreatite aguda (AP), AP especialmente grave, é uma doença inflamatória potencialmente letal de pâncreas, que muitas vezes leva a complicações extra-pancreático, mesmo disfunção de múltiplos órgãos sistêmicos. Tem sido relatado que 52% dos doentes com pancreatite aguda desenvolver lesão aguda da mucosa gastrointestinal (AGML) ou úlcera de stress [1], [2]. Embora a observação endoscópica mostra que a maioria dos indivíduos só tem múltiplas erosões superficiais no trato gastrointestinal, a intervenção farmacológica ideal continua a ser uma questão de debate, e a patogênese da AGML permanece obscuro.

Alguns investigadores relatam que a condição stressante com pancreatite aguda faz com que o fornecimento de sangue diminuída ou hipoperfusão na mucosa gástrica, e o contra-difusão de iões de hidrogénio gástrica (H ^{+) é um factor importante para AGML assim [3], [4]. Outras investigações descoberto que o fluido de soro e ascítico de pacientes com AP e animais experimentais continham uma grande quantidade de substâncias tóxicas, tais como enzimas pancreáticas, endotoxinas, mediadores inflamatórios [5], [6], o que pode contribuir para a disfunção de múltiplos órgãos em aguda pancreatite [7], [8].}

Durante séculos, cannabis planta e seus extractos têm sido utilizados para aliviar os sintomas de doenças inflamatórias gastrointestinais. Foi estabelecido que a D ^{9-tetra-hidrocanabinol, o principal componente psicoactiva de cannabis, exerce a sua acção celular primário embora dois receptores acoplados à proteína G, canabinóides 1 (CB1) e canabinóides 2 receptores (CB2) [9] - [ ,,,0],11]. Desde então, estes dois receptores têm sido reconhecidos como os principais reguladores dos processos fisiológicos e patológicos [12]. Canabinóides pode reduzir a secreção gastrointestinal [13], e a ativação do receptor CB1 exibe papel protetor contra AGML induzida por estresse [14], [15], mas os mecanismos da sua acção são ainda imperceptíveis.}

O objetivo do presente trabalho foi o de explorar, por tanto in vivo e in vitro, as mudanças nos componentes do soro, as alterações das funções endócrinas e exócrinas gástricas em modelo AP rato, e as possíveis contribuições destas alterações na patogênese da AGML. Também foram sondados os efeitos de intervenção de CB1 usando seu HU210 agonista e antagonista AM251, em um esforço para melhor elucidar os mecanismos fisiopatológicos da AGML AP-associados e os potenciais antiúlcera desses agentes canabinóides.

Materiais e Métodos

Animais

ratos Sprague-Dawley (220-250 g) foram obtidos a partir do Centro Experimental animal da Universidade Fudan, de Xangai, China. Antes das experiências, todos os animais foram alojados durante 1 semana sob condições padrão com acesso livre a água e comida de laboratório. Todos os procedimentos experimentais abaixo estavam de acordo com as diretrizes internacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pela Comissão de Ética animal da Universidade de Tongji, Shanghai, China.

A indução de pancreatite aguda em ratos

Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: AP eo grupo-operação simulada com 24 animais em cada grupo. Os ratos foram mantidos em jejum durante a noite com apenas água permitido antes da cirurgia. AP modelo foi induzido pelo método desenvolvido por Aho et al [16]. Resumidamente, os ratos tem laparotomia (~ 3 cm abdominal-incisão na linha média), seguindo o procedimento padrão assépticas e sob anestesia geral, com injecção intraperitoneal de carbamato de etilo de 20% a 10 mL /kg. O ducto biliopancreatic foi temporariamente ocluída no hilo do fígado com uma multa de fixação suave microvascular para evitar o refluxo do material infundido para o fígado. Uma injecção retrógrada de 3% de desoxicolato de sódio para dentro da conduta de biliopancreatic foi então realizada (0,1 ml /100 g de peso corporal). O grampo foi removido após a injecção. Sham-operação foi realizada em conformidade, sem a injeção de desoxicolato de sódio, ea cirurgia foi concluída com o fechamento estratificada abdominal. Na quinta hora após a cirurgia, o sangue foi coletado da punção da aorta abdominal, sob anestesia. Todas as amostras de sangue foram centrifugadas e o fluido sobrenadante (soro) foi recolhido, dividido em alíquotas, e armazenadas a -20 ° C para aplicações subsequentes. O pâncreas foi removido, dividido em duas partes, e uma parte foi colocada em Trizol imediatamente e armazenar a -20 ° C para análise GeneChip, enquanto a outra parte foi fixada com 10% de paraformaldeído. O estômago também foi removido, aberto ao longo da grande curva, e fixadas com 10% de paraformaldeído para subsequente análise patológica.

