Interleukin-23A mit Tumorwachstum bei Helicobacter-pylori-related menschlichen Magen cancer

Interleukin-23A verbunden ist mit Tumorwachstum bei Helicobacter-pylori
verwandtes menschlichen Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Interleukin zugeordnet ist ( IL) -23 ist eine der neu inflammatorischen Zytokinen identifiziert und Entzündung bekannt ist, auch auf die Entwicklung von Magenkrebs (GC) zusammenzuhängen. Die Rolle von IL-23 in Magenkrebs, ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Expression und mögliche Rolle von IL-23A in der menschlichen GC.
Methoden
Die Expression von IL-23A und IL-17A in der menschlichen GC Gewebe wurde durch Immunhistochemie bestimmt, und die Beziehung zwischen IL-23A-Expression und klinischen Eigenschaften von GC untersucht. Die Serumkonzentration von IL-23A und IL-17A wurde ebenfalls durch ELISA getestet. Die Quelle und die Rolle von IL-23A in GC wurden untersucht in vitro und Videos Durchflusszytometrie, MTS (Owen-Reagenz) Assay und Western Blot.
Ergebnisse | IL-23A, IL-23-Rezeptor (IL-23R) und IL-17A wurden in allen menschlichen Geweben überexprimiert GC, und die Höhe der IL-23A wurde gut korrelierte mit IL-17A in GC Geweben sowie in Patientenserum. Makrophagen und GC-Zellen wurden die Hauptquelle von IL-23A-Sekretion nach Stimulation von H. pylori-Lysat
. Des Weiteren fanden wir, dass IL-23A Proliferation von GC-Zelllinien über IL-17A /IL-17-Rezeptor-Antagonist (IL-17ra) /nuclear factor &kgr; B (NF &kgr; B) gefördert Signalgebung.
Schlussfolgerungen
Der hohe Expression von IL-23A ist mit GC verbunden. IL-23A kann durch Induktion der Sekretion von IL-17A in Tumor-Mikroumgebung GC Zellwachstum gefördert wird. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Serumkonzentration von IL-23A ein guter Biomarker für schlechten klinischen Prognose bei GC-Patienten ist.
Schlüsselwörter Interleukin-23A Interleukin-17A Nuclear Factor-kappaB Magenkrebs hintergrund und IL-23A eine Untereinheit des heterodimeren Cytokins IL-23 durch die Kopplung mit der anderen Untereinheit, p40 (IL-12). Es ist bekannt, dass IL-23A von Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert und sezerniert wird. IL-23 kann Signalgeber und Aktivator der Transkription 4 (STAT4) durch IL-23R auf der Membran von mehreren Arten von Immunzellen verteilt, einschließlich T-Zellen, natürliche Killerzellen (NK), Monozyten und dendritische Zellen aktivieren. Und IL-23 beteiligt sich Immunantworten in fremden Substanzen zu identifizieren und die Verteidigung des Körpers gegen Infektionen und Krankheiten [1], [2].
IL-23A in der Entzündungsreaktion durch die Förderung von Matrix Metalloproteinase 9 beteiligt ist, die Erhöhung der Angiogenese und die Verringerung der CD8 + T-Zellen-Infiltration [3], [4]. Durch die Zusammenarbeit mit IL-6 und den transformierenden Wachstumsfaktor-β1, IL-23 die Differenzierung von CD4 + naive T-Zellen zu Th17 Zellen zu fördern, die eine der gut angenommen T-Helferzell-Untergruppen ist, [5] - [ ,,,0],7]. Th17 Zellen sezernieren proinflammatorische Zytokin IL-17A, die durch die Stimulierung der Produktion anderer entzündungsfördernde Moleküle wie IL-1β Th17 Antwort induzieren kann, IL-6, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und Chemokine, was zu einer Entzündung. Es wurde berichtet, dass IL-17 wurde eng mit GC assoziiert [8], [9]. Eine genomweite Assoziationsstudie hat ergeben, dass -197G > Ein Polymorphismus an Position -197 in der IL-17-Promotorregion signifikant GC Risiko in der Allgemeinbevölkerung [10], [11], während die erhöhte Expression von IL-17 erhöht wurde, bei Patienten mit GC gefunden. IL-17 ist auch in der Progression der GC beteiligt durch Angiogenese in dem Tumor-Mikroumgebung zu fördern [12]. Darüber hinaus teil induzierte persistent Entzündung, die durch IL-17 kann auf der Magenschleimhaut Pathologie beitragen, wodurch das Risiko von GC erhöhen [9], [11], [13]
. Im Vergleich zu dem von IL-17A, die Studien über die Rolle von IL-23A in der menschlichen GC fehlen weitgehend. In der vorliegenden Studie haben wir die Expression von IL-23A in der GC untersucht, und ihre klinische Bedeutung und möglichen Mechanismus beteiligt waren.
