Efeito da estimulação de eletroacupuntura em Zusanli acupoint (ST36) sobre a motilidade gástrica: possível através de PKC e MAPK vias de transdução de sinal

Efeito da estimulação de eletroacupuntura em Zusanli acupoint (ST36) sobre a motilidade gástrica: possível através de PKC e MAPK vias de transdução de sinal da arte abstracta
Fundo
Electroacupuncture estimulação (EA) foi mostrado para ter um grande potencial terapêutico para o tratamento de gastrointestinal distúrbios de motilidade. No entanto, nenhuma evidência esclareceu os mecanismos que contribuem para os efeitos da estimulação EA no acuponto Zusanli (E-36). Este estudo foi desenhado para investigar o efeito regulador da estimulação EA no E-36 sobre a motilidade gástrica e para explorar suas possíveis mecanismos
Métodos
Trinta ratos Sprague-Dawley foram divididos aleatoriamente em três grupos:. A-36 grupo, o grupo não-acupoint, eo grupo controle. estimulação EA foi fixada em 2 Hz, modo contínuo, e um V durante 30 min. A amplitude da motilidade gástrica frequência e pico média foram medidos por eletrogastrografia. A proteína quinase C (PKC) e cinase de proteína activada por mitogénio (MAPK) vias de sinalização foram avaliadas utilizando reacções em cadeia da polimerase em tempo real. Caldesmona (CAD) e de expressão calponina (PAC) proteína no antro gástrico foram detectados em Western blot. Um sistema de processamento de vídeo computadorizada foi utilizado para avaliar alterações morfológicas em células do músculo liso (SMCs) do antro gástrico.

Resultados da estimulação EA em E-36 teve um duplo efeito sobre a frequência ea amplitude média de pico. Além disso, a estimulação pelo EA-36 regulada a expressão de alguns genes nas vias de sinalização PKC e MAPK, e regulou a expressão do CAD e proteínas PAC. soro EA induzida SMC contratilidade. Promoção da motilidade gástrica pode se correlacionar com up-regulação da MAPK6 (ERK3), MAPK13 e COX-2 (PTGS2) a expressão do gene, e a regulação do colágeno tipo I, alfa 1 gene (COL1A1) e DAC e expressão da proteína PAC. A inibição da motilidade gástrica pode se correlacionar com a regulação negativa do tipo receptor de interleucina-1 2 (IL1R2) e metaloproteinase-9 genes de matriz (MMP9), e aumento da regulação do CAD e CaP expressão da proteína.
Conclusões
EA e-36 na estimulação da motilidade gástrica regulada, e os efeitos foram tanto promovendo e inibindo em ratos. Os possíveis mecanismos podem ser correlacionados com o sinal de vias de transdução de PKC e MAPK.
Palavras-chave
Electroacupuncture Zusanli gástrica motilidade PKC MAPK fundo
motilidade gástrica é uma das funções fisiológicas mais críticas do intestino humano. Sem motilidade coordenada, a digestão e absorção dos nutrientes da dieta não pode ter lugar. A regulação da motilidade gastrintestinal é complicada e envolve a contracção de células musculares lisas (SMCs). A contração do SMC é regulamentada principalmente por alterações transitórias no Ca intracelular 2 + concentração [1]. Existem duas vias principais envolvidas neste mecanismo, ou seja, a via da cinase Rho-RhoA e a via da proteína quinase C (PKC) [2]. Calponina (CaP), um substrato in vitro
bem estabelecido para proteínas de sinalização PKC por [3], interage directamente com a PKC [4]. Caldesmona (CAD) é uma proteína de ligação à actina e miosina que existe em duas isoformas, que são geradas por splicing alternativo [5]. Existem evidências de uma via secundária na regulação da contração do músculo liso que é PKC dependente, e esta via pode ser mediada por boné e activação DAC [6-9]. as vias de sinalização da cinase activada por mitogénio (MAPK), também têm sido implicados na contracção SMC [10]. Há três grupos principais de MAPK distintamente regulados que conduzem a expressão genética alterada. As cinases relacionadas com sinais extracelulares 1 e 2 (ERK1 /2), a quinase C-Jun terminal (JNK), e a p38 MAPK são conhecidos por desempenhar papéis importantes na resposta a estímulos de sinalização intracelular extracelulares [11]. Além disso, a tampa pode facilitar a sinalização de ERK-dependente, desempenhando assim um papel significativo na regulação da contração SMC [12].
Acupuntura, que tem sido utilizado há milhares de anos na China, é cada vez mais utilizado em todo o mundo para a gestão da várias doenças [13]. Acredita-se que a estimulação de um ponto de acupuntura pode afectar directamente relevantes órgãos e obter o efeito de terapia de acupunctura. EA é um procedimento combinado que estimula um ponto de acupuntura com estimulação elétrica, em vez de com manipulações manuais de agulhas. Numerosos estudos têm avaliado os efeitos e mecanismos de EA sobre a motilidade gástrica [14-20]. Com base na evidência a partir destes estudos, a estimulação EA tem sido demonstrado que têm um grande potencial terapêutico para o tratamento de perturbações da motilidade gastrointestinal. O Zusanli (E-36) é um dos pontos de acupuntura mais comumente utilizados para doenças gastrointestinais. De acordo com a teoria da Medicina Tradicional Chinesa (TCM), não há uma relação entre a E-36 e a função do tracto gastrointestinal. Até à data, no entanto, nenhuma evidência esclareceu os mecanismos exatos que contribuem para os efeitos da estimulação EA.
Portanto, examinando alterações morfológicas e atividade mioelétrica, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito regulador da estimulação EA no E-36 acupoint na motilidade gástrica em ratos e explorar suas possíveis mecanismos.
Métodos
Animais e reagentes
Trinta adultos machos Sprague-Dawley (SD) ratos pesando 180-220 g foram mantidos em um 12 h luz- ciclo de escuro a 25 ± 2 ° C e 60% de humidade, com livre acesso a comida e água. ratos SD foram adquiridos a partir do Centro Experimental animal da Quarta Universidade Médica Militar. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais da Quarta Universidade Médica Militar para o cuidado e uso de animais de laboratório. A aprovação do protocolo do estudo foi obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa Animal, Quarta Militar Medical University, China. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em três grupos:. O grupo-36, o grupo não-acupoint, eo grupo controle
colagenase II, inibidores de tripsina, ditiotreitol açúcar álcool, albumina de soro bovino, sem cálcio tampão fosfato (PBS ), glutaraldeído, e azul de tripano foram adquiridos a Sigma Chemical Co. Kit O ARN total Extracção, SuperScript III transcriptase reversa, e SuperArray PCR master Mix foram adquiridos a partir de Invitrogen Co. anti-cabra, anti-rato, anti-coelho e anticorpos eram comprado de Shanghai Kangcheng Bio-Engineering Co.
procedimento de estimulação EA
a-36 foi localizado a cerca de 5 mm lateral à fíbula dos membros posteriores, enquanto o não-acupoint foi localizado na pata traseira ao lado do E-36 abertas 5 mm [21]. As agulhas foram inseridas 5 mm de profundidade na camada muscular do acupoint selecionados e foram estimulados pela EA a 2 Hz e 2 V usando um estimulador elétrico (G6805-2A; Shanghai Huayi instrumento fábrica Medical, Xangai, China). Cada estimulação durou 20 min em modo contínuo, e a estimulação foi efectuada uma vez /dia durante 5 dias. Os ratos no grupo de controle foram submetidos a sós imobilização sem estimulação por 30 min, ao mesmo tempo cada dia.