histológica Avaliação

A avaliação histológica foi realizada em pâncreas de ratos e estômago, que foram fixados em 10% de paraf ormaldeido e embebidas em parafina. Em seguida, 5 mm de espessura foram cortadas num micrótomo Leica RM2126 (Leica, Xangai, China) e coradas com hematoxilina (0,5%) e eosina (0,5%), seguido por observação sob um microscópio Motic BA300 (Motic China Group Co. Ltd. ., Xiamen, China). Pontuação histológica foi avaliada em secções pancreáticas utilizando um critério modificado de Nathan JD, et ai [17]. A avaliação foi feita em dez campos microscópicos escolhidos aleatoriamente de lâminas de cada animal, e repetida em três ratos /grupo de uma forma cega. E a pontuação histológica total (0-9) foi expressa como a soma de edema (0-3), infiltração de células inflamatórias (0-3), e necrose do tecido (0-3).

Microarray Hybridization Assay

Microarray Analysis foi usada para identificar perfis de transcrição de alguns índices inflamatórias no pâncreas de ratos com pancreatite aguda. hibridações de matriz foi realizada utilizando três réplicas biológicas de amostras de RNA extraídas a partir do pâncreas de ratos de controlo e de AP. preparação da sonda, hibridação de chip, e análise de dados primários foram realizadas por Capital Bio Corporation (uma empresa licenciada e autorizada pela Affymetrix para operar em Beijing, China). Arrays foram escaneados usando o Genechip Scanner 3000 7G (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). A análise quantitativa foi realizada utilizando Affymetric MicroArray Suíte Termos 5.0-específicas (Statistical Algoritmos) GCOS (Affymetrix GeneChip Operating Software) Versão 1.4. Os genes expressos diferencialmente foram identificados usando o software SAM (Análise significativo de microarray), e seleccionados com base nas suas variações de dobragem (> 2 vezes) em comparação com as amostras de controlo

Análise Imunohistoquímica
.

coloração imuno-histoquímica em secções de parafina de estômago de rato e pâncreas foram realizadas utilizando anticorpos policlonais de coelho anti-CB1 e CB2 anticorpos anti-(Cat. no: ALX-210-314 para anti-CB1 e Cat. no: ALX-210-315 para anti-CB2, Enzo, Plymouth Meeting, PA, EUA) como descrito anteriormente [18]. As lâminas com secções de estômago de rato e pâncreas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anti-anticorpos anti-CB1 CB2 ou, e o anticorpo de cabra anti-coelho marcado com biotina IgG de fluido de trabalho (Cat. No: SP0023; Biossíntese Biotecnologia Co. Ltd ., Pequim, China), em seguida, foi aplicado sobre cada lâmina e incubaram-se a 37 ° C durante 15 minutos, seguido por incubação com uma solução de trabalho de estreptavidina marcada com HRP a 37 ° C durante 15 minutos, e as lâminas foram enxaguadas completamente. Finalmente, as lâminas foram coradas e DAB-nuclear re-corados com hematoxilina. As lâminas de controlo negativo foram processados ​​através dos passos idênticos, mas o anticorpo primário foi substituído com PBS. A análise das imagens foi realizada utilizando imagem 6,0 sistema de análise Motic Med digital. (Motic; China Group Co. Ltd., Xiamen, China)

Western Blotting para medir CB1 e CB2 Expressão

CB1 e CB2 a expressão da proteína no pâncreas e estômago foram avaliadas por transferência de western. Tal como descrito anteriormente [19], após a incubação com os anticorpos primários em um (policlonal de coelho diluição 1:250 individualmente anti-CB1 e anticorpos anti-CB2, Cat. No:. ALX-210-314 para anti-CB1 e gato NO: ALX-210-315 para anti-CB2, Enzo, Plymouth Meeting, PA, EUA), as membranas de nitrocelulose Blotted (Whatman, Dassel, Alemanha) foram enxaguadas completamente, e o anticorpo secundário apropriado conjugado com peroxidase de rábano foi incubada durante 1 hr a temperatura do quarto. Para referência interna, foi utilizado anticorpo de coelho policlonal anti-rato β-actina (1:2,000 diluição) (Abmart, Xangai, China). Finalmente, a ligação do anticorpo foi detectada pela exposição a ECL reagentes de detecção de mancha Western (Cat. No: SC-2048, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) e gravadas em filme