Ergebnisse | IL-23A, IL-23R und IL-17A sind übermäßige in der menschlichen GC
Um die Expression von IL-23A und die verwandte Moleküle in menschlichen GC, 141 in Paraffin eingebetteten Geweben untersuchen wurden für die Expression und Verteilung von IL-23A, IL-23R und IL-17A mittels Immunhistochemie untersucht. Zunächst haben wir beobachtet, dass IL-23A, IL-23R und IL-17A alle deutlich in menschlichen GC im Vergleich zu normalen Kontrollen überexprimiert wurden. Obwohl es in den normalen Magendrüsen und leicht positiv in infiltrieren Entzündungszellen, IL-23A wurde in infiltrieren Entzündungszellen und Krebszellen in Krebsgewebe (1A) auf einem hohen Niveau detektiert nicht nachweisbar war. IL-23R wurde in infiltrierenden Entzündungszellen in sowohl Krebs und normalen Geweben, aber das Expressionsniveau und dem Verhältnis viel höher waren in Krebsgewebe (1B) ausschließlich ausgedrückt. IL-17A wurde vor allem in den infiltrierten Entzündungszellen in GC (1C) angeordnet sind. Wir untersuchten als nächstes die Beziehung zwischen der Expression von IL-23A und verschiedenen klinischen Eigenschaften und festgestellt, dass das Niveau der IL-23A mit H. pylori
Infektion und Tumorlast (Tabelle 1) verbunden war. Abbildung 1: Expression und Verteilung von IL-23A, IL-23R und IL-17A in der menschlichen GC und normalen Magen-Gewebe. (A) Expression und Verteilung von IL-23A wurde sowohl in der Human GC durch Immunhistochemie analysiert und normalen Magen-Gewebe. Durchschnittliche integrierte optische Dichte wurde durch Image-Pro Plus-Version 5.0 ausgewertet für jede Folie durch die Analyse von fünf Blickfelder erhalten. (B) Expression, Verteilung und mittlere integrierte optische Dichte von IL-23R. (C) Expression, Verteilung und durchschnittliche integrierte optische Dichte von IL-17A. ** P
< 0,01.
Tabelle 1 Klinische Charakteristika von 141 GC Patienten
Patientendaten
IL-23 positiv
IL-23 negativ
Pvaluea

Alter, y (Bereich)
59 (32-85)
ND | ND | Sex
0.730
männlich
89
45
44
Weiblich
52
28
24
Hauptort
0.613
U
74
36
38
ML 67

29
38
Größe, cm (Bereich)
0.028b
> 5
97
74
23
< 5
44
25
19
Tiefe der Invasion
0.519
T1 /T2
88
24
14
T3 /T4
53
29
24
Lauren Klassifikation
0.372
Intestinale
94
45
49
Diffuse
47
27
20
Lymph Node Metastasierung
0.401
Positive
69
37
32
Negative
72
33
39
H.pylori
Infektion
< 0.0001c
Positive
84
74 10
Negative
57
28
29
Bühne
0.215
I
32
16
16
II
45
23
22
III
43
20
23
IV
21 10
11
ND = nicht bestimmt aχ2 Test
bP
<..; 0.05
cP
<. 0,01.
