ADN polymeraseη expresión de la proteína predice la respuesta al tratamiento y la supervivencia de los pacientes con adenocarcinoma gástrico metastásico tratados con quimioterapia basada en oxaliplatino

expresión de la proteína polymeraseη ADN predice la respuesta al tratamiento y la supervivencia de los pacientes con adenocarcinoma gástrico metastásico tratados con quimioterapia basada en oxaliplatino
ADN polimerasa η Resumen Antecedentes
gratis (η Pol) es capaz de pasar por aductos de ADN producidos por el cisplatino u oxaliplatino y está asociada con la tolerancia celular a platino. Estudios anteriores mostraron que η defectuosa pol cisplatino resultó en una mayor sensibilidad o oxaliplatino en algunas líneas celulares. El objetivo del presente estudio fue investigar el papel de la expresión de la proteína pol η en el adenocarcinoma gástrico metastásico.
Métodos
Cuatro líneas celulares de adenocarcinoma gástrico fueron elegidos para explorar la relación entre la expresión de la proteína pol η oxaliplatino y sensibilidad por el Western Blot y el ensayo de MTT. Ochenta pacientes con adenocarcinoma gástrico metastásico tratados con FOLFOX o XELOX régimen de la quimioterapia de primera línea fueron analizados, los tejidos tumorales incluidas en parafina fijadas en formol-pretratamiento correspondiente se utilizaron para detectar la expresión de la proteína pol η mediante técnicas de inmunohistoquímica. se analizó la relación entre la expresión de la proteína pol η y las características clínicas y la evolución de estos pacientes.
Resultados
una relación lineal positiva entre la expresión de la proteína pol η y 48 h los valores de IC50 de oxaliplatino en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico se observó. La positividad de la expresión de la proteína pol η está fuertemente asociada con una mala respuesta al tratamiento, así como una menor supervivencia en ambos univariado (8 frente al 14 meses, P < 0,001) y multivariado (cociente de riesgos instantáneos, 4.555; intervalo de confianza del 95%, 2,461-8,429; P <. Conclusiones 0,001) análisis en ochenta pacientes con adenocarcinoma gástrico metastásico
Nuestro estudio indica que polη es un factor predictivo de la respuesta al tratamiento y la supervivencia de los pacientes con adenocarcinoma gástrico metastásico tratados con FOLFOX o XELOX como quimioterapia de primera línea. Por lo tanto, confirmando el valor de polη en los estudios con diseño prospectivo es obligatorio.
Antecedentes
cáncer de estómago es el cuarto cáncer más común en todo el mundo, con 603,003 nuevos casos entre hombres y 330,290 nuevos casos entre las mujeres por año [1]. Es la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer (700.000 muertes al año), con casi dos tercios de los casos se producen en los países en desarrollo y el 42% solo en China [2]. La cirugía es el método de mayor potencial para curar la enfermedad; Sin embargo, aproximadamente el 84% de los pacientes con cáncer gástrico se desarrollará a ser una enfermedad avanzada, con un 30% de los casos localmente avanzados, 30% de las enfermedades metastásicas el momento del diagnóstico, y las enfermedades de recurrencia del 24% [3]. Las literaturas mostraron que la supervivencia media fue de sólo 3-4 meses entre los pacientes con cáncer gástrico avanzado sin quimioterapia. La nueva generación de agentes quimioterapéuticos, tales como oxaliplatino, puede prolongar la supervivencia en el cáncer gástrico avanzado a ser de 10 a 12 meses; Por otra parte, la quimioterapia también puede mejorar la calidad de vida [4-12]. El efecto terapéutico depende principalmente de la respuesta del tumor a los fármacos durante la quimioterapia de primera línea, ya que hasta ahora sólo un pequeño estudio de fase III con 120 casos mostró un modesto beneficio en la supervivencia de la monoterapia con irinotecan más atención de apoyo sola [13]. Por desgracia, debido a la resistencia a los medicamentos, sólo el 30-50% las tasas de respuesta se puede lograr a pesar de que la administración de fármacos de nueva generación, tales como docetaxel, oxaliplatino, capecitabina, irinotecán, S1, etc para los pacientes con cáncer gástrico avanzado como tratamiento de primera línea [3]. Eso significa que al menos 50% de los pacientes tienen que someterse a un tratamiento ineficaz, que no sólo puede disminuir la calidad de vida de los pacientes, sino también aumentar la carga económica. Entonces, ¿cómo predecir la respuesta de los agentes de la quimioterapia en el cáncer gástrico es una cuestión científica muy importante.
