A interleucina-23A está associada com o crescimento do tumor em relacionadas com Helicobacter pylori humano cancer

gástrica Interleucina-23A está associada com o crescimento do tumor em Helicobacter pylori
relacionados com o cancro gástrico humano
Resumo
fundo
Interleucina ( IL) -23 é uma das citocinas inflamatórias recentemente identificados, e a inflamação também é conhecida por estar relacionada com o desenvolvimento do cancro gástrico (GC). O papel da IL-23 em cancro gástrico, no entanto, é em grande parte desconhecida. No presente estudo, investigamos o papel de IL-23A expressão e possível em GC humano.
Métodos
A expressão de IL-23A e IL-17A em tecidos humanos GC foi determinada por imuno-histoquímica, e da relação entre IL-23A de expressão e características clínicas de GC foi investigada. A concentração no soro de IL-23A e IL-17A foi também testado por ELISA. A fonte eo papel da IL-23A no GC foram estudados in vitro
por citometria de fluxo, MTS (reagente de Owen) Ensaio e Western blot.

Resultados da IL-23A, receptor IL-23 (IL-23R) e IL-17A foram sobre-expressos em todos os tecidos humanos de GC, e o nível de IL-23A estava bem correlacionado com a IL-17A em tecidos GC, bem como no soro do paciente. Os macrófagos e as células de GC eram a principal fonte de secreção de IL-23A com a estimulação de H. pylori
lisado. Além disso, verificou-se que a IL-23A promoveu a proliferação de linhas de células através de GC antagonista do receptor de IL-17A /IL-17 (IL-17RA) /factor nuclear kB (NF-kB) de sinalização.
Conclusões of the alta expressão de IL-23A está associada com GC. IL-23A pode promover o crescimento de células através da indução de GC a secreção de IL-17A em microambiente do tumor. Nossos resultados sugerem que a concentração sérica de IL-23A é um bom biomarcador de mau prognóstico clínico em doentes GC.
Palavras-chave
Interleucina-23A Interleucina-17A Fator nuclear-kB gástrica fundo câncer
IL-23A é uma subunidade da citoquina heterodimérica, a IL-23 por emparelhamento com a outra subunidade, p40 (IL-12). Sabe-se que a IL-23A é expressa e segregada por macrófagos e células dendríticas. IL-23 pode activar o transdutor de sinal e activador de transcrição 4 (STAT4) através de IL-23R distribuído sobre a membrana de vários tipos de células imunitárias, incluindo células T, células assassinas naturais (NK), monócitos e células dendríticas. E IL-23 participa respostas imunes na identificação de substâncias estranhas e defesa do organismo contra infecções e doenças [1], [2].
IL-23A está envolvido na resposta inflamatória através da promoção de metaloproteases de matriz 9, aumentando a angiogênese e reduzindo CD8 + células T de infiltração [3], [4]. Ao trabalhar em conjunto com a IL-6 e factor de crescimento transformante-β1, IL-23 pode promover a diferenciação de células T CD4 + células T naive para células Th17, que é um dos subconjuntos de células T auxiliares bem aceites [5] - [ ,,,0],7]. Th17 células secretam citoquinas pró-inflamatórias de IL-17A que pode induzir uma resposta Th17, estimulando a produção de outras moléculas pró-inflamatórias, tais como IL-1β, IL-6, Factor de Necrose Tumoral-α (TNF-α) e quimiocinas, resultando em inflamação. Tem sido relatado que a IL-17 foi intimamente associada com GC [8], [9]. Um estudo de associação do genoma revelou que -197G > Um polimorfismo na posição -197 na região do promotor de IL-17 aumentou significativamente o risco de GC na população geral [10], [11], enquanto que o aumento da expressão de IL-17 foi encontrada em pacientes com GC. IL-17 também está envolvida na progressão de GC pela promoção da angiogénese no microambiente tumoral [12]. Além disso, a inflamação persistente induzida em parte, por IL-17 pode contribuir para a patologia da mucosa gástrica, assim, aumentar o risco de GC [9], [11], [13].
