Wirkung von electroacupuncture Stimulation bei Zusanli acupoint (ST36) auf die Motilität des Magens: möglich durch PKC und MAPK Signaltransduktionswege

Wirkung von electroacupuncture Stimulation bei Zusanli acupoint (ST36) auf die Motilität des Magens: möglich durch PKC und MAPK Signaltransduktionswege
Zusammenfassung
Hintergrund
Elektroakupunktur (EA) Stimulation wurde zur Behandlung von Magen-Darm ein großes therapeutisches Potential haben gezeigt Motilitätsstörungen. Es wurde jedoch keine Beweise, die Mechanismen einen Beitrag zu den Wirkungen von EA Stimulationen auf Zusanli acupoint (ST.36) geklärt. Diese Studie wurde entworfen, um die regulative Wirkung von EA Stimulation am ST.36 auf die Motilität des Magens zu untersuchen und ihre möglichen Mechanismen zu erforschen
Methoden
Thirty Sprague-Dawley Ratten zufällig in drei Gruppen eingeteilt:. Die ST.36 Gruppe, die nicht-Akupunkt-Gruppe und der Kontrollgruppe. EA-Stimulation wurde mit 2 Hz, Dauerbetrieb und 1 V für 30 min eingestellt. Die Frequenz und die durchschnittliche Spitzenamplitude Magenmotilität wurden durch electrogastrography gemessen. Die Proteinkinase C (PKC) und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Signalwege wurden unter Verwendung von Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionen bewertet. Caldesmon (CaD) und Calponin (CaP) Proteinexpression in Magenantrum wurden auf Western-Blots nachgewiesen. A Computed Videoverarbeitungssystem verwendet wurde, morphologische Veränderungen in glatten Muskelzellen (SMCs) von der Magenantrum auszuwerten.
Ergebnisse
EA Stimulation bei ST.36 hatte eine doppelte Wirkung auf die Frequenz und die mittlere Spitzenamplitude. Zusätzlich zu ST.36 EA Stimulation der Expression einiger Gene in den PKC und MAPK-Signalwege geregelt wird, und es die Expression des CAD- und CaP Proteine ​​reguliert. EA Serum SMC Kontraktilität induziert. Förderung der Motilität des Magens kann korrelieren mit Hochregulierung von MAPK6 (ERK3), MAPK13 und Cyclooxygenase-2 (PTGS2) Genexpression und die Herunterregulierung des Kollagens Typ I, alpha 1 (COL1A1) -Gen und CaD und CaP-Protein-Expression. Die Hemmung der Motilität des Magens kann mit Down-Regulation des Interleukin-1-Rezeptor Typ 2 (IL1R2) und Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) Gene und Hochregulation von CAD- und CaP-Protein-Expression korreliert.
Schlussfolgerungen
EA Stimulation bei ST.36 Magenmotilität reguliert, und die Wirkungen wurden sowohl die Förderung und Hemmung bei Ratten. Die möglichen Mechanismen können mit den PKC und MAPK Signaltransduktionswege korrelieren.
Schlüsselwörter Elektroakupunktur Zusanli Magenmotilität PKC MAPK hintergrund und Magenmotilität einer der wichtigsten physiologischen Funktionen des menschlichen Darms ist. Ohne koordinierte Motilität, die Verdauung und Resorption von Nahrung Nährstoffe nehmen nicht statt. Die Regulation der gastrointestinalen Motilität ist kompliziert und schließt die Kontraktion der glatten Muskelzellen (SMCs). Die Kontraktion der glatten Muskelzellen wird durch vorübergehende Veränderungen in der intrazellulären Ca primär geregelt 2 + -Konzentration [1]. Es gibt zwei Hauptwege in diesem Mechanismus beteiligt sind, nämlich die RhoA-Rho-Kinase-Weg und die Proteinkinase C (PKC) Weg [2]. Calponin (CaP), ein gut etabliertes in vitro
Substrat für Proteine, die durch PKC Signalisierung [3], interagiert direkt mit PKC [4]. Caldesmon (CAD) ist ein Aktin und Myosin bindendes Protein, das in zwei Isoformen existiert, die durch alternatives Spleißen erzeugt werden [5]. Es gibt vermehrt Hinweise auf einen Nebenweg in der Regulation der Kontraktion der glatten Muskulatur, die PKC abhängig ist, und dieser Weg kann durch CaP und CaD-Aktivierung [6-9] vermittelt werden. Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Signalwege auch in SMC Kontraktion [10] in Verbindung gebracht. Es gibt drei große Gruppen von deutlich geregelt MAPK, die zu einer veränderten Genexpression führen. Die extrazellulären Signal verwandten Kinasen 1 und 2 (ERK1 /2), der C-jun terminale Kinase (JNK) und p38 MAPK sind bekannt, um eine wichtige Rolle in der intrazellulären Signal Antwort auf extrazelluläre Stimuli [11] spielen. Zusätzlich kann CaP ERK-abhängigen Signal erleichtern und somit eine wichtige Rolle in der Regulierung der Kontraktion SMC spielt [12].
Akupunktur, die seit Tausenden von Jahren in China verwendet wurde, weltweit zunehmend für die Verwaltung verwendet wird, von verschiedene Krankheiten [13]. Es wird angenommen, dass die Stimulation eines acupoint direkt relevanten Organe und erreichen die Wirkung der Akupunktur-Therapie beeinflussen können. EA ist ein kombiniertes Verfahren, das einen Akupunkt mit elektrischer Stimulation statt mit manuellen Manipulationen von Nadeln stimuliert. Zahlreiche Studien haben die Wirkungen und Mechanismen von EA auf die Motilität des Magens [14-20] ausgewertet. Auf der Grundlage der Erkenntnisse aus diesen Studien wurde EA Stimulation ein großes therapeutisches Potential für die Behandlung von Magen-Darm-Motilitätsstörungen haben gezeigt. Die Zusanli (ST.36) ist eine der am häufigsten verwendeten Akupunkturpunkte für den Magen-Darm-Erkrankungen. Nach der Theorie der traditionellen chinesischen Medizin (TCM), gibt es eine Beziehung zwischen ST.36 und der Funktion des Magen-Darm-Trakt. Bis heute hat sich jedoch keine Hinweise auf die genauen Mechanismen einen Beitrag zu den Auswirkungen von EA Stimulation geklärt.
Daher ist es durch morphologische Veränderungen und myoelektrische Aktivität untersucht, um die vorliegende Studie soll die regulative Wirkung von EA Stimulation am ST.36 zu bewerten acupoint auf die Motilität des Magens bei Ratten und seine möglichen Mechanismen zu erforschen.
Methoden
Tiere und Reagenzien
Dreißig erwachsene männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 180 bis 220 g auf einer 12-h Licht gehalten wurden dunkel-Zyklus bei 25 ± 2 ° C und 60% Luftfeuchtigkeit mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. SD-Ratten wurden aus dem Experimental Animal Center der Vierten Military Medical University erworben. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der Vierten Military Medical University für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die Genehmigung des Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission für Tierforschung, Vierte Military Medical University, China erhalten. Die Tiere wurden zufällig in drei Gruppen eingeteilt:. Die ST.36 Gruppe, die nicht-Akupunkt-Gruppe und der Kontrollgruppe
Kollagenase II, Trypsin-Inhibitor, Dithiothreitol Alkohol Zucker, Rinderserumalbumin, kalziumfreien Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS ), Glutaraldehyd und Trypanblau wurden von Sigma Chemical Co. Die Gesamt-RNA-Extraktions-Kits, Superscript III Reverse Transkriptase und SuperArray PCR Master Mix wurden von Invitrogen Co. Anti-Ziege, anti-Maus und Anti-Kaninchen-Antikörper wurden nachstehende Artikel erworben von Shanghai Kangcheng Bio-Engineering Co.
EA Stimulationsverfahren gekauft
die ST.36 etwa 5 mm lateral der Fibula der hinteren Gliedmaßen entfernt wurde, während die nicht-acupoint auf dem Hinterfuß neben der befand ST.36 offen 5 mm [21]. Die Nadeln wurden 5 mm tief in die Muskelschicht des ausgewählten acupoint eingesetzt und wurden von EA mit 2 Hz und 2 V mit einem elektrischen Stimulator stimuliert (G6805-2A; Shanghai Huayi Medical Instrument Factory, Shanghai, China). Jede Stimulation dauerte 20 min im kontinuierlichen Modus, und Stimulation wurde 5 Tage für 1 Mal /Tag durchgeführt. Die Ratten in der Kontrollgruppe wurden allein für 30 Minuten bei der gleichen Zeit jeden Tag, ohne Stimulation der Immobilisierung vorgelegt.