Eletrogastrografia
Eletrogastrografia foi aplicado usando o Multichannel Fisiológica Aquisição de Sinais e Sistema de Processamento (modo RM-6280) após a última estimulação no quinto dia. Na sequência de uma 12-h rápida (com acesso livre a água) e 6 h sem bebida, os ratos foram anestesiados por via intraperitoneal (i.p.) com 10% de uretano numa dose de 1 g de corpo /kg e, em seguida imobilizada. O primeiro eléctrodo foi fixado à cauda, ​​e os eléctrodos guiadas foram implantados na superfície da serosa do estômago 0.3 - 0.5 cm acima do piloro. Os eléctrodos foram cobertos com gaze de 37 ° C uma solução salina normal, ligado com fio. Os parâmetros experimentais utilizados foram como se segue:. Frequências de 400 Hz, filtro de 10 Hz, a velocidade de varrimento de 2 s /divisão, sensibilidade de 25 mV, o tempo corrente contínua constante, e o tempo de gravação osciloscópio 1 h [18]
em cadeia da polimerase em tempo real a análise de reacção (PCR)
Após a última estimulação com EA, os ratos foram sacrificados. Para o grupo controle e no grupo não-acupoint, um rato foi selecionado aleatoriamente, respectivamente. Para o grupo EA, que dividiu pela primeira vez em EA promover grupo e EA grupo inibidor de acordo com os resultados da eletrogastrografia. E depois, há ratos foram selecionados aleatoriamente a partir de ambos os grupos. tecidos antro gástrico (a partir do piloro 0,8-1 cm) foram cortados em pedaços que foram de aproximadamente 0,3 cm x 0,5 cm de tamanho e imediatamente colocadas em -70 ° C de azoto líquido. Amostras de RNA total foram extraídos utilizando TRIZOL a partir de diferentes grupos de acordo com as instruções do fabricante. a qualidade do RNA foi avaliada espectrofotometricamente em função da razão A260 /A280. As amostras de ARN foram verificadas para a integridade do ARN 18S e 28S por electroforese em gel. O ARN total (1,5 ug) foi utilizada para gerar ADNc de primeira cadeia com SuperScript III transcriptase reversa (1 ul) a partir do ARN isolado. As reacções de PCR em tempo real foram preparados utilizando um SuperArray PCR Master Mix (Cat. No. PA-112) contendo os genes de vias de sinal de PKC e MAPK. O cDNA diluído (102 ul) foi adicionado a cada furo correspondente ao chip de PCR. Em seguida, os chips foram colocados em PCR o equipamento de PCR em tempo real para a reacção de PCR. As condições dos ciclos foram como se segue: 95 ° C durante 10 min, 60 ° C durante 15 s, e 60 ° C durante 1 min (40 ciclos). Diferenças na expressão genética, expressa como vezes de mudanças, foram calculados utilizando a 2 -ΔΔCt método.
Western blot do CAD e CaP
Os níveis de CAD e proteína CaP foram detectados por transferência de Western. Após o tratamento com EA, os ratos foram sacrificados. Os ratos foram então fixadas, seguido por incisão da pele abdominal e do peritoneu. As vísceras foram expostos, e o centro de 1/3 do corpo gástrico foi cortada em pequenos pedaços que foram de aproximadamente 0,3 cm x 0,5 cm de tamanho. As peças foram imediatamente armazenados a -70 ° C em azoto líquido. Resumidamente, os extractos celulares (30 ug) a partir da parte superior de 1/3 do meio do corpo gástrico foram separados por electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e em seguida, transferido para membranas de nitrocelulose. Os filtros foram bloqueados com solução salina tamponada com Tris (TBS) de leite /5%, seguido por incubação com anticorpos policlonais contra a DAC (1: 3000 de diluição), tampa (1: 3000 de diluição), e β-actina (1: 10.000). Depois as membranas foram lavadas, que foram incubadas com anticorpos conjugados com peroxidase secundário diluído 1: 5000 em TBS com 0,01% de Tween 20. O sistema de detecção de anticorpo foi usada, e as membranas foram expostas a película de raios-X de acordo com as instruções do fabricante. soro preparação
O soro foi preparado como descrito anteriormente com modificações [22]. Após a última estimulação com EA, todos os ratos foram sacrificados. Em seguida, 6 ml de sangue foi retirado da carótida de cada rato. O sangue foi mantido ainda durante 1 h, e, em seguida, centrifugadas a 3000 rpm durante 15 min. O soro foi recolhido, filtrado para remover as bactérias, e 1,5 ml foi embalado num tubo de PE, que foi armazenado a -70 ° C em azoto líquido.