Preparação de Isolated- vascularmente. perfundido do estômago do rato

de rato foi anestesiado e o estômago isolado de rato, perfundido vascularmente foi preparado como descrito anteriormente [20]. Resumidamente, o abdómen foi aberto com uma incisão na linha média em condições estéreis. Após a ligação da aorta abdominal logo acima da ramificação da artéria celíaca, uma cânula foi inserida na artéria celíaca colocado através de uma incisão na aorta. Dois mililitros de solução salina contendo 600 U de heparina foram depois injectados na artéria gástrica através da cânula arterial. Subsequentemente, um quente (37 ° C) modificada solução de Krebs-Ringer borbulhar com uma mistura de 95% de O _{2 e 5% de CO 2 foi introduzido. O efluente venoso foi recolhido através de uma cânula na veia portal. Um tubo de polietileno para perfusato lúmen gástrico foi inserido no esófago e a ponta posicionada na porção luminal do estômago. Depois disso, a junção piloroduodenal foi exposta, e um outro tubo de polietileno foi introduzida no estômago através de uma incisão no duodeno, e em seguida, fixo por uma ligadura em torno do piloro. O estômago de ratos perfundidos foi isolado e colocado em uma pequena câmara quente (37 ° C) com uma solução de Krebs-Ringer.}

Tratamento do isolado de rato estômago

O estômago isolado foi vascularmente perfundidos com modificado solução de Krebs-Ringer durante 30 min de equilibração antes das experiências formais. A perfusão foi então levada a cabo sequencialmente com três fluidos e cada fluido durante 20 minutos, num total de 60 minutos. O grupo controle recebeu: 1) solução de Krebs-Ringer, 2) soro de ratos de controlo normais, 3) solução de Krebs-Ringer. O grupo AP tenho: 1) Krebs-Ringer solução, 2) soro de ratos AP, 3) solução de Krebs-Ringer. O grupo de AP + HU tem: 1) solução de Krebs-Ringer + HU210 (10 ^{-7M), 2) soro AP + HU210 (10 -7M), 3) solução de Krebs-Ringer. E o grupo de AP + AM tenho:, 2) soro AP + AM251 (10 -7M), 3) solução de Krebs-Ringer 1) solução de Krebs-Ringer + AM251 (10 -7M). Os lúmen gástrico do estômago isolado foi perfundido com solução salina normal (pH 7,0). Todos os fluidos de perfusão funcionou a uma velocidade constante de 1 mL /min usando bombas micro-infusão. Enquanto isso, as soluções e os órgãos isolados foram mantidos a 37 ° C por unidades termostaticamente controlada em toda a experiência. As amostras de efluente venoso ou de efluente lúmen gástrico foram recolhidas, no final de cada 20 minutos, em tubos de ensaio que foram refrigerados imediatamente armazenados a -80 ° C para experiências de medição subsequentes.}

amilase e lipopolissacárido Níveis

os ensaios de lipopolissacarídeo níveis (LPS) no soro de AP ou de controle de ratos amilase e foram realizadas com base no fabricante recomendou procedimentos (Cat no: C016 para kit de ensaio amilase, Jiancheng Tecnologia, Nanjing, China; e. . Cat. No: CE32545 para kit de ensaio LPS, chinês Límulo Reagente Co. Ltd., Xiamen, China)

Os ensaios para mediadores inflamatórios

Os níveis de interleucina-6 (IL-6 ) e induzida por citocinas de neutrófilos quimioatractor 1 (CINC1 /KC) no soro de ratos e no efluente venoso a partir do estômago isolado de rato foram quantificados usando a kits de KC de ELISA de IL-6 e de rato com base no fabricante recomenda protocolos (Cat. nenhuma : F01731D para interleucina rato 6 kits ELISA; Cat. no: F01723D para ratos kits KC ELISA. H-Y Biológica Co. Ltd., Shanghai, China). A densidade óptica foi determinada a 490 nm para absorvância num instrumento de ensaio de imunossorvente ligado a enzima (Leitor de Microplacas, Modelo Elx800; BioTek, Winooski, VT, EUA). Cada amostra foi medida três vezes e a medição foi repetido em 6 amostras de rato de cada grupo. Os dados no efluente venoso a partir do estômago de rato isolado foi apresentado com a diferença de IL-6 ou KC nível entre a perfusão e o efluente, sendo considerada como a libertação de IL-6 e KC do estômago do rato.

gastrina e somatostatina níveis de espécimes animais

a gastrina e os níveis de somatostatina no soro dos animais e no efluente venoso estômago isolado foram medidos usando gastrina e somatostatina Kits de radioimunoensaio comercialmente disponíveis (gastrina Kit: Cat. No. G01PJB , Norte Instituto de Tecnologia biológica, Beijing, China somatostatina Kit:. Cat. No. S111013, segunda Universidade médica Militar, Xangai, China). procedimentos de medição foram baseadas em recomendações dos fabricantes como descrito anteriormente [21]. Como o mesmo que acima, cada amostra foi medida três vezes e a medição foi repetido em 6 amostras de rato de cada grupo. Os dados no efluente venoso a partir do estômago isolado de rato foi apresentada com as diferenças de gastrina ou de somatostatina nível entre a perfusão e o efluente, sendo considerada como a libertação de somatostatina e gastrina do estômago do rato.

e pepsina H + níveis de animal espécimes

os ensaios de nível pepsina no suco gástrico de ratos e no efluente lúmen gástrico do estômago isolado de rato foram realizadas com o fabricante recomenda protocolos (Cat. No. A081- 1, Jiancheng Tecnologia, Nanjing, China), como [H ^{+] nestas amostras foram medidos por delta 320 medidor de pH (Mettler-Toledo Inc. Zurique, Suíça) e as leituras foram então convertidos em [H +].}

Solutions and Chemicals

HU210 [(6aR) -trans-3- (1,1-dimetil-heptil) -6a, 7,10,10a-tetra-hidro-1-hidroxi -6,6-dimetil-6H-dibenzo [b, d] piran-9-metanol], AM251 [(N- (piperidin-1-il) -5- (4-iodofenil) -1- (2,4- diclorofenil) - 4-metil-1H-pirazole-3-carboxamida)], foram adquiridos a partir de Tocris (Tocris-Bioscience, Ellisville, MO, EUA). Ambos os produtos químicos foram dissolvidos num solvente consistiu de etanol, Tween 80 e solução salina normal (NS), relação de volume 01:01:18, com a concentração de 10 ^{-2m, a 37 ° C utilizando um ultrasonicator, e, em seguida, foram ainda diluídas em NS a 10 -5 M, e novamente a 10 -7M com líquido de perfusão imediatamente antes da utilização, nas condições que foram determinados em estudo piloto [22]. A solução de Krebs-Ringer modificado foi composto por NaCl 117,5 mM, KCl 4,7 mM, CaCl 2,4 mM _{2, MgCl 1,1 mM 2, NaH 1,1 mM 2 PO? 4, NaHCO 25 mM 3, 11,1 mM de glucose, 0,05% de albumina de soro bovino e 4% de dextrano. Outros agentes, se as fontes não foram mencionadas acima, foram adquiridos de Sigma (Xangai, China).}}

Análise de Dados

Todos os dados são expressos como média ± SEM. do teste t de Student ou análise de fator único de variância (ANOVA) foi realizada utilizando o software SPSS 13.0 (SPSS Co. Ltd., Shanghai, China). Os valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

Os resultados do Experimento In Vivo

As alterações patológicas do pâncreas de ratos AP. .

Sob microscopia de luz, era evidente que após o tratamento com taurocolato de sódio, os ratos desenvolveram pancreatite aguda grave, com edema óbvio, vacuolização e necroses graves nas células acinares pancreáticas dos tecidos. E as pontuações histológicas em ratos AP eram muito superiores aos dos ratos de controlo (Fig. 1). Combinado com o aumento do nível de atividade da amilase no soro de ratos AP, os resultados demonstraram que a replicação do modelo AP em ratos foi bem sucedida.

As alterações patológicas no estômago de ratos ap.

o estômago dos ratos com pancreatite aguda, alterações patológicas graves emergiu, apresentando edema da mucosa, da erosão e hemorragias como demonstrado tanto por Macrografia (Fig 2A e 2B.) e exames microscópicos (Fig. 2D); e congregadas estas lesões principalmente no antro gástrico.

análise GeneChip.

Como se mostra na Fig. 3A, os diagramas de dispersão representado com genes de duas vezes e superior expressão estavam no limite superior (vermelho), enquanto que os genes com dupla e expressão menor no (verde) limite inferior; e os genes alterados estreitamente ligadas à pancreatite aguda foram mostrados nos padrões de agrupamento (Fig. 3b). Era óbvio que no perfil de expressão, os genes com diferencial significativamente expressões (≥2 vezes, P < 0,05) são principalmente aqueles que foram relacionados com as enzimas digestivas do pâncreas, mediadores inflamatórios e as vias de transdução de sinal, que foram escolhidos e listados com seu nome Gene e Genebank ID na Tabela 1.

Alterações de IL-6, KC e LPS no soro AP.

Ambos os níveis de IL-6 e KC no soro de AP ratos exibida aumentos significativos em comparação com os dos ratos de controlo, com irrupções de 145% e 186%, respectivamente (P < 0,05; Fig. 4). Um aumento similar mas mais proeminente foi observado no nível de LPS no soro de ratos AP, com um aumento tanto como 231 vezes do que a do grupo de controlo (P < 0,01; Fig. 4A)

altera. de níveis de gastrina e somatostatina no soro de ratos AP.

no soro de ratos PA, os níveis de gastrina e de somatostatina aumentada significativamente em comparação com os dos ratos de controlo, com irrupções de 169% e 147%, respectivamente ( em ambos os casos, P < 0,05;. a Fig. 4B)

as alterações dos níveis de pepsina e [H ^{+] no suco gástrico de ratos AP}

Para avaliar as mudanças de gástrico. função exócrina, os ensaios para o nível de pepsina e [H ^{+] foram realizadas utilizando o suco gástrico de ratos AP e controle. Tanto a nível pepsina e [H +] no suco gástrico mostrou um aumento distinto em ratos AP, em comparação com aqueles de ratos de controlo, com irrupções de 177% e 347%, respectivamente (Fig. 4C).}

a expressão de CB1 e CB2 no pâncreas de ratos e estômago.

As características de expressão de CB1 e CB2 em pâncreas de ratos e estômago foram investigados. Os resultados demonstraram que os espécimes de animais do grupo controle apresentou um fraco nível de coloração imuno para CB1 e CB2 no pâncreas, ao passo que as amostras de ratos AP tinha exibiu aumento expressões de CB1 e CB2. Principalmente, os fortes sinais positivos de tingimento marrom agrupados no acini pancreática (setas Fig. 5 A). A UP-regulamentos de receptores CB1 e CB2 em tecidos pancreáticos de ratos AP foram adicionalmente demonstrada por análise de Western blot e na Fig.5 apresentado B. As características de expressão semelhantes de CB1 e CB2, também foram encontrados no estômago dos ratos AP , tal como demonstrado tanto por coloração imuno-histológica e ensaio western blot (Fig. 5 C e D 5). As fortes sinais positivos de tingimento marrom eram principalmente na mucosa gástrica (Fig. 5 C, pontas de seta).

Os resultados do Experimento In Vitro

Efeito de canabinóides sobre gástrica alterações patológicas e de gastrina e somatostatina liberação.

Para investigar o efeito de CB1 agonista do receptor HU210 sobre a função endócrina do estômago isolado de rato estimulados com soro de rato AP, nós examinamos as alterações de níveis de gastrina e somatostatina na efluente venoso do estômago, com ou sem a intervenção de receptor CB1 HU210 agonista e antagonista AM251. Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo de controlo, o estômago de ratos tratados com soro AP provocou um aumento da libertação de gastrina (P < 0,05), mas uma libertação diminuída de somatostatina (P < 0,05), HU210 reverteu os gastrina e somatostatina alterações induzidas pelo soro de ratos AP (P < 0,05) (Fig. 6)., enquanto AM251 não apresentam impacto detectável sobre a liberação dos dois hormônios