Comparada com a da IL-17A, os estudos relativos o papel da IL-23A no GC humano são muito insuficientes. No presente estudo, foi investigada a expressão de IL-23A no GC, e seu significado clínico e possível mecanismo estavam envolvidos.

Resultados da IL-23A, IL-23R e IL-17A são excessivos em GC humana
para investigar a expressão de IL-23A e as moléculas relacionadas em GC humana, 141 tecidos embebidos em parafina e foram estudados para a expressão e distribuição de IL-23A, IL-23R e IL-17A usando imuno-histoquímica. Em primeiro lugar, foi observado que a IL-23A, IL-23R e IL-17A foram todos significativamente sobre-expresso em GC humano em comparação com os controlos normais. Embora não era detectável nas glândulas gástricas normais e ligeiramente positiva à infiltração de células inflamatórias, IL-23A foi detectada a um nível elevado em células inflamatórias infiltrantes e células cancerosas em tecidos de cancro (Figura 1A). IL-23R foi expresso exclusivamente em células inflamatórias infiltrantes em ambos cancro e tecidos normais, mas o nível de expressão e a razão eram muito mais elevados em tecidos de cancro (Figura 1B). A IL-17A foi localizado principalmente nas células inflamatórias infiltradas em GC (Figura 1C). A seguir, investigou a relação entre a expressão de IL-23A e características clínicas diferentes, e descobriram que o nível de IL-23A foi associada a H. pylori
carga infecção e tumor (Tabela 1). A Figura 1 Expressão e distribuição de IL-23A, IL-23R e IL-17A em GC humana e tecido gástrico normal. (A) Expressão e distribuição de IL-23A foi analisada por imuno-histoquímica em ambos CG humana e tecido gástrico normal. densidade óptica integrada média foi obtida por meio da análise de cinco campos de visão para cada slide avaliada por Image-Pro Plus versão 5.0. (B) Expressão, a distribuição e a densidade óptica integrada média de IL-23R. (C) A expressão, a distribuição e a densidade óptica integrada média de IL-17A. ** P Art < 0.01.
Tabela 1 Características clínicas de 141 pacientes GC
demografia dos doentes
IL-23 positiva
IL-23 negativo
Pvaluea

Idade, y (gama)
59 (32-85)
ND
ND Sexo seguro
0.730
Masculino
89
45
44
Feminino
52
28
24
local principal
0,613
U
74
36
38
ML
67
29
38
Tamanho, cm (intervalo)
0.028b Art > 5
97
74
23 Restaurant < 5
44
25
19
profundidade de invasão
0,519
T1 /T2
88
24
14
T3 /T4
53
29
24 classificação
Lauren
0,372
intestinal
94
45
49
difusa
47
27
20
Linfonodo metástase
0,401
positiva
69
37
32
negativo
72
33
39
H.pylori
infecção
< 0.0001c
positiva
84
74
10
negativo
57
28
29
Stage
0,215
I
32
16
16
II
45
23
22
III
43
20
23
IV
21
10
11
ND = não determinado
aχ2 teste
bP Art <..; 0,05
cP Art <.; 0,01.
IL-23A está correlacionada com a secreção de IL-17A em GC humana
Estudos recentes têm mostrado que a secreção de IL-23A foi um dos principais factores de diferenciação celular Th17 normal. Nós questionaram se IL-23A também foi associado com células Th17 no GC. De facto, a expressão elevada de IL-23A coincidiu com um aumento da expressão de IL-17A (Figura 2A). Para explorar o relacionamento posterior entre eles, nós quantificada a expressão de ambas as citoquinas dentro de IHC coloração dos pacientes do GC e revelou que a expressão de IL-23A foi significativamente correlacionada com a expressão de IL-17A através de um teste de correlação linear (r 2 = 0,7148, P
< 0,001) (Figura 2B). Figura 2 de IL-23A está correlacionada com a secreção de IL-17A em GC humana. (A) A correlação entre a IL-23A e IL-17A em tecidos de cancro de pacientes GC foi investigada por imuno-histoquímica. (B) A correlação entre IL-23A e IL-17A dentro de IHC coloração dos pacientes GC foi acessado pelo teste de correlação linear.