Efeitos de soro EA em SMC contractilidade
Cinco ratos SD foram normais ip anestesiado com 10% de uretano numa dose de 1 g /kg de peso corporal. Depois de ser anestesiado, a pele abdominal e peritônio foram objecto de uma incisão, e as vísceras foram expostas. O estômago inteiro foi cortado, e os tecidos do antro gástrico foram isoladas e imediatamente colocado em oxigénio PBS saturada com penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /ml) a 4 ° C. Depois de ser lavado, os tecidos foram transferidos para HEPES oxigénio saturado, espalhar e fixada numa placa de gel de sílica com uma agulha fina. A camada mucosa foi cuidadosamente cortado, expondo a mucosa circular, que foi cortada em 9 - 10 tiras de músculo (1 mm x 4 mm), colocados em solução de Tyrode, e mantida a 4 ° C no frigorífico durante cerca de 15 min. As tiras de músculo foram digeridos em 1% de colagenase tipo II, 0,05% de inibidor de tripsina, 0,05% de açúcar álcool ditiotreitol, e enzima de albumina de soro bovino a 0,2% em banho-maria durante 25 min a 36 ° C. Após digestão, a mistura foi lavada com HEPES livre de enzima, incubadas durante 30 min, e filtrada com uma malha 200 de tela para recolher as SMC gástricas individuais livres. A viabilidade celular foi medida com o teste do azul de Tripano. As células vivas foram mais do que 95% a uma densidade de 10 6 células /ml. As
SMCs isolados foram divididos aleatoriamente para o grupo normal de soro, soro grupo E-36, e o grupo de soro não do ponto de acupunctura. suspensões SMCs (50 ul) a uma densidade de 1,0 x 10 6 células /mL foram colocadas em placas de 96 poços. Cada amostra de soro foi inactivado após 30 min num banho de água a 56 ° C, e, em seguida, diluída 1: 2 com tampão HEPES. O soro (50 ul) a partir dos diferentes grupos foi adicionado a CML, misturada com uma pipeta, durante 30 s, e fixadas com 30 uL de 2,5% de glutaraldeído. comprimento celular foi avaliada com um Sistema de Vídeo Computadorizada Processing (DP2-BSW), que foi usado para calcular a percentagem de encolhimento. A percentagem encolhimento celular = (comprimento de células antes do tratamento - comprimento de células após o tratamento). /Comprimento celular antes do tratamento × 100%
análise estatística
Os dados foram expressos em média ± S.D. Uma análise de variância seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni foi aplicada com SPSS 10.0. Os valores obtidos a partir do ΔCt-PCR em tempo real, os quais foram utilizados para calcular as diferenças de dobragem de mudança (aqui expresso como percentagem do controlo), também foram utilizados para a análise estatística. A p
-valor < 0,05 ou um fold-change > 2 foi definido como estatisticamente significante para todas as análises.