Efeitos de canabinóides sobre a actividade da pepsina e [H ^{+] no efluente lúmen gástrico.}

os efeitos dos agentes HU210 e AM251 sobre a actividade da pepsina e [H ^{+] no efluente lúmen gástrico do estômago isolado de rato foram apresentados na Fig. 7. Em comparação com os homólogos do grupo de controlo, soro AP estimulou a secreção de pepsina e produção de ácido no estômago isolado de rato (P < 0,05). A intervenção de CB1 /2 agonista do receptor HU210 atenua as alterações induzidas pelo soro de AP de secreção de pepsina e a produção de ácido (p < 0,05)., Enquanto o antagonista do receptor AM251 não exibiram efeito óbvio sobre estes dois parâmetros}

Efeitos de canabinóides sobre os níveis de IL-6 e KC no efluente venoso gástrica de ratos.

Depois de os ratos receberam o tratamento do soro de PA, os níveis de IL-6 e KC significativamente elevados no efluente venoso a partir da rat estômago isolado; HU210 inverteu as alterações IL-6 e KC induzidas pelo soro de ratos AP (P < 0,05)., Enquanto AM251 teve nenhum impacto detectável sobre os níveis da citoquina e quimioquina no efluente venoso (Fig. 8)

Discussão

Na clínica, os pacientes com pancreatite aguda, especialmente com pancreatite aguda grave, muitas vezes sofrem AGML ou úlcera stress, uma complicação comum da AP. Os factores causadores de lesões de estômago incluem, mas não se limitando a, o stress da estimulação inflamatória que pode induzir a activação do sistema de medula lócus ceruleus-norepinefrina /simpático-supra-renal e do sistema de córtex hipotálamo-hipófise-adrenal. Os aumentos secretos de catecolaminas e hormônios glicocorticóides são os fatores mais importantes de estresse do corpo, para esses componentes provocam ácido gástrico hiper-secreção e deslocando-o fluxo de sangue que causam isquemia da mucosa gastrointestinal. Importante, a isquemia sequencialmente degrada a capacidade da mucosa gástrica de dispor de um ácido de difusão de volta, resultando numa diminuição do pH intramural e a activação de protease e subsequente ulceração [3], [4], [23]. Outros mecanismos, incluindo os radicais livres derivados de oxigénio e alguns fatores incertos, também desempenham um papel na lesão gastrointestinal relacionada com pancreatite aguda.

investigações anteriores descobriram que AP plasma e líquido de ascite relacionados com a AP contêm uma grande quantidade de substâncias tóxicas que são prejudiciais ao organismo [5], [6], [8], fazendo com que o dano do fígado, do rim, do pulmão e do sistema circulatório, e disfunção gastrointestinal, etc. [24] - [28]. Nosso estudo anterior descobriu que as células pancreáticas acinar sofreu sobrecarga de cálcio e vitalidade reduzida, como sendo incubadas com AP soro ou líquido de ascite [8]. Neste estudo, foram primeiro induzida experimentalmente em ratos e AP demonstrou a indução de modelo animal AP foi bem-sucedida, demonstrando a alteração patológica da morfologia do pâncreas e do aumento de enzima pancreática no soro de ratos após a indução. Após a afirmação do modelo, continuamos a estabelecer um perfil de expressão gênica para ilustrar a expressão do gene alterado de enzimas pancreáticas e mediadores inflamatórios, em uma tentativa de rastrear os genes sublinhar que desempenharam papéis mais importantes na patogênese da AGML associada à AP. E os resultados a partir de ratos de controlo e AP perfilado usando análise gene chip foram consistentes com os dos ensaios bioquímicos. Além disso, testamos se houvesse efeitos benéficos dos antagonistas canabinóides e /ou agonistas em animais com pancreatite aguda experimental.

Com base nos resultados acima mencionados, que abordou a questão de saber se a secreção gástrica, tanto o sistema endócrino ou exócrina funções, seria alterado em ratos AP. Sabe-se que a gastrina estimula a produção de ácido e pepsina secreção, como somatostatina neutraliza os efeitos da gastrina. Quando gastrina ou secreção de somatostatina não consegue manter um equilíbrio básico, a pepsina excedente e liberação de ácido desproporcionalmente, resultando em danos e disfunções do estômago durante a pancreatite aguda. Como demonstrado no presente relatório, encontramos um nível significativamente levantada gastrina no soro, e os níveis de pepsina e ácido elevadas no suco gástrico de ratos AP, que confirmaram que as funções endócrinas e exócrinas do estômago foram perturbados no modelo AP.