A concentração sérica de IL-23A é um indicador de mau prognóstico em pacientes GC
Tanto IL-23A e IL-17A pode ser segregada para o sangue, por conseguinte, a hipótese de que o nível de IL-23A e IL-17A no soro de pacientes GC ou controlos saudáveis ​​pode ser determinado por ELISA como biomarcadores. O primeiro detectado o nível de ambas as citocinas como 213 ± 75 pg /ml para IL-23A e 286 ± 101 pg /ml para IL-17A em 50 indivíduos saudáveis ​​(Figura 3A e B). O nível de soro de ambas as citocinas foram significativamente aumentados em pacientes GC como 517 ± 247 pg /ml para IL-23A e 422 ± 284 pg /ml para IL-17A (Figura 3A e B). E a correlação linear de concentração no soro entre a IL-23A e IL-17A também foi observado em pacientes GC (r 2 = 0,5841, P
< 0,001) (Figura 3C). O limiar de controlos saudáveis ​​foi obtido de acordo com o intervalo de confiança de 95% (IC), que foi 285 pg /ml para IL-23A. De acordo com o limiar, os pacientes foram divididos em GC de IL-23A e IL-alto 23A baixas subconjuntos. Para comparar o seu prognóstico clínico entre os dois subgrupos de pacientes GC, soro expressão IL-23A foi examinada pelo método de Kaplan-Meier. Descobrimos que nível de IL-23A (> 285 pg /ml) foi significativamente associada com menor sobrevida global (OS) [P
= 0,027, taxa de risco (HR) 2.246, 95% CI: 1,212-4,160] (Figura 3D). Figura 3 a concentração no soro de IL-23A como um indicador de prognóstico pobre em doentes GC. (A) A concentração sérica de IL-23A em pacientes GC e controles saudáveis. (B) A concentração sérica de IL-17A em pacientes GC e controles saudáveis. (C) A correlação entre a IL-23A e IL-17A em soro de pacientes GC foi acedida pelo teste de correlação linear. (D) As curvas de Kaplan-Meier para o sistema operativo dos pacientes com GC expressão diferente de IL-23A.
IL-23A pode ser secretada por macrófagos e células GC
coloração imuno-histoquímica mostrou que a IL-23A foi abundantemente expressa em múltiplos tipos de células, incluindo células T, macrófagos e células GC (Figura 1A). Para examinar a origem exacta da IL-23A, que acedido expressão de IL-23A em um sistema de estimulação in vitro de H. pylori usando

lisado como o agente indutor de citoquinas, que, com base na observação anterior que o H. pylori
foi um indutor robusta para a secreção de IL-23A. Em células T, a secreção de IL-23A foi ligeiramente aumentado, após estimulação com lisado de H. pylori
(Figura 4A). Em macrófagos, o número de células IL-23A-positivas aumentou de 1,15 ± 0,18% para 13,21 ± 6,21% (Figura 4B). Enquanto que em linhas celulares de GC, as células IL-23A-positiva SGC-7901 aumentou de 2,64 ± 1,12% para 13,11 ± 3,12%, e células IL-23A positivos MKN45 aumentou de 1,16 ± 0,46% para 17,55 ± 5,42% (Figura 4C). Em geral, os macrófagos e células GC mostrou H. pylori
estimulação induzida por lisado de secreção de IL-23A (Figura 4D). Figura 4 a IL-23A é secretada por macrófagos e células GC. (A) A expressão de IL-23A e marcador de superfície celular CD3 foram detectados por citometria de fluxo em células T com um tratamento diferente. (B) a expressão de IL-23A e marcador da superfície celular CD14 foram detectados por citometria de fluxo em macrófagos com um tratamento diferente. (C) A expressão de IL-23A foi detectada por FCS em células MKN45 tratados com lisado de H. pylori
SGC-7901 e. (D) A proporção de células positivas para IL-23A em células T, macrófagos e linhas celulares de GC.