IL-23A mit IL-17A-Sekretion in menschlichen GC
Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Sekretion von IL-23A war einer der wichtigsten Faktoren bei der normalen Th17-Zell-Differenzierung korreliert ist. Wir fragten, ob IL-23A auch mit Th17 Zellen in GC verbunden war. Tatsächlich fiel erhöhten IL-23A-Expression mit einer erhöhten Expression von IL-17A (2A). Um die weitere Beziehung zwischen ihnen erforschen, wir quantifiziert die Expression beider Zytokine innerhalb IHC-Färbung von GC-Patienten und zeigten, dass IL-23A-Expression signifikant mit IL-17A-Expression durch einen linearen Korrelationstest (r 2 = 0,7148 korreliert wurde, P
< 0,001) (2B). Abbildung 2 IL-23A ist mit IL-17A-Sekretion in menschlichen GC korreliert. (A) Die Korrelation zwischen IL-23A und IL-17A in Krebsgeweben von Patienten GC wurde durch Immunhistochemie untersucht. (B) Die Korrelation zwischen IL-23A und IL-17A in IHC-Färbung von GC Patienten durch lineare Korrelation Test ausgewählt wurde.
Serum IL-23A-Konzentration ist ein Indikator für schlechten Prognose bei GC Patienten
Sowohl IL-23A und IL-17A in das Blut sezerniert werden wir daher die Hypothese aufgestellt, dass das Niveau der IL-23A und IL-17A in dem Serum von Patienten oder gesunden GC Kontrollen können durch ELISA als Biomarker bestimmt werden. Wir haben festgestellt zunächst den Umfang der beiden Zytokine als 213 ± 75 pg /ml für IL-23A und 286 ± 101 pg /ml für IL-17A in 50 gesunden Personen (3A und B). Der Serumspiegel der beiden Zytokine wurden als 517 ± 247 pg /ml für IL-23A und 422 ± 284 pg /ml für IL-17A (3A und B) deutlich in GC-Patienten erhöht. Und die lineare Korrelation der Serumkonzentration zwischen IL-23A und IL-17A wurde auch in GC-Patienten (r 2 = 0,5841, P
< 0,001) gesehen (3C). Der Schwellenwert von gesunden Kontrollen wurde nach der 95% Konfidenzintervall (Cl) erhalten, die 285 pg /ml für IL-23A war. Nach dem Schwellenwert ist, wurden die GC Patienten unterteilt in IL-23A und IL-Hoch 23A niedrigen Teilmengen. Um ihre klinische Prognose zwischen den beiden Untergruppen von GC-Patienten Serum-IL-23A-Expression wurde Vergleich untersuchte die Kaplan-Meier-Methode. Wir fanden, dass IL-23A-Ebene (> 285 pg /ml) signifikant mit kürzeren Gesamtüberleben (OS) zugeordnet ist [P
= 0,027, Hazard Ratio (HR) 2,246, 95% CI: 1,212-4,160] (Abbildung 3D). Abbildung 3 Serum IL-23A-Konzentration als Indikator für die schlechte Prognose in GC-Patienten. (A) Serumkonzentration von IL-23A in GC-Patienten und gesunden Kontrollen. (B) Serumkonzentration von IL-17A in GC-Patienten und gesunden Kontrollen. (C) Die Korrelation zwischen IL-23A und IL-17A in Serum von Patienten GC wurde durch lineare Korrelationstest abgerufen. (D) Die Kaplan-Meier-Kurven für OS von GC Patienten mit unterschiedlichen Expression von IL-23A.