Electrogastrography
Electrogastrography wurde der Multichannel Physiologische Signalerfassung und -verarbeitung System (Modus RM-6280) nach der letzten Anwendung unter Verwendung von Stimulation am fünften Tag. Nach einer 12-h schnell (mit freiem Zugang zu Wasser) und 6 h ohne zu trinken, wurden die Ratten anästhesiert intraperitoneale (i.p.) mit 10% Urethan in einer Dosis von 1 g /kg Körper und dann immobilisiert. Die erste Elektrode wurde auf dem Schwanz befestigt und geführt Elektroden wurden auf der Serosaoberfläche des Magens implantiert 0,3 - 0,5 cm über den Pylorus. Die Elektroden wurden mit 37 ° C normale Salzlösung Gaze, verbunden mit Draht bedeckt. Die experimentellen verwendeten Parameter waren wie folgt:. Frequenz 400 Hz, 10 Hz-Filter, Abtastgeschwindigkeit 2 s /Teilung, Empfindlichkeit 25 mV, Zeitkonstante Gleichstrom, und Oszilloskop Aufnahmezeit 1 h [18]
Echtzeit-Polymerase-Ketten Reaktion (PCR) Analyse
Nach der letzten Stimulation mit EA, wurden die Ratten getötet. Für Kontrollgruppe und nicht-Akupunkt-Gruppe wurde eine Ratte jeweils zufällig ausgewählt. Für EA-Fraktion teilten wir es zunächst in EA-Gruppe zu fördern und EA Gruppe Hemmung gemäß den Ergebnissen der electrogastrography. Und dann gibt Ratten wurden zufällig aus beiden Gruppen ausgewählt ist. Magenantrum Gewebe (aus dem Pylorus 0,8-1 cm) wurden in Stücke geschnitten, die × 0,5 cm in der Größe ca. 0,3 cm waren und sofort in -70 ° C mit flüssigem Stickstoff gegeben. Gesamt-RNA-Proben wurden unter Verwendung von TRIZOL extrahiert aus verschiedenen Gruppen entsprechend den Anweisungen des Herstellers. RNA-Qualität wurde spektrophotometrisch auf der Basis des A260 /A280-Verhältnis bewertet. RNA-Proben wurden für die Integrität der 18S und 28S-RNA durch Gelelektrophorese überprüft. Gesamt-RNA (1,5 ug) wurde verwendet, Erststrang-cDNA mit Superscript III Reverse Transcriptase (1 ul) aus der isolierten RNA zu erzeugen. Die Echtzeit-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung eines SuperArray PCR Master Mix vorbereitet (Kat. Nr PA-112), um die PKC und MAPK-Signalweg-Gene enthalten. Die verdünnte cDNA (102 ul) wurde zu jedem Loch hinzugefügt, um die PCR-Chip entspricht. Dann wurden die PCR-Chips in die Echtzeit-PCR-Instrument für die PCR-Reaktion gegeben. Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: 95 ° C für 10 min, 60 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min (40 Zyklen). Die Unterschiede in der Genexpression, ausgedrückt als fold changes, wurden die 2 berechnet -ΔΔCt Methode.
Western-Blots von CAD- und CaP
CAD- und CaP-Proteinspiegel durch Western-Blot nachgewiesen wurden. Nach der Behandlung mit EA, wurden die Ratten getötet. Die Ratten wurden dann fixiert, gefolgt von Anschneiden der Bauchhaut und Peritoneum. Die Eingeweide wurden ausgesetzt, und die zentrale 1/3 des Magen-Körper wurde in kleine Stücke geschnitten, die × 0,5 cm in der Größe ca. 0,3 cm waren. Die Stücke wurden sofort bei -70 ° C in flüssigem Stickstoff gelagert. In Kürze, Zellextrakte (30 &mgr; g) von der oberen 1/3 der Mitte des Magenkörpers durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und dann auf Nitrocellulosemembranen wurden getrennt. (: 3000 Verdünnung 1), Deckel (1: 3000 Verdünnung) und β-Aktin (1: 10000) Die Filter wurden mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) /5% Milch, gefolgt von einer Inkubation mit polyklonalen Antikörpern gegen CaD blockiert. Nachdem die Membranen gewaschen wurden, wurden sie mit sekundären Peroxidase-konjugierten Antikörper inkubiert, verdünnt 1: 5000 in TBS mit 0,01% Tween 20. Der Antikörper-Detektionssystem verwendet wurde, und die Membranen wurden auf Röntgenfilm ausgesetzt gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Serumpräparat
Serum wurde hergestellt, wie zuvor mit Modifikation beschrieben [22]. Nach der letzten Stimulation mit EA wurden alle Ratten getötet. Als nächstes wurden 6 ml Blut aus der Halsschlagader der Ratten entnommen. Das Blut wurde noch 1 h gehalten, und dann 15 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Das Serum wurde gesammelt, filtriert Bakterien zu entfernen, und 1,5 ml wurde in einem EP-Rohr gepackt, die bei -70 ° C in flüssigem Stickstoff gelagert wurde.
