revisão retrospectiva utilizando sequenciamento profundo alvo revela diferenças mutacionais entre junção gastro-esofágico e gástrico carcinomas

revisão retrospectiva utilizando sequenciamento profundo alvo revela diferenças mutacionais entre junção gastroesofágico e carcinomas gástricos da arte abstracta
Fundo
Adenocarcinomas tanto da junção gastro-esofágico e de estômago são molecularmente complexa, mas diferem em relação à epidemiologia, etiologia e sobrevivência. Existem poucos dados que comparam directamente as frequências de mutações de um único nucleotídeo em genes relacionados ao câncer entre os dois sites. A sequenciação dos painéis gene alvo podem ser úteis na descoberta de vários aberrações genómico usando um único teste.
Métodos
ADN a partir de 92 junção gastro-esofágico e 75 amostras de ressecção de adenocarcinoma gástrico foi extraído a partir de tecido embebido em parafina e fixado em formalina. sequenciamento de profundidade alvo de 46 genes relacionados com o cancro foi realizada através de emulsão PCR seguido de seqüenciamento à base de semicondutores. junção gastroesofágico e carcinomas gástricos foram contrastadas com relação a padrões de mutação, imunohistoquímica e in situ
hibridação, bem como os correspondentes dados clínico-patológicas.
Resultados
carcinomas junção gastroesofágica foram associados com menor idade, tipo intestinal mais frequente histologia, a superexpressão do p53 mais freqüentes e sobrevida livre de doença pior em análise multivariada. Entre todos os casos, 145 mutações foram detectadas em 31 genes. TP53
mutações eram a anormalidade mais comum detectado, e foram mais comuns nos carcinomas gastroesofágico junção (vs. 42% 27%, p = 0,036). Mutações no
Wnt componentes da via APC e CTNNB1
eram mais comuns entre os carcinomas gástricos (16% vs. 3%, p = 0,006), e carcinomas gástricos foram mais propensos a ter ≥3 mutações driver detectou (11% vs. 2%; p = 0,044). Vinte por cento dos casos tinham mutações potencialmente viáveis ​​identificados. foram observadas mutações R132H e missense R132C no gene da IDH1
, e são as primeiras mutações notificados de sua espécie no carcinoma gástrico.
Conclusões
sequenciamento Painel de material patologia de rotina pode produzir informações mutacional de vários genes de driver, incluindo alguns para os quais terapias direcionadas estão disponíveis. taxas diferentes de mutações e diferenças clínico-patológicas apoiar uma distinção entre adenocarcinomas que surgem na junção gastroesofágico e aqueles que surgem no estômago adequada.
Palavras-chave
gástricas gastroesofágico Câncer Câncer junção gástrico genômica do câncer sequenciamento O câncer gástrico fundo
gástrica o câncer para mais de 10.000 mortes por ano nos Estados Unidos [1], e é a segunda causa mais comum de mortalidade por cancro em todo o mundo [2]. Embora carcinomas da junção gastroesofágico (JGE) foram agrupadas com carcinomas gástricos em registros de câncer e em ensaios clínicos para terapias específicas [3], as lesões nestes dois locais têm características clínicas distintas. Adenocarcinomas do estômago adequada são causadas principalmente por Helicobacter pylori
infecção [4] e estão a diminuir em incidência mundial [1]. Em contraste, os cancros Gej são as mais associadas com a doença do refluxo gastroesofágico [2-5] e obesidade [6], e a incidência de carcinomas Gej manteve-se estável ao longo dos últimos 20 anos [7]. Além disso, o prognóstico dos carcinomas Gej foi anotado para ser pior do que carcinomas gástricos, e há incerteza quanto ao facto de carcinomas Gej deve ser encenada como tumores gástricos ou esôfago [8]. Reconhecendo a distinção entre os carcinomas do JGE, esófago, estômago e pode melhorar a recolha de dados epidemiológicos significativas e permitir uma maior precisão gestão [9].
Vários estudos notaram diferenças nas características moleculares dos carcinomas Gej contra aqueles que surgem noutro local no estômago. TP53
mutações são mais frequentes na JGE que no estômago distal, enquanto a perda de heterozigose do TP53
lócus também é mais comum em tumores Gej [10,11]. As diferenças significativas nas taxas de metilação do promotor de APC
e CDKN2A
também têm sido descritos [12]. Além disso, as diferenças em taxas de mutação APC
e expressão de proteína, assim como diferenças nos perfis globais de expressão do gene entre dois locais, também têm sido demonstradas [13-16].
Ensaios de amplificações de ErbB2
( também conhecido como HER2
) gene em cancros de junção gástricas e gastroesofágico é agora uma prática de rotina em muitas instituições [17]. Do mesmo modo, o teste de mutações condutoras, particularmente as substituições de um único nucleótido, em oncogenes e genes supressores de tumor actualmente informa tratamento em adenocarcinomas de outros locais, tais como o pulmão e cólon [18-20]. Como outros alvos moleculares são descobertos através de sites de doença, os ensaios eficazes serão necessários para determinar a suscetibilidade dos cancros de tratamento específicos.