Oxaliplatino es el platino de tercera generación, que juega un papel vital en la quimioterapia para el cáncer gastrointestinal. régimen de combinación basada en oxaliplatino como oxaliplatino más 5-FU o fármaco 5-FU y como se ha demostrado ser activa en aproximadamente el 40-50% de los pacientes con cáncer gástrico avanzado [14-16]. Oxaliplatino y cisplatino comparten el mecanismo similar, y causan mono-aductos y entrecruzamientos intra-hebra o inter-hebra de la hélice doble de ADN que bloquean la síntesis de ADN gravemente [17-19]. Cuando esto sucede, algunas vías de reparación del daño en el ADN pueden encender el dispositivo, incluyendo la reparación por escisión de nucleótidos (NER), reparación de genes (MR), la recombinación homóloga (HR), la síntesis de ADN translesion (TLS) [20]. Estas reparaciones de aductos se producen principalmente a través de NER [21]. TLS es otra forma alternativa de reparar estas lesiones, que se realiza principalmente por ADN polimerasas η [22]. Polymeraseη (Polη), una de las enzimas de lesión-replicantes, incorpora el nucleótido correcto sobre las lesiones, tal como un aducto de platino por TLS y continúa elongación de la cadena, mientras que Pols clásicos no puede [23]. Polη tiene la mayor eficacia de pasar por Pt-GG diaductos intra-cadena causadas por platino entre estas enzimas lesión replicante, con una fidelidad limitada [23, 24]. Experimentos recientes han demostrado que la ausencia de resultados polη en una mejora estadísticamente significativa en la sensibilidad a cisplatino cuando se comparan los fibroblastos humanos xeroderma pigmentoso-variantes polη nulo con los polη-expresión [25]. Esta mejora también se observa cuando las células fueron tratadas con carboplatino y oxaliplatino [25]. Los datos recientes muestran que el nivel de ARNm polη correlacionado negativamente con la sensibilidad cisplatino de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) las líneas celulares [26].
En el presente estudio, se presenta por primera vez la relación entre la expresión de la proteína y la sensibilidad polη oxaliplatino de líneas celulares de cáncer gástrico y la importancia de que en la predicción de la respuesta al tratamiento y la supervivencia de pacientes con cáncer gástrico metastásico tratados con quimioterapia basada en oxaliplatino.
Materiales y métodos líneas celulares
México la líneas celulares de cáncer gástrico, incluyendo SGC7901 , AGS, MKN45, y MGC803, fueron donadas por el profesor Libing canción del Laboratorio Estatal de Oncología en el sur de china (Centro de cáncer del sol aún-sen Universidad). Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco), excepto MKN 45 con suero bovino fetal 20%.
Pacientes y muestras
pacientes en nuestra base de datos clínicos con quimioterapia previa , cáncer gástrico avanzado metastásico histológicamente probada se inscribieron para el estudio. Todos los pacientes tenían que recibir FOLFOX (fluorouracilo, leucovorina y oxaliplatino) o XELOX (capecitabina y oxaliplatino) régimen de la quimioterapia de primera línea en el Centro de Cáncer de la Universidad Sun Yat-sen, y las muestras de pretratamiento incluidas en parafina fijadas en formalina bajo biopsias gastroscopio o paliativos se obtuvieron operación. las características histopatológicas fueron confirmados por revisión ciega de las muestras de patología originales. La clasificación TNM se utilizó para la estadificación patológica, y se utilizó la clasificación de la Organización Mundial de la Salud para la clasificación patológica. Otros criterios de inclusión fueron: edad entre 18-80, Eastern Cooperative Oncology Group estado (ECOG) el rendimiento de 2 o menos, quimioterapia de segunda línea o no, sin tratamiento de radiación. Todos los pacientes procuraron su consentimiento escrito; Se obtuvo el consentimiento por separado para el uso de los especímenes. de aprobación del estudio se obtuvo de los comités de ética independientes del Centro de Cáncer de la Universidad Sun Yat-Sen. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las normas éticas de la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki.
Seguimiento y evaluaciones
Los pacientes fueron seguidos por teléfono o carta de comunicación una vez al año para un total de 4 años. La supervivencia global se define como el tiempo desde la fecha de diagnóstico confirmado de muerte y censurado en la fecha del último contacto de un paciente de sobrevivir. Se evaluó la respuesta de la enfermedad de acuerdo con los Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (criterios RECIST) [27]. Los ensayos de citotoxicidad
inhibición del crecimiento celular se determinó mediante 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , ensayo de bromuro de 5-difeniltetrazolio (ensayo de MTT). Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Después de 48 horas de incubación fármaco a diversas concentraciones (37 ° C), el reactivo MTT (5 mg /ml, 20 l /pocillo) se añadió a cada pocillo y se incubó durante 4 horas adicionales. Las placas se centrifugaron a continuación (1,500 g, 5 minutos) y se retiró el sobrenadante. Los sedimentos de células se disolvieron en 200 uL de DMSO. La absorbancia se determinó utilizando el Modelo 550 lector de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) a una longitud de onda de 570 nm, con sustracción de fondo a una longitud de onda de 630 nm. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. La concentración requerida para inhibir el crecimiento celular en un 50% (IC50) se calculó a partir de curvas de supervivencia utilizando el método de Bliss [28].
Western blotting
células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato enfriada en hielo y se recogieron en el muestreo buffer [ ,,,0],62,5 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% de glicerol, y 5% de 2-h-mercaptoetanol]. La concentración de proteína se determinó por el ensayo de Bradford (Bio-Rad Laboratories). Igual cantidad de proteínas se aplicaron a 7,5% en geles de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), separados por electroforesis, y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Después bloqueado en la leche no grasa 5% en tampón TBST (10 mmol /L Tris-HCL, 150 mmol /L de NaCl y 0,1% Tween 20, pH 8,0) durante 1 h a temperatura ambiente, la membrana se incubó con anti-polη anticuerpo de conejo (1: 400; Abcam). expresión Polη se detectó con IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante y un aumento de quimioluminiscencia. El anticuerpo anti-α-tubulina se utilizó como control de carga. software ImageJ
de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) se empleó para cuantificar la proteína.
Inmunohistoquímica
inmunohistoquímica (IHC) análisis se realizó para detectar la expresión polηprotein en 80 tejidos de cáncer gástrico humano. Brevemente, las secciones de tejido se desparafinaron en xileno a 37 ° C durante 20 minutos y rehidratada. peróxido endógena fue bloqueada por incubación de las secciones con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 20 minutos a 37 ° C. A continuación, las secciones se sumergieron en tampón citrato 10 mM (pH 6,0) y calentados para la recuperación antigénica, seguido de incubación con el conejo polη anti- (1: 100; Abcam) durante la noche a 4 ° C. Después del lavado, las secciones de tejido se trataron con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos. Las secciones fueron desarrollados con tetrahidrocloruro diaminobencidina (DAB) y de contraste con hematoxilina.
Análisis de inmunohistoquímica en nuestro estudio se llevó a cabo por dos observadores independientes sobre la base de la proporción de células tumorales con tinción positiva. Si hay diferencia entre estos dos observadores, estos portaobjetos se una nueva investigación por ambos investigadores usando un microscopio de múltiples cabezas. Los tumores con más de 5% de las células cancerosas POLη-positivos fueron considerados como positivos (tinción núcleo), de lo contrario negativo.
El análisis estadístico
características operativas del receptor (ROC) análisis de la curva y la prueba exacta de Fisher se realizaron para seleccionar IHC Pol -positivo valor con mayor precisión. 2 × 2 tabla se creó la sensibilidad rendimiento, especificidad, valor predictivo positivo y negativo, y la precisión se calculó como la proporción de pacientes verdaderos positivos y verdaderos negativos de pacientes enteros. Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante el programa SPSS 15,0 paquete de software estadístico (SPSS Inc, Chicago, IL, EE.UU.). valor de P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier con la prueba de log-rank para el análisis univariado. fueron seleccionados para su inclusión en el multivariado final de Cox de riesgos proporcionales; variables que mostraron una tendencia para la asociación con la supervivencia (P <0,05). La relación entre la expresión polη y características clínico se examinó mediante una prueba de chi-cuadrado y la prueba exacta de Fisher.
Resultados
expresión Polη se correlaciona con la sensibilidad oxaliplatino de líneas celulares de cáncer gástrico
sensibilidad oxaliplatino de cuatro líneas de células gástricas ( SGC7901, AGS, MKN45, y MGC803) fueron detectados por el ensayo MTT descrito anteriormente. la expresión endógena de proteínas polη de cuatro líneas celulares se compararon entre sí mediante transferencia western y la concentración inhibitoria media máxima (IC50) valores de oxaliplatino para las células fueron muestra en la Figura 1. significativa y se observó una correlación positiva, como se muestra en la Figura 2 cuando se compara expresión de la proteína polη con valores de IC50 de oxaliplatino. Figura 1 análisis de expresión de la proteína POL η en líneas celulares de cáncer gástrico por Western Blot y 48 valores de IC50 h de oxaliplatino para células de cáncer gástrico (umol /L).
Figura 2 Correlación entre la expresión POL η y IC50 de oxaliplatino para células gástricas características de los pacientes.

Ochenta pacientes entre enero de 2005 y julio de 2009 se analizaron retrospectivamente. Los pacientes tenían una edad media de 54 (rango: 26,0-79,0), con 49 machos y 31 hembras. Otras características clínicas se resumen en la Tabla 1. La tasa de respuesta (CR + PR) con la primera línea XELOX o FOLFOX quimioterapia fue del 47,5%, la tasa de beneficio clínico (CR + PR + SD) fue del 77,5%. Parte de estos pacientes (23/80) tuvo segunda línea chemotherapy.Table 1 Características de los pacientes (N = 80)
característica
No. de los pacientes
%
Edad (años) guía mediana de 54,0

rango 26,0-79,0
Sexo seguro
Hombre
49
61,3
Mujer
31
38,7
estado funcional ECOG 0

36
45,0
1

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