além disso, as enzimas circulantes activados proteoliticas, proteínas vasoactivas e endotoxina específicos para a patogénese de pancreatite aguda podem ser responsáveis ​​por AGML bem. Por conseguinte, temos explorado os efeitos do soro de ratos AP, na ratazana estômago isolado e perfundido de tal modo que o órgão pode ignorar o stress sistémica e impactos. O estômago de rato isolado estimulado pelo soro de AP rato não só mostrou a lesão da mucosa ocular visível, mas também apresentou uma série de alterações bioquímicas, incluindo níveis mais elevados de gastrina, citocina IL-6, quimiocina KC, e menor nível de somatostatina no efluente gástrico venoso, bem como a pepsina levantada e a produção de ácido no efluente lúmen gástrico. É razoável inferir que há um desequilíbrio entre o factor agressivo e o factor de protecção da mucosa gástrica durante a pancreatite aguda. Em particular, o aumento da gastrina, a produção do ácido gástrico e da pepsina jogar em conjunto papéis importantes na patogénese da AGML, agravando o dano do estômago e desencadeando círculos viciosos durante a pancreatite aguda.

Durante a última década, um número de publicações revelaram os efeitos anti-inflamatórios dos canabinoides [29] - [32]. Vários estudos têm mostrado que os canabinóides inibem a secreção de ácido gástrico e reduzir as citocinas inflamatórias e de outro mediador no plasma de animais com PA [33], [34]. Os nossos resultados não só confirmam estas descobertas anteriores, mas também demonstram que um HU210 química, presumivelmente, um agonista do receptor de canabinóide, servem funções da mesma maneira como canabinóides na redução das citocinas inflamatórias e de outros mediadores, por conseguinte, melhorar os sintomas de AGML AP-associado. Curiosamente, os resultados deste estudo demonstram que HU210 pode atenuar os endócrinas e exócrinas alterações gástricas no estômago isolado de rato irritado com soro AP, inverter os níveis anormalmente inflados de gastrina, ácido gástrico e da pepsina e abafar o efeito desses factores prejudiciais. Por outro lado, HU210 eleva o nível de somatostatina que inibe a secreção de gastrina e ácido gástrico, exerce, portanto, ação protetora sobre a mucosa gástrica.

Os resultados do estudo fornecem a coerência harmônica de análise do gene-chip e bioquímica os dados do ensaio utilizando amostras a partir do modelo animal, o que sugere um mecanismo novo que o início da AGML é, pelo menos em parte, devido à gastrina e /ácido desequilíbrio somatostatina gástrica provocada pelas toxinas no soro AP; e agonista canabinóide HU210 restaura o equilíbrio, portanto, a protecção. Os resultados suportam que HU210 é benéfico para o tratamento de pancreatite aguda, devido à sua função de anti-inflamação e o efeito de prevenção na AGML relacionada com pancreatite aguda. Os resultados que o antagonista do receptor CB1 AM251 deixa de desempenhar qualquer papel no suporte de lesões gástricas induzidas AP nossa postulação, confirmando os papéis positivos de receptores CB1 /2.

Em um experimento prospectivo para investigar se os inibidores da bomba de protões (PPIs) podem proteger os animais com pancreatite aguda experimental, que o omeprazole administrada (OME, ip, 40 mg /kg de peso), um agente de PPI representativo, a um grupo de ratos, ao mesmo tempo, quando a indução de AP foi realizada. Os resultados preliminares mostraram que a OME aumentou a taxa de sobrevivência de ratos AP (dados não mostrados). No entanto, pode ser necessário estudo multicêntrico para elucidar se PPIs são benéficos como uma opção terapêutica em pancreatite aguda dos seres humanos.

Tomando todos os acima, os resultados da nossa investigação experimental mostram que as respostas inflamatórias e os distúrbios do gástrica funções de secreção, tanto a endócrinas e exócrinas, são os resultados de pancreatite aguda, e eles por sua vez, contribuem para a patogênese da AGML. Além disso, os resultados sugerem que HU210 canabinóide, o agonista do receptor de CB1 /2, tem o potencial terapêutico para AGML na pancreatite aguda por meio da atenuação inflamação e restaurar gastrina /somatostatina equilíbrio, e, em seguida, a diminuição da secreção de ácido gástrico e da pepsina.

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