Resultados Efeitos da EA sobre a motilidade gástrica
EA em-36 produziu mudanças significativas no valor absoluto da amplitude de pico média e frequência em comparação com o controlo ou grupos não-acupontos (P
< 0,01). Em contraste, a EA na não-acupoint não induziu alterações significativas na motilidade gástrica em comparação com o grupo controle (arquivo adicionais 1: Figura S1). Foram observados dois tipos de padrões motores gástricos para o grupo-36 nos 10 ratos testados de acordo com o pico média: ratos com pico média positiva foram julgados à promoção padrão, enquanto que ratos com pico negativo médio foram julgados à promoção de padrões. Os resultados mostraram 5 (50,0%) a ratos mostrou-36 promovendo padrão e 5 (50,0%) o E-36 ratos mostraram inibir padrão. Em ratos com o padrão-36 da promoção, os valores médios de amplitude e frequência de pico foram 47,13 ± 0,44 e 0,19 ± 0,06, respectivamente. Em ratos com o padrão-36 inibir, os valores médios do pico de amplitude e frequência foram -43,41 ± 0,62 e 0,17 ± 0,03, respectivamente. (Arquivo adicionais 2: Tabela S1)
Efeitos da EA no PKC e MAPK vias de sinalização
eA em e-36 regulada de forma significativa a expressão de alguns genes no PKC e MAPK vias de sinalização. A Tabela 1 lista os resultados da análise de microarray do grupo de E-36 promovendo (em comparação com o grupo de controlo). A expressão de muitos genes foi aumentada após estimulação EA, incluindo ERK3, MAPK13, IL1R1, PRKCA, e PTGS2. Outros genes mostrou diminuição da expressão após estimulação EA, incluindo IL1R2. A Tabela 2 lista os resultados da análise de microarray do grupo de E-36 inibição (em comparação com o grupo de controlo). A expressão gênica de IL1R2 e MMP9 foram diminuiu após EA stimulation.Table mudança 1 Gene comparando EA promover grupo com grupo controle
sinal via
Gene
Sites
EA /controle (mudança Fold)
EA /controle (Dobre para cima ou para baixo-regulação)
MAPK
MAPK6 (ERK3)
D02
2.39
2.39
MAPK
MAPK13
D10
2.86
2.86
PKC
IL1R1
F08
2.18
2.18
PKC
PRKCA
G01
2.40
2.40
PKC
PTGS2
G02
2.72
2.72
PKC
IL1R2
F09
0.26
-3.85
Dobra-mudanças (2-ΔΔCt) é a expressão do gene normalizado (2-ΔCt) na amostra de teste dividida pela expressão do gene normalizado (2-ΔCt) na amostra de controlo. Dobre-regulação representa os resultados dobra de mudança de uma forma biologicamente significativa. Fold-change valores superiores a um indicam um positivo- ou aumento da regulação e da dobra-regulação é igual à fold-change. Fold-change valores inferiores a um indicam um negativo ou para baixo-regulação, ea dobra-regulação é o inverso negativo da fold-change.
Tabela 2 mudança Gene comparando grupo inibitória EA com grupo controle
via de sinal
Gene
Sites
EA /controle (Dobre mudança)
EA /controle (Dobre para cima ou down-regulation)

PKC
IL1R2
F09
0.24
-4.26
PKC
MMP9
F11
0.21
-4.68
Dobra-mudanças (2-ΔΔCt) é a expressão do gene normalizado (2-ΔCt) na amostra de teste dividida pela expressão do gene normalizado (2-ΔCt) na amostra de controlo. Fold-regulação representa os resultados dobra-mudar num biologicamente forma significativa. Fold-change valores superiores a um indicam um positivo- ou aumento da regulação e da dobra-regulação é igual à fold-change. alterar valores Dobre-a menos de um indicam um negativo ou para baixo-regulação e da dobra -regulação negativo é o inverso da dobragem de troca.
Tabela 3 lista os resultados da análise de microarray do grupo de E-36 promovendo (em comparação com o grupo não-acupontos). a expressão do gene COL1A1 foi aumentada após estimulação eA. a expressão dos genes IL1R2 e SERPINE1 foram diminuiu após estimulação eA. a Tabela 4 lista os resultados da análise de microarray do grupo de e-36 inibição (em comparação com o grupo não-acupontos). Muitos dos genes mostraram diminuição expressão após estimulação eA, incluindo o ERK3, JNK3, p38bMAPK, MAPK13, p38MAPK, ERK1, FGF2, IL1R1, IL1R2, MYC, PRKCA e genes PTGS2. A expressão do gene COL1A1 foi aumentada após EA stimulation.Table mudança 3 Gene comparando grupo que promove EA com o grupo não-acupoint
sinal via
Gene
Sites
EA /Non-acupoint (mudança Fold)
EA /Non-acupoint (Dobre para cima ou down-regulation)

PKC
COL1A1
F05
3.60
3.60
PKC
IL1R2
F09
0.39
-2.54
PKC
SERPINE1
G04
0.48
-2.07
Dobra-mudanças (2-ΔΔCt) é a expressão do gene normalizado (2-ΔCt) na amostra de teste dividida pela expressão do gene normalizado (2-ΔCt) na amostra de controlo. Fold-regulação representa os resultados dobra-mudar num biologicamente forma significativa. Fold-change valores superiores a um indicam um positivo- ou aumento da regulação e da dobra-regulação é igual à fold-change. alterar valores Dobre-a menos de um indicam um negativo ou para baixo-regulação e da dobra Regulamentação é o inverso negativo da fold-change.
Tabela 4 mudança Gene comparando grupo inibitória EA com o grupo não-acupoint
sinal via
Gene
Sites

EA /Non-acupoint (Dobre mudança)
EA /Non-acupoint (Dobre para cima ou para baixo-regulação)
MAPK
MAPK6 (ERK3)
D02
0,18
-5,67
MAPK
MAPK10 (JNK3)
D07
0,42
-2,40
MAPK
MAPK11 (p38bMAPK)
D08
0,39
-2,58
MAPK
MAPK13
D10
0,28
-3,58
MAPK
MAPK3 (ERK1)
G11
0,26
-3,83
MAPK
MAPK14 (p38MAPK)
D11
0.47
-2.13
PKC
FGF2
F07
0.37
-2.67
PKC
IL1R1
F08
0.30
-3.31
PKC
IL1R2
F09
0.36
-2.81
PKC
MMP9
F11
0.22
-4.48
PKC
MYC
F12
0.39
-2.59
PKC
PRKCA
G01
0.23
-4.27
PKC
PTGS2
G02
0.19
-5.36
PKC
COL1A1
F05
4.81
4.81
Dobra-mudanças (2-ΔΔCt) é a expressão do gene normalizado (2-ΔCt) na amostra de teste dividida pela expressão do gene normalizado (2-ΔCt) na amostra de controlo. Fold-regulação representa os resultados dobra-mudar num biologicamente forma significativa. Fold-change valores superiores a um indicam um positivo- ou aumento da regulação e da dobra-regulação é igual à fold-change. alterar valores Dobre-a menos de um indicam um negativo ou para baixo-regulação e da dobra Regulamentação é o inverso negativo da fold-change.
Efeitos da eA em CAD e expressão da proteína CaP
Estimulação com a eA aumentou significativamente CAD e expressão da proteína CaP no grupo inibindo-36 em comparação com o não-acupoint grupo, enquanto que a estimulação com eA diminuiu significativamente a expressão da proteína de CAD e de chapéu na e-36 promovendo grupo, em comparação com o grupo não-acupoint (Figura 1A, B, C, D). Figura 1 Efeitos da estimulação eA em caldesmona (CAD) e calponina (PAC), os níveis de proteína. A. Expressão dos níveis de proteína caldesmona por Western blotting. Os níveis de proteína B. análise densitométrica caldesmona normalizados pela β-actina; C. Expressão dos níveis de proteína calponina por transferência Western; D análise densitométrica calponina níveis de proteína normalizada por β-actina. CaD: caldesmona; CaP: calponina; 1: grupo não-acupoint; 2-4: grupo inibidor da EA; 5-7: EA promover grupo. * P < 0,05 compard ao grupo não-acupoint
Efeitos do soro EA em SMC contratilidade
Como mostrado na arquivo adicionais 3:. Figura S2 e arquivo adicionais 4: Tabela S2, morfologia celular foi observado sob o microscópio de luz após o tratamento com diferentes tipos de soro. Não houve diferenças em comprimento celular antes da adição de soro (p > 0,05). soro de E-36 aumentou a contractilidade SMC (60,22 ± 3,84 uM) em comparação com o soro de controlo (96,02 ± 6,24

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