Next-Generation Sequencing pode ser usado no futuro próximo para interrogar vários genes em uma única amostra, e estes dados poderia ser usado para informar os clínicos de mutações motorista e guia de tratamento alvejado. sequenciamento painel alvo é uma forma de sequenciamento de última geração, onde variantes de um único nucleotídeo são detectados em um número limitado de loci genômica previamente determinado, que pela intenção são muitas vezes prognóstico e terapêutica crítica. Painel de sequenciamento permite a multiplexação de amostras, e cobertura profunda (> 500x) facilita a análise de material modelo de sub-óptima a partir de tecido de arquivo e amostras com baixa celularidade tumor. O conjunto mais restrito de genes também permite a rápida processamento das amostras e análise bioinformática. Assim, os resultados acionáveis ​​pode ser obtido em poucos dias, em vez de as semanas, em comparação a todo abordagens genoma e exome. No entanto, os dados são restringidos pela selecção inerentemente tendenciosa de genes, e a incapacidade de detectar alterações no número de cópias, a perda de heterozigosidade, e rearranjos estruturais, tais como fusões de genes. Assim, o uso eficaz de NGS requer uma avaliação cuidada das tecnologias, as limitações do ensaio, os requisitos de modelo, e a pesquisa e questões clínicas em consideração.
Os objetivos deste estudo foram investigar a utilidade de sequenciamento painel sobre incluídas em parafina fixado em formalina incorporado tecido (FFPE), e comparar JGE clinicamente anotado e carcinomas gástricos através do painel de sequenciamento dos hotspots de 46 genes do cancro. Procurou-se também comparar as freqüências de mutações identificadas com painel de sequenciamento de hotspots contra a sequenciação de todo o exome, usando dados publicamente disponíveis a partir O Cancer Genome Atlas.
Métodos
caso a seleção e recuperação de dados clínico-patológicas
de Ética Institucional aprovação foi obtida a partir da Universidade de Cancer Agência British Columbia /British Columbia placa de ética em pesquisa (# H07-2807), ea pesquisa foi conduzida de acordo com a declaração de Helsínquia. Casos de carcinoma gástrico foram recuperados de arquivos departamentais da Agência British Columbia Cancer (BCCA), um centro de referência provincial. Os critérios de inclusão foram encaminhamento para a agência entre 2004 e 2010, disponível tecido FFPE da ressecção cirúrgica do tumor primário, completos de dados clínico-patológicas, incluindo resultados clínicos no follow-up, e a ausência de doença metastática na apresentação. biópsias de lesões primários e metastáticos foram excluídos devido à ausência de dados patológicos completos. JGE localização foi definido como uma lesão com um epicentro a 5 cm da extremidade proximal das pregas Rugal gástricas [21]. Não foi feita distinção entre tumores no que respeita à localização do seu epicentro dentro dos 5 cm do JGE (isto é, tipo Siewert não foi registrada) [22]. Carcinomas localizados exclusivamente no interior do esófago foram excluídos, de acordo com os mais recentes critérios da OMS [21]. Todos os tumores gástricos localizados distalmente à JGE foram finalmente resolvido em conjunto para este estudo. Dados clínico-patológico foi coletada retrospectivamente por meio de revisão de prontuários dos pacientes por um membro da equipe clínica, bem como através da avaliação dos relatórios de patologia.
Tissue microarray construção, imunohistoquímica e in situ
hibridação
construção Tissue microarray foi realizada utilizando dois núcleos de 0,6 mm a partir de duas secções separadas de tumor. coloração imuno-histoquímica de p53 (1: 100; clone DO-7, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), Baf250a (1:75; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ea reparação de incompatibilidade (MMR) proteínas, incluindo hMLH1 (01:25; clone ES05, ​​Leica, Wetzlar, Alemanha), MSH2 (1: 5; clone 25D12, Leica), hMSH6 (1: 300; PU29 clone, Leica) e hPMS2 (1: 150; clone MOR4G, Leica ) foi realizada na plataforma XT (Ventana). A expressão de p53 foi pontuada como ausentes (< 1% de coloração nuclear), (1-60% de coloração nuclear de qualquer intensidade) normal, ou a sobre-expressão (> 60% de coloração nuclear de qualquer intensidade). proteínas Baf250a e MMR foram marcados como intacta (≥1% da coloração) ou negativo (< 1% da coloração) com base na expressão de proteínas especificamente em células de tumor (isto é, expressão imune e estroma foi ignorado). ERBB2
prata in situ
hibridação (SISH) foi realizada utilizando o /ISH plataforma XT automática IHC coloração (Ventana). Um ERBB2
: rácio CEP17 < 2,0 foi classificada como não amplificado, e um valor ≥2.0 como amplificado. Enumeração de sinais sish foi baseada em protocolos estabelecidos [17].
Processamento de amostras de DNA, sequenciamento, ea variante chamando
Em cada caso, hematoxilina e eosina lâminas foram utilizados para orientar macrodissection ou rolagem do tecido tumoral de FFPE desliza seguinte delineando de tumores por um patologista anatômica. ADN do tumor de cada caso foi extraído utilizando o estojo de extracção de ADN Qiagen FFPE (Qiagen, Venlo, Países Baixos); nenhum DNA foi extraído de linha germinal. O DNA extraído foi quantificado utilizando o ensaio Qubit HS dsADN (Life Technologies Gaithersburg, MD, EUA); todos os casos apresentaram um mínimo de 10 ng do ADN extraído a partir de FFPE, de acordo com uma exigência relatado anteriormente para o ensaio de [21]. Foi necessário um A260 280 rácio mínimo /de 1,8 para cada amostra de DNA. ADN construção da biblioteca de fragmento amplificado foi realizada utilizando iniciadores de ADN a partir do ponto de acesso V1 Painel cancro Ion Ampliseq ™ (Life Technologies). O kit é composto de pares de primers 207 que cobrem 739 hotspots dentro de 46 genes relacionados com o cancro (arquivo adicional 1: Tabela S1). bibliotecas amplