a expressão da proteína DNA polymeraseη prediz resposta ao tratamento e sobrevivência de doentes com adenocarcinoma gástrico metastático tratados com quimioterapia baseada em oxaliplatina

a expressão da proteína polymeraseη DNA prevê a resposta ao tratamento e sobrevida dos pacientes de adenocarcinoma gástrico metastático tratados com quimioterapia baseada em oxaliplatina
DNA polimerase η Abstract
Fundo
(η pol) é capaz de contornar adutos de DNA produzidos pela cisplatina ou oxaliplatina e está associado com a tolerância celular de platina. Estudos anteriores mostraram que defeituoso η POL cisplatina resultou em sensibilidade aumentada ou oxaliplatina em algumas linhas celulares. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel da expressão da proteína η pol no adenocarcinoma gástrico metastático.
Métodos
Quatro linhas celulares de adenocarcinoma gástrico foram escolhidos para explorar a relação entre a expressão da proteína pol η e sensibilidade oxaliplatin por western blot e o ensaio de MTT. Oitenta doentes com adenocarcinoma gástrico metastizado tratados com um regime de FOLFOX ou XELOX como quimioterapia de primeira linha foram analisados, foram usadas para detectar a expressão da proteína POL η por imuno-histoquímica de tecidos tumorais embebidos em parafina fixadas em formalina de pré-tratamento correspondente. foi analisada relação entre a expressão da proteína pol η e características clínicas e evolução desses pacientes.
Resultados
uma relação linear positiva entre a expressão da proteína pol η e 48 valores h IC50 de oxaliplatina em quatro linhas celulares de cancro gástrico foi observada. Positividade da expressão da proteína pol η foi fortemente associado com má resposta ao tratamento, bem como menor sobrevida em ambas as univariadas (8 versus 14 meses; P < 0,001) e multivariada (hazard ratio, 4,555; 95% intervalo de confiança, 2,461-8,429; P <. Conclusões 0,001) análise em oitenta pacientes de adenocarcinoma gástrico metastizado
Nosso estudo indica que polη é um fator preditivo de resposta ao tratamento e sobrevivência de doentes com adenocarcinoma gástrico metastático tratados com FOLFOX ou XELOX, como quimioterapia de primeira linha. Portanto confirmando o valor da polη em estudos com desenho prospectivo é obrigatória.
Fundo
O câncer de estômago é o quarto tipo de câncer mais comum no mundo, com 603,003 novos casos entre homens e 330,290 novos casos entre as mulheres por ano [1]. É a segunda causa mais comum de cancro morte relacionada (700.000 mortes por ano), com quase dois terços dos casos ocorrem em países em desenvolvimento e 42% só na China [2]. A cirurgia continua a ser o principal método potencial de curar a doença; No entanto, aproximadamente 84% dos pacientes com câncer gástrico irá desenvolver para ser uma doença avançada, com 30% dos casos localmente avançados, 30% doenças metastáticas no momento do diagnóstico, e doenças de 24% de recorrência [3]. A literatura mostrou que a sobrevida média foi de apenas 3-4 meses entre pacientes com câncer gástrico avançado sem quimioterapia. A nova geração de agentes quimioterapêuticos, tais como oxaliplatina, pode prolongar a sobrevivência no cancro gástrico avançado a ser de 10 a 12 meses; Além disso, a quimioterapia pode também melhorar a qualidade de vida [4-12]. efeito terapêutico depende principalmente da resposta de drogas para tumores durante a quimioterapia de primeira linha, porque até agora apenas uma fase pequeno estudo III, com 120 casos mostrou um benefício modesto sobrevivência da monoterapia irinotecan sobre cuidados de suporte sozinho [13]. Infelizmente, devido à resistência aos medicamentos, as taxas de resposta única 30-50% pode ser alcançado, apesar de administrar novos medicamentos geração, como o docetaxel, oxaliplatina, capecitabina, irinotecano, S1, etc para pacientes com câncer gástrico avançado como tratamento de primeira linha [3]. Isso significa que pelo menos 50% dos pacientes que se submeter a tratamento ineficaz, o que pode não só diminuir a qualidade de vida dos pacientes, mas também aumentar a carga econômica. Então, como para prever a resposta dos agentes de quimioterapia no cancro gástrico é uma questão científica muito importante.
Oxaliplatina é o de platina de terceira geração, desempenhando um papel vital na quimioterapia para o câncer gastrointestinal. regime de combinação à base de oxaliplatina como oxaliplatina mais 5-FU ou drogas 5-FU-como tem sido comprovada para ser ativo em cerca de 40-50% dos pacientes com câncer gástrico avançado [14-16]. Oxaliplatina e cisplatina compartilham o mecanismo semelhante, e causar mono-adutos e ligações cruzadas intra-cadeia ou inter-cadeia na hélice dupla de DNA que bloqueiam severamente a síntese de DNA [17-19]. Quando isso acontece, algumas vias de reparo de DNA danos podem ligar, incluindo a reparação por excisão de nucleotídeos (NER), reparo mismatch (MR), recombinação homóloga (HR), a síntese de DNA translesão (TLS) [20]. Estes reparos aduto ocorrem principalmente através de NER [21]. TLS é uma outra forma alternativa para reparar estas lesões, que é feito principalmente por ADN-polimerases η [22]. Polymeraseη (Polη), uma das enzimas-replicante lesão, incorpora o nucleotídeo correta sobre lesões, como um aduto de platina por TLS e continua alongamento da cadeia, enquanto pols clássica não pode [23]. Polη tem a maior eficácia de contornar Pt-GG diaductos intra-cadeia causadas por platina entre estas enzimas-replicante lesão, com fidelidade limitada [23, 24]. Experiências recentes têm mostrado que a ausência de resultados polη num aumento estatisticamente significativo na sensibilidade cisplatina quando se comparam os fibroblastos humanos xeroderma pigmentoso-variantes polη-nulo com aquelas que expressam polη [25]. Este reforço é também observada quando as células foram tratadas com carboplatina e oxaliplatina [25]. Dados recentes mostram que o nível de mRNA polη negativamente correlacionada com a sensibilidade cisplatina de câncer não pequenas células (CPNPC) linhas de células [26].
No presente estudo, relatamos pela primeira vez a relação entre a expressão da proteína polη e sensibilidade oxaliplatin de linhas celulares de cancro gástrico e o significado do que na previsão de resposta ao tratamento e sobrevivência de doentes com cancro gástrico metastático tratados com quimioterapia baseada em oxaliplatina.
Materiais e métodos
as linhas celulares in the linhas celulares de cancro gástrico, incluindo SGC7901 , AGS, MKN45 e MGC803, foram doados pelo Professor Libing Canção do Estado Key Laboratório de Oncologia no sul da China (Centro de Câncer da Sun ainda-sen University). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco), excepto MKN 45 com 20% de soro fetal de bovino.
Pacientes e amostras
Pacientes em nossa base de dados clínicos com quimioterapia anterior , cancro gástrico metastático avançado histologicamente comprovada foram incluídos no estudo. Todos os pacientes tiveram que receber FOLFOX (fluorouracil, leucovorina e oxaliplatina) ou XELOX (capecitabina e oxaliplatina) regime de quimioterapia de primeira linha no Centro de Câncer de Sun Yat-sen University, e as amostras de pré-tratamento embebidos em parafina fixadas em formalina sob biópsias gastroscópio ou paliativos obtiveram-se a operação. características histopatológicas foram confirmadas por revisão cega das lâminas de patologia originais. A classificação TNM foi utilizado para o estadiamento patológico, e a classificação da Organização Mundial da Saúde foi utilizado para a classificação patológica. Outros critérios de inclusão foram: idade entre 18-80, Eastern Cooperative Oncology Group status (ECOG) a realização de 2 ou menos, segundo a quimioterapia linha ou não, sem tratamento de radiação. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito; obteve-se consentimento separado para utilização de amostras. aprovação do estudo foi obtido a partir de comitês de ética independentes no Centro de Câncer de Sun Yat-Sen University. O estudo foi realizado de acordo com os padrões éticos da Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinki.
Acompanhamento e avaliação
Os pacientes foram acompanhados por uma comunicação telefone ou carta uma vez por ano para um total de 4 anos. A sobrevida global foi definido como o tempo entre a data de diagnóstico confirmado à morte e censurado na data do último contato para um paciente sobreviver. resposta da doença foi avaliado de acordo com os critérios de avaliação da resposta em tumores sólidos (critérios RECIST) [27]. Os ensaios de citotoxicidade
inibição do crescimento celular foi determinada por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , ensaio de brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT). Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços e deixadas fixar durante a noite. Após 48 horas de incubação em várias concentrações da droga (37 ° C), o MTT (5 mg /mL, 20 uL /​​poço) foi adicionada a cada poço e incubou-se durante mais 4 horas. As placas foram então centrifugadas (1500 g, 5 minutos) e o sobrenadante foi removido. Os peletes de células foram dissolvidas em 200 ul de DMSO. A absorvância foi determinada utilizando o modelo 550 Leitor de Microplacas (BIO-RAD, Hercules, CA, EUA) a um comprimento de onda de 570 nm, com subtracção de fundo a um comprimento de onda de 630 nm. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. A concentração necessária para inibir o crescimento celular em 50% (IC50) foi calculada a partir de curvas de sobrevivência usando o método de Bliss [28].
Western blotting
As células foram lavadas com tampão fosfato salino arrefecido com gelo e colhidas em tampão de amostragem [ ,,,0],62,5 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), SDS a 2%, glicerol a 10%, e 5% de 2-h-mercaptoetanol]. A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Quantidades iguais de proteínas foram aplicadas a géis de 7,5% de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), separados por electroforese, e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno. Depois de bloqueadas em leite magro a 5% em tampão TBST (10 mmol /L Tris-HCl, 150 mmole /L de NaCl, e 0,1% de Tween 20, pH 8,0) durante 1 h à temperatura ambiente, a membrana foi incubada com o anti-polη anticorpo de coelho (1: 400; Abcam). Polη expressão foi detectada com IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano e quimioluminescência aumentada. O anticorpo anti-α-tubulina foi utilizada como controlo de carga. software ImageJ
do National Institutes of Health (NIH) foi utilizada para quantificar a proteína. A imuno-histoquímica

análise imuno-histoquímica (IHQ) foi feito para detectar a expressão polηprotein em 80 tecidos de câncer gástrico humano. Resumidamente, as secções de tecido foram desparafinados em xileno a 37 ° C durante 20 minutos e re-hidratados. peróxido endógena foi bloqueada através da incubação das secções com peróxido de hidrogénio a 3% em metanol durante 20 minutos a 37 ° C. Em seguida, as secções foram submersas em tampão de citrato 10 mM (pH 6,0) e micro-ondas para a recuperação antigénico, seguido de incubação com anti-coelho polη (1: 100; Abcam) durante a noite a 4 ° C. Após a lavagem, as secções de tecido foram tratadas com o anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano durante 30 minutos. As secções foram desenvolvidas com tetracloridrato de diaminobenzidina (DAB) e contrastadas com hematoxilina.
Análise de imuno-histoquímica em nosso estudo foi realizado por dois observadores independentes com base na proporção de células tumorais coradas positivamente. Se houver diferença entre estes dois observadores, estas lâminas foram de novo inquérito por ambos os investigadores utilizam um microscópio com várias cabeças. Tumores com mais de 5% das células cancerosas POLη-positivos foram considerados positivos (coloração núcleo), caso contrário, negativa.
Análise estatística
Receiver operating characteristic (ROC) análise da curva e exato de Fisher foram realizados para selecionar IHC Pol valor -positivo com a maior precisão. 2 × 2 tabela foi construída sensibilidade rendimento, especificidade, valor preditivo positivo e negativo e acurácia foi calculada como proporção de pacientes positivos e negativos verdadeiros verdadeiros de pacientes inteiras. Todas as análises estatísticas foram realizadas por SPSS 15.0 pacote de software estatístico (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA). valor <P; 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A análise de Kaplan-Meier com o teste log-rank foi utilizado para análises univariadas. foram selecionados para inclusão no multivariado final Cox modelo de riscos proporcionais; variáveis ​​mostrando uma tendência de associação com a sobrevivência (0,05 P <). A relação entre a expressão polη e características clínico-patológicas foi examinada por um teste do qui-quadrado e teste exato de Fisher.
Resultados
expressão Polη correlaciona-se com a sensibilidade oxaliplatin de linhas celulares de cancro gástrico
sensibilidade oxaliplatina de quatro linhas de células gástricas ( SGC7901, AGS, MKN45, e MGC803) foram detectados por ensaio de MTT descrito anteriormente. expressão endógena proteína polη de quatro linhas de células foram comparados uns com os outros por transferência western e a metade da concentração máxima inibitória (IC50) Os valores de oxaliplatina para células foram mostrados na Figura 1. significativa e foi observada uma correlação positiva, como mostrado na Figura 2, quando comparado a expressão da proteína polη com valores de IC50 de oxaliplatina. Figura análise 1 Expressão da proteína POL η em linhas celulares de cancro gástrico por transferência de Western e 48 h os valores de IC50 de oxaliplatina para células de cancro gástrico (umol /L).
Figura 2 Correlação entre a expressão POL η e IC50 de oxaliplatina para células gástricas .
características dos pacientes
Oitenta pacientes entre janeiro de 2005 e julho de 2009 foram analisados ​​retrospectivamente. Os doentes tinham uma idade média de 54 (variação de 26,0-79,0), sendo 49 machos e 31 fêmeas. Outras características clínicas foram resumidos na Tabela 1. A taxa de resposta (CR + PR) com primeira linha XELOX ou quimioterapia FOLFOX foi de 47,5%, a taxa de benefício clínico (CR + PR + DP) foi de 77,5%. Parte destes pacientes (23/80) tiveram de segunda linha chemotherapy.Table 1 Características dos pacientes (N = 80)
característica
No. dos pacientes
%
Idade (anos)
Median
54,0
Faixa
26,0-79,0 Sexo seguro
Masculino
49
61,3
Feminino
31
38,7
performance status ECOG
0
36
45,0
1

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