IL-23A promove a sobrevivência de células por meio de GC factor de IL-17A /IL-17RA /Nuclear (NF) -κB sinalização
Para investigar o efeito de IL-23A no crescimento do tumor, um ensaio de co-cultura in vitro
foi utilizada. Em primeiro lugar, verificou-se que a IL-23A não teve nenhum efeito significativo na proliferação de células, quando as linhas de GC SGC-7901 e MKN45 foram tratados com recombinante humano IL-23A directamente. A seguir descobriu que não houve nenhum efeito significativo sobre a SGC-7901 de células de tumor ou co-cultivadas com linfócitos T virgens na presença de IL-23A crescimento MKN45. No entanto, o efeito de célula de promoção do crescimento significativa foi observada quando quer macrófagos ou H. pylori
lisado foi adicionado ao sistema de co-cultura. Quando ambos os macrófagos e H. pylori
foram adicionados, o efeito era sinérgica (Figura 5A e B). Figura 5 a IL-23A promove a sobrevivência das linhas de células através de GC IL-17A /IL-17RA de sinalização /NF-kB. (A) Examinou-se a viabilidade celular da SGC-7901 com o tratamento. (B) A viabilidade das células de MKN45 com o tratamento foi examinada. (C) A concentração de IL-17A em meio de cultura de células de SGC-7901 e MKN45 foram determinados por ELISA. ** P Art < 0,01. (D) A expressão de IL-17RA e IL-23R em ambos MKN45 e SGC-7901. (E) A expressão de p-IkBa, IkBa e CyclinD1 tanto MKN45 e SGC-7901.
Nós investigamos a possível mecanismo subjacente à associação entre IL-17A e IL-23A. Foi determinada a concentração de IL-17A no meio de cultura, e não houve diferença significativa quando as células foram tratadas com GC linfócitos IL-23A mais T IL-23A isoladamente ou. No entanto, a secreção de IL-17A aumentado quando ambos H. pylori
lisado ou macrófagos foi adicionado (Figura 5C). A activação de sinalização de NF-kB foi também examinada, e a expressão de IL-17RA e IL-23R foi detectado em ambos SGC-7901 e células MKN45, relativamente forte expressão de IL-17RA e quase nenhuma expressão de IL-23R Foram identificados (Figura 5D). Fosforilada IκBα e cyclinD1, os produtos de sinalização de NF-kB, aumentaram ambas em células MKN45 SGC-7901 e juntamente com o aumento da presença de IL-17A (Figura 5E). A IL-23A foi segregada a partir de ambos os macrófagos e células GC e promoveu a proliferação de cancro através da sinalização de IL-17A /IL-17RA /NF-kB.
Discussão
GC é o quarto cancro mais comum e a segunda causa de cancro -relacionados morte em todo o mundo. Entre os vários tipos histológicos, do tipo intestinal GC é comumente associado com infecção por H. pylori
, e seu curso é caracterizado por gastrite aguda, gastrite crônica, atrofia gástrica, metaplasia intestinal, e, finalmente, a formação de GC [10].
as causas exatas do GC são desconhecidas, mas uma série de fatores pode aumentar o risco da doença, incluindo sexo, raça, genética, geografia, tipo sanguíneo, idade avançada, histórico familiar e H.pylori
infecção de o estômago. H. pylori
infecta o revestimento do estômago e provoca inflamação crónica e úlceras. As vias moleculares detalhados responsáveis ​​pela estimulação da H. pylori
ainda não são completamente conhecidos [14] - [16].
Vários estudos relataram uma imunes moléculas efetoras da H. pylori
, tais como CagA . CagA promovida a expressão das quimiocinas pró-inflamatórias de IL-8, ligando quimiocina CXC-2 (também conhecida como proteína inflamatória de macrófagos) e o péptido antimicrobiano humana β-defensina-2, através da activação de NF-kB de sinalização [17]. Outros estudos revelaram que CagA translocado para células epiteliais, induzindo níveis elevados de IL-8 infectados por H. pylori
determinadas estirpes, acompanhados por indução de uma resposta inflamatória [16], [18], [19]. quinases Ras-dependentes, extracelular quinase regulada por sinal (ERK) 1 e ERK-2, também são activadas por fosforilação da tirosina desencadeada-CagA, conduzindo à activação de factores de transcrição NF-kB, a proteína-1 do activador, e, finalmente, a IL-8 de produção por células hospedeiras [9].