Effects of EA Serum auf SMC Kontraktilität
Fünf normale SD Ratten narkotisierten ip mit 10% Urethan in einer Dosis von 1 g /kg Körpergewicht. Nach betäubt worden waren, wurden die Bauchhaut und Peritoneum eingeschnitten, und wurden die Eingeweide ausgesetzt. Die ganzen Magen wurde herausgeschnitten und die Magenantrum Gewebe wurden isoliert und sofort in Sauerstoff gesättigt PBS mit Penicillin (100 U /ml) und Streptomycin (100 ug /ml) bei 4 ° C gestellt. Nach dem Abspülen wurden die Gewebe an Sauerstoff gesättigt HEPES überführt, mit einer feinen Nadel auf einer Silicagel-Platte verteilt und fixiert. Die Schleimhautschicht wurde geschnitten, vorsichtig ab, die Kreis Schleimhaut auszusetzen, der in 9 abgeschnitten wurde - 10 Muskelstreifen (1 mm × 4 mm), platziert in Tyrode-Lösung und hielt für etwa 15 Minuten im Kühlschrank bei 4 ° C. Die Muskelstreifen wurden in 1% Kollagenase Typ II verdaut 0,05% Trypsin-Inhibitor, 0,05% Dithiothreitol Alkoholzucker und 0,2% Rinderserumalbumin Enzym in einem Wasserbad für 25 min bei 36 ° C. Nach der Verdauung wurde das Gemisch mit enzymfreien HEPES gespült, für 30 Minuten inkubiert und mit einem 200 Mesh-Sieb gefiltert, um die freien einzigen Magen-SMCs sammeln. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Trypanblau-Test gemessen. Die lebenden Zellen waren mehr als 95% bei einer Dichte von 10 6 Zellen /ml.
Die isolierten SMCs zufällig in die normale Serumgruppe eingeteilt, ST.36 Serumgruppe und nicht acupoint Serumgruppe. SMCs Suspensionen (50 &mgr; l) bei einer Dichte von 1,0 × 10 6 Zellen /ml in 96-Well-Platten gelegt wurden. Jede Serumprobe wurde nach 30 Minuten in einem 56 ° C Wasserbad inaktiviert und verdünnt dann 1: 2 mit HEPES. Serum (50 ul) von den verschiedenen Gruppen wurde zu SMCs, gemischt mit einer Pipette für 30 s, und befestigt mit 30 &mgr; l 2,5% Glutaraldehyd. Zellenlänge wurde mit einem Computed Video Processing System (DP2-BSW) bewertet, die verwendet wurde, um die Schrumpfung Prozentsatz zu berechnen. Die Zellschrumpfungsprozentsatz = (Zelllänge vor der Behandlung - Zellenlänge nach der Behandlung). /Zelllänge vor der Behandlung × 100%
statistische Analyse
Daten ausgedrückt wurden als Mittelwert ± S. D. Einweg-Varianzanalyse und Bonferroni-Mehrfachvergleichstest gefolgt wurde mit SPSS 10.0 Software angewendet. Die ACt Werte aus der Echtzeit-PCR erhalten, die verwendet wurden, um die fold change Unterschiede zu berechnen (hier als Prozent der Kontrolle ausgedrückt) wurden auch für die statistische Analyse verwendet. A p
-value < 0,05 oder ein fold change > 2 als statistisch signifikant für alle Analysen definiert wurde.
Ergebnisse

• Einstufige chirurgische Reparatur von Atemwegs Magenfistel nach esophagectomy
• Eine Studie der antimikrobiellen Aktivität, die akute Toxizität und zytoprotektive Wirkung eines polyherbal Extrakt in einem Ratten-Ethanol-HCl Magengeschwür-Modell