IL-23A kann durch Makrophagen und GC-Zellen sezerniert werden
Immunhistochemische Färbung zeigten, dass IL-23A reichlich in mehreren exprimiert Zelltypen, einschließlich T-Zellen, Makrophagen und GC-Zellen (1A). Um den genauen Ursprung von IL-23A untersuchen, zugegriffen wir IL-23A-Expression in vitro eines
Stimulationssystem unter Verwendung von H. pylori-Lysat
als Cytokin-induzierenden Mittel, die auf einer früheren Beobachtung, dass H. pylori
war ein robuster Induktor für die Sekretion von IL-23A. In T-Zellen, wurde IL-23A-Sekretion nach Stimulation leicht erhöht mit H. pylori Lysat
(4A). In Makrophagen, stieg die Zahl der IL-23A-positive Zellen von 1,15 ± 0,18% auf 13,21 ± 6,21% (4B). Während in GC-Zelllinien, die IL-23A-positive SGC-7901-Zellen von 2,64 ± 1,12% auf 13,11 ± 3,12% erhöht und IL-23A positive MKN45-Zellen von 1,16 ± 0,46% auf 17,55 ± 5,42% (4C) erhöht. Insgesamt zeigten Makrophagen und GC Zellen H. pylori Lysat
-induzierte Stimulation der IL-23A-Sekretion (4D). Figur 4 IL-23A wird durch Makrophagen und GC-Zellen sezerniert wird. (A) Die Expression von IL-23A und Zelloberflächenmarker CD3 wurden durch Durchflusszytometrie in T-Zellen mit unterschiedlichen Behandlung nachgewiesen. (B) Die Expression von IL-23A und Zelloberflächenmarker CD14 wurden durch Durchflusszytometrie in Makrophagen, die mit unterschiedlichen Behandlung nachgewiesen. (C) Die Expression von IL-23A wurde von FCS in SGC-7901 erkannt und MKN45 behandelten Zellen mit H. pylori
Lysat. (D) Das Verhältnis von IL-23A-positiven Zellen in T-Zellen, Makrophagen und GC-Zelllinien.
IL-23A fördert das Überleben von GC-Zellen durch IL-17A /IL-17ra /nuclear factor (NF) -κB Signalisierung
Um die Wirkung von IL-23A auf das Tumorwachstum, ein Co-Kulturassay in vitro
untersuchen wurde verwendet. Erstens fanden wir, dass IL-23A keine signifikante Wirkung auf die Zellproliferation war, als der GC Linien SGC-7901 und MKN45 mit humanem rekombinantem IL-23A direkt behandelt wurden. Wir fanden weiter, dass es keine signifikante Wirkung auf die Tumorzelle SGC-7901 war oder MKN45 Wachstum kokultiviert mit naive T-Lymphozyten in der Gegenwart von IL-23A. zu dem Co-Kultursystem wurde jedoch wurde die signifikante zellwachstumsfördernde Wirkung beobachtet, wenn entweder Makrophagen oder H. pylori
Lysat zugegeben. Wenn beide Makrophagen und H. pylori
hinzugefügt wurden, war die Wirkung synergistisch (5A und B). Abbildung 5 IL-23A fördert das Überleben von GC-Zelllinien durch IL-17A /IL-17ra /NF-kappaB-Signalisierung. (A) Die Lebensfähigkeit der Zellen von SGC-7901 mit der Behandlung untersucht. (B) Die Lebensfähigkeit der Zellen von MKN45 mit der Behandlung untersucht. (C) Die Konzentration von IL-17A in dem Zellkulturmedium von SGC-7901 und MKN45 wurden durch ELISA bestimmt. ** P
< 0,01. (D) Die Expression von IL-17ra und IL-23R in beide MKN45 und SGC-7901. (E) Die Expression von p-IkBa, IkBa und CyclinD1 in beide MKN45 und SGC-7901.
Wir untersuchten den möglichen Mechanismus der Assoziation zwischen IL-17A und IL-23A untermauert. Konzentration von IL-17A in dem Kulturmedium wurde, bestimmt, und es gab keinen signifikanten Unterschied bei der GC-Zellen mit IL-23A alleine oder IL-23A und T-Lymphozyten behandelt. Jedoch erhöht die Sekretion von IL-17A, wenn entweder H. pylori Lysat
oder Makrophagen zugegeben wurde (5C). Aktivierung von NF- &kgr; B-Signalisierung wurde ebenfalls untersucht, und die Expression sowohl von IL-17ra und IL-23R war in beiden SGC-7901 und MKN45-Zellen erkannt wird, relativ starke Expression von IL-17ra und fast keine Expression von IL-23R wurden identifiziert (5D). Phosphoryliert IκBα und cyclinD1 die Produkte der NF &kgr; B-Signalisierung erhöht wurden sowohl in SGC-7901 und MKN45-Zellen zusammen mit erhöhter Gegenwart von IL-17A (5E). IL-23A wurde von beiden Makrophagen und GC-Zellen sezerniert und gefördert Krebs Proliferation durch IL-17A /IL-17ra /NF-kappaB-Signalisierung.