O mecanismo ligado infecção pelo Hp e resposta Th17 não foi totalmente revelada. Algumas das citocinas, tais como IL-1β e IL-21 foi relatada para ser associada. Lee et al. revelou que a infecção persistente Hp podem induzir células específicas Th17-Hp, em vez de outras células do sistema imunológico que também foram descritas para secretar IL-17A. Além disso, a IL-1β foi também persistentemente elevado, e a neutralização de IL-1β reduziu a resposta específica de Hp-IL-17A, o que sugere uma associação funcional entre a IL-1β e a resposta Th17 persistente [20]. Outro grupo também revelou que a IL-21 regula Th1 e Th17 respostas efetoras durante a infecção crónica pelo H. pylori em uma STAT1- e forma dependente da STAT3, portanto, desempenhar um papel importante controlar infecção por H. pylori e gastrite [21].
Nós relatado que a IL-23A foi segregado a partir de células de GC e macrófagos. Verificou-se que o nível no soro de IL-23A foi um indicador de prognóstico pobre em doentes de GC, e a sua expressão estava relacionado com o volume tumoral e infecção por H. pylori
. Os nossos resultados também indicam que a IL-23A não teve qualquer efeito directo sobre a proliferação de células cancerosas. No entanto, alterou o microambiente do tumor, aumentando a secreção de IL-17A, que é uma citoquina de células marca Th17. Em conclusão, verificou-se que a IL-23A pode ser um índice de potencial e de destino para o diagnóstico e tratamento de GC.
Conclusões
Em conclusão, este estudo mostrou que a alta expressão de IL-23A está associada com GC. IL-23A pode induzir a secreção de IL-17A activar IL-17A /IL-17RA /NF-kB de sinalização em microambiente do tumor. A concentração sérica de IL-23A é um indicador de mau prognóstico em pacientes GC e IL-23A será um índice de potencial e de destino para o diagnóstico e tratamento de GC.
Materiais e métodos
Pacientes
O presente estudo incluiu 141 pacientes com GC submetidos à cirurgia 2008-2013 no Hospital Popular Kunshan, Kunshan, Jiangsu e Kunshan Hospital Filiado à Universidade de Nanjing da medicina chinesa. consentimento informado documentado para a expressão do gene análises de todos os tecidos foram obtidos a partir de todos os doentes antes da cirurgia. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Local do Hospital das Kunshan Pessoas. subtipo histológico segundo a classificação de Lauren [22] foi determinado após uma análise de secções de tumor por dois patologistas. dados de acompanhamento foram disponível a partir de todos os pacientes do GC, que foram avaliados em 3, 6,12 meses e depois a cada 6 meses para 5 anos ou até a morte.
Imunohistoquímica
Todos os tecidos foram removidos e fixados em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C, e depois processada e seccionados a 5 um de espessura. lâminas seccionadas foram coradas por imuno-histoquímica para a IL-23A, IL-23R e IL-17A (Santa Cruz Biotechnology), seguido por incubação com um anticorpo secundário, a 37 ° C durante 30 min e a reacção com o reagente DAB durante 5-10 min. As lâminas foram montadas com goma de neutro para exame microscópico. As células com grânulos intracelulares castanhos (citoplasma ou núcleo) foram consideradas ser coradas positivamente.
ELISA
concentração de IL-23A e IL-17A em soro de pacientes saudáveis ​​e candidatos GC foram medidos utilizando kits de ELISA comercialmente disponível sanduíche ( eBioscience).
Estimulação de IL-23A in vitro
células T e de macrófagos foi isolado a partir de células mononucleares do sangue periférico usando um estojo de isolamento de células T e monócitos, respectivamente (Miltenyi Biotec). Células T e macrófagos mais linhas celulares GC (MKN45 e SGC-7901 foram adquiridas a partir da ATCC) foram mantidas in vitro
e estimulada por Helicobacter pylori
lisado (NCTC 11637, CagA e VacA + +) e analisados ​​por coloração de citocinas intracelulares . Para a coloração de citocina intracelular, as células T foram estimuladas a 37 ° C durante 5 horas com um cocktail de activação dos leucócitos (BD Pharmingen). Além disso, as células T, macrófagos e linhas celulares de GC foram coradas com marcadores de superfície, fixo, e permeabilizadas com IntraPre Reagente (Beckman Coulter) e, finalmente, coradas com marcadores intracelulares. Os dados foram adquiridos em FACSVantage SE e analisados ​​com software CellQuest. mAb conjugado com fluorocromo contra a IL-23A foram adquiridos da BD Pharmingen (Cat. 562468).

citometria de fluxo Para a coloração de citocina intracelular, as células foram estimuladas a 37 ° C durante 5 horas com um cocktail de activação dos leucócitos (BD Pharmingen) . As células foram então coradas com marcadores de superfície, fixo, e permeabilizadas com IntraPre Reagente (Beckman Coulter) e, finalmente, coradas com marcadores intracelulares. Os dados foram adquiridos em FACSVantage SE e analisados ​​com software CellQuest. anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos (mAbs) contra a IL-23A, CD3 serviu como marcador para as células T e CD14 servir como marcadores para monócitos e macrófagos foram adquiridos da BD Pharmingen.
ensaio MTS
células cultivadas foram colocadas em placas a uma densidade de 6 × 10 3 células /cavidade em uma placa de 96 poços e mantidas com DMEM mais 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen). A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTS. CellTiter 96Aqueous Uma solução do reagente (Promega) foi adicionado a cada poço de acordo com as instruções do fabricante, e as placas voltaram para a incubadora. Após 4 horas, a viabilidade celular foi determinada medindo a absorvância a 490 nm utilizando um computador controlado leitor de placas.
Western blot
As proteínas foram extraídas a partir de células e quantificada utilizando um ensaio de proteína (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). As amostras de proteína (30 ug) foram fraccionadas por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Immunoblot foi realizada utilizando anticorpos contra a P-IκBα, IκBα, CyclinD1 e IL-17RA (Santa Cruz Biotechnology). Os resultados foram visualizadas utilizando um sistema de detecção quimioluminescente (sistema ECL Pierce substrato western blot detecção; Thermo Scientific) e exposto a filme de autoradiograf ia (filme Kodak XAR) análise estatística

Os resultados são expressos como média ± DP de pelo. experimentos menos em triplicado. As comparações entre os dois grupos foram realizadas utilizando o teste
Mann-Whitney. A comparação da expressão de IL-23A entre as várias características clínicas foram analisados ​​utilizando o χ 2 de teste. A análise de correlação entre a expressão de IL-23A e IL-17A em tecidos de GC foi realizada utilizando análise de Spearman relação não-paramétrico. As curvas de sobrevida foram estimadas usando o método do produto-limite de Kaplan-Meier e as diferenças significativas entre as curvas de sobrevivência foram determinadas pelo teste de log-rank. P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
abreviações
IL-23:.
Interleucina-23
GC:
O câncer gástrico


IL-23R:
IL-23 receptor
IL-17RA:
subunidade do receptor IL-17 A

NF-kB:
fator nuclear-kB
STAT4:
transdutor de sinal e ativador de transcrição 4
NK:
assassino Natural
Declarações
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo desenvolvimento social Projetos de Tecnologia de Kunshan City, China (KS1255)
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os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
CL e WZ concebido e desenhado os experimentos. CL, YZ, JZ, YZ, QW e Hp realizados os experimentos. CL e WZ realizada análise estatística de todos os dados. CL escreveu o jornal. Todos os autores estão de acordo com o conteúdo do manuscrito e esta submissão. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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