Diskussion
GC die vierthäufigste Krebs ist und die zweithäufigste Ursache für Krebs -related Tod weltweit. Unter verschiedenen histologischen Typen wird Darm-Typ GC allgemein mit H.Pylori
Infektion verbunden, und ihr Verlauf wird durch akute Gastritis, chronische Gastritis, Magen-Atrophie, intestinale Metaplasie gekennzeichnet und schließlich die Bildung von GC [10].
die genauen Ursachen von GC sind unbekannt, aber eine Reihe von Faktoren können das Risiko der Krankheit, einschließlich des Geschlechts, der Rasse, Genetik, Geographie, Blutgruppe, fortgeschrittenes Alter, Familiengeschichte zu erhöhen, und H. pylori-Infektion
von der Magen. H. pylori
die Schleimhaut des Magen infiziert und chronische Entzündungen und Geschwüre verursacht. Die detaillierten molekularen Wege, die für die Stimulation von H. pylori Was sind noch nicht vollständig bekannt [14] - [16]. Mehrere Studien Hast Du ein Effektorzellen des Immunsystems Moleküle von H. pylori
berichtet, wie CagA . CagA gefördert Expression der proinflammatorischen Chemokine IL-8, CXC-Chemokin-Liganden 2 (auch als Makrophagen-Entzündungsprotein bekannt) und das antimikrobielle Peptid menschlichen β-Defensin-2 durch die Aktivierung von NF &kgr; B-Signalisierungs [17]. Andere Studien haben gezeigt, dass CagA in Epithelzellen durch Induzieren hohe Mengen an IL-8 infiziert durch bestimmte H. pylori-Stämme
, begleitet durch Induktion einer Entzündungsreaktion [16], transloziert [18], [19]. Ras-abhängigen Kinasen, extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) 1 und ERK2, auch durch CagA-getriggerten Tyrosin-Phosphorylierung aktiviert werden, um die Aktivierung des Transkriptions führenden Faktoren NF-kappaB, Aktivatorprotein-1, und schließlich, IL-8-Produktion von Wirtszellen [9].
Der Mechanismus verknüpft Hp-Infektion und Th17 Reaktion nicht vollständig offenbart wurde. Einige der Cytokine wie IL-1β und IL-21 berichtet zugeordnet werden. Lee et al. zeigten, dass Hp Infektion persistent Hp spezifische Th17 Zellen induzieren kann, eher als andere Immunzellen, die auch zu sezernieren IL-17A beschrieben wurden. Darüber hinaus wurde auch IL-1β ständig erhöht, und Neutralisation von IL-1β reduzierte die Hp-spezifischen IL-17A-Antwort, eine funktionelle Assoziation zwischen IL-1β und persistent Th17 Antwort darauf hindeutet, [20]. Andere Gruppe zeigte auch, dass IL-21 reguliert Th1 und Th17-Effektor-Antworten während einer chronischen Infektion mit H. pylori in einem STAT1- und STAT3-abhängigen Art und Weise, also eine große Rolle spielen Kontrolle H.-pylori-Infektion und Gastritis [21]. Wir
berichtet, dass IL-23A von GC-Zellen und Makrophagen abgesondert wurde. Wir fanden, dass Serumspiegel von IL-23A ein Indikator für schlechte Prognose in GC-Patienten war, und seine Expression wurde das Tumorvolumen und H. pylori-Infektion
bezogen. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass IL-23A auf die Proliferation von Krebszellen keine direkte Wirkung. Allerdings hat es den Tumor-Mikroumgebung beeinflussen, indem sie die Sekretion von IL-17A zu erhöhen, was zu einem Markenzeichen Zytokin von Th17-Zellen ist. Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass IL-23A ein potentielles Index und Ziel für Diagnose und Behandlung von GC sein könnte.
Schlussfolgerungen
Abschließend zeigte diese Studie, dass die hohe Expression von IL-23A mit GC verbunden ist. IL-23A kann die Sekretion von IL-17A aktiviert IL-17A /IL-17ra /NF-kB Signalübertragung in Tumormikroumgebung induzieren. Serum IL-23A-Konzentration ist ein Indikator für schlechte Prognose in GC-Patienten und IL-23A wird ein Potential Index und Ziel für die Diagnose und Behandlung von GC sein.
Materialien und Methoden
Patienten
Die vorliegende Studie 141 enthalten Patienten mit GC, die Operation von 2008 bis 2013 an der Kunshan Volkskrankenhaus, Kunshan, Jiangsu und Kunshan Krankenhaus, angeschlossen an die Nanjing University of Chinese Medicine unterzog. Dokumentierte informierte Zustimmung für Genexpressionsanalysen aller Gewebe wurde von allen Patienten vor der Operation erhalten. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Kunshan Volkskrankenhaus zugelassen. Die histologische Subtyp nach Lauren-Klassifikation [22] wurde von zwei Pathologen nach einer Überprüfung von Tumorschnitten bestimmt. Follow-up-Daten wurden von allen GC Patienten zur Verfügung, die bei 3 bewertet wurden, 6,12 Monate und dann alle 6 Monate für 5 Jahre oder bis zum Tod.
Immunhistochemie
Alle Gewebe wurden entfernt und fixiert in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C, dann verarbeitet und bei 5 &mgr; m Dicke geschnitten. Geschnittene Folien durch Immunhistochemie für IL-23A, IL-23R und IL-17A (Santa Cruz Biotechnology), gefolgt von Inkubation mit sekundärem Antikörper bei 37 ° C für 30 min und die Reaktion mit DAB Reagenz für 5-10 min wurden gefärbt. Die Objektträger wurden für die mikroskopische Untersuchung mit neutralem Gummi montiert. Die Zellen mit braunen intrazellulären Körnchen (Zytoplasma oder Kern) wurden als positiv gefärbt werden.
ELISA
Konzentration von IL-23A und IL-17A im Serum von GC-Patienten und gesunden Kandidaten wurden im Handel erhältliche Sandwich-ELISA-Kits gemessen unter Verwendung von ( eBioscience).
Stimulation von IL-23A in vitro
T-Zellen und Makrophagen wurden aus peripheren mononukleären Blutzellen, isoliert durch Isolation Kit Zellen und Monozyten zu T bzw. (Miltenyi Biotec). T-Zellen und Makrophagen sowie GC-Zelllinien (MKN45 und SGC-7901 wurden von der ATCC) wurden beibehalten in vitro
und stimuliert durch Helicobacter pylori
Lysat (NCTC 11637, CagA + und VacA +) und durch intrazelluläre Zytokin-Färbung analysiert . Für die intrazelluläre Cytokin-Färbung wurden die T-Zellen bei 37 ° C für 5 Stunden mit einer Leukozytenaktivierung Cocktail (BD Pharmingen) stimuliert. Darüber hinaus wurden T-Zellen, Makrophagen und GC Zellinien gefärbt mit Oberflächenmarkern, fixiert und permeabilisiert mit IntraPre Reagent (Beckman Coulter) und schließlich mit intrazellulären Markern gefärbt. Die Daten wurden auf FACSVantage SE erworben und mit Cellquest-Software analysiert. Fluorochrom-konjugierte mAbs gegen IL-23A wurden von BD Pharmingen gekauft (Kat. 562.468).
Durchflusszytometrie
Für die intrazelluläre Cytokin-Färbung wurden die Zellen bei 37 ° C stimuliert für 5 Stunden mit einer Leukozytenaktivierung Cocktail (BD Pharmingen) . Zellen wurden dann mit Oberflächenmarkern, fixiert und permeabilisiert mit IntraPre Reagent (Beckman Coulter) und schließlich gefärbt mit intrazellulären Markern gefärbt. Die Daten wurden auf FACSVantage SE erworben und mit Cellquest-Software analysiert. Fluorochrom-konjugierte monoklonale Antikörper (mAbs) gegen IL-23A, diente CD3 als Marker für die T-Zellen und CD14 dienen als Marker für Monozyten und Makrophagen wurden von BD Pharmingen gekauft.
MTS Assay
Kultivierte Zellen in einer Dichte ausplattiert von 6 x 10 3 Zellen /Well in einer 96-Well-Platte und mit DMEM plus 10% fötales Kälberserum (Invitrogen) gehalten. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mittels MTS-Assay ausgewertet. CellTiter 96Aqueous Eine Lösung Reagenz (Promega) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben entsprechend den Anweisungen des Herstellers, und die Platten wurden in den Inkubator zurückgeführt. Nach 4 Stunden wurde durch Messung der Extinktion bei 490 nm bestimmt die Lebensfähigkeit der Zellen über einen Computer gesteuert plattenLeser.
Western blot
Die Proteine ​​wurden aus den Zellen extrahiert und quantifiziert, die ein Protein-Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules verwenden, CA). Proteinproben (30 ug) wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Immunoblot wurde Antikörper gegen p-IκBα, IκBα, CyclinD1 und IL-17ra (Santa Cruz Biotechnology) durchgeführt. und ausgesetzt Autoradiographie-Film (Kodak XAR-Film)
Statistische Analyse
Die Ergebnisse als Mittelwert ± SD von ausgedrückt werden zu; Die Ergebnisse wurden unter Verwendung eines chemilumineszenten Detektionssystem (Thermo Scientific Pierce ECL Substrat Western-Blot-Nachweissystem) sichtbar gemacht. mindestens Dreifachversuche. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden unter Verwendung des Mann-Whitney U-Test durchgeführt
. Der Vergleich der IL-23A-Expression zwischen verschiedenen klinischen Eigenschaften wurde mit der χ analysiert 2-Test. Korrelationsanalyse zwischen der Expression von IL-23A und IL-17A in GC Geweben wurde Spearman nichtparametrischer Beziehung Analyse durchgeführt werden. Überlebenskurven wurden unter Verwendung der Kaplan-Meier-Produkt-Limit-Methode geschätzt, und signifikante Unterschiede zwischen den Überlebenskurven wurden mit dem Log-Rank-Test bestimmt. P
< 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet
Abkürzungen
IL-23.
Interleukin-23
GC:
Magenkrebs


IL-23R:
IL-23-Rezeptor-
IL-17ra:
IL-17-Rezeptor-Untereinheit A

NF-kappaB:
Nuclear Factor-kappaB
STAT4:
Signalgeber und Aktivator der Transkription 4
NK:
Natürliche Killer
Erklärungen
Danksagung
dieser Studie durch die soziale Entwicklung Technologieprojekte der Stadt Kunshan, China (KS1255) unterstützt wurde
Autoren. Original vorgelegt Dateien für Bilder
Unten sind die Links zu den Original eingereichten Dateien für Bilder der Autoren. 12935_2014_104_MOESM1_ESM.gif Autoren Originaldatei für Abbildung 1 12935_2014_104_MOESM2_ESM.gif Autoren Originaldatei für Abbildung 2 12935_2014_104_MOESM3_ESM.gif Autoren Originaldatei für Abbildung 3 12935_2014_104_MOESM4_ESM.gif Autoren Originaldatei für Abbildung 4 12935_2014_104_MOESM5_ESM.gif Originaldatei 'Autoren für Abbildung 5 konkurrierende Interessen
die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Beiträge der Autoren
CL und WZ konzipiert und die Experimente entwickelt. CL, YZ, JZ, YZ, QW und Hp geführt, um die Experimente. CL und WZ durchgeführt statistische Analyse aller Daten. CL schrieb die Zeitung. Alle Autoren sind in Übereinstimmung mit dem Inhalt des Manuskripts und die Vorlage. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

• Statine und das Risiko von Magenkrebs bei Diabetes-Patienten
• Die Beteiligung von Tumor-Nekrose-Faktor-α in der Hochregulation von CXCR4-Expression in Magenkrebs durch Helicobacter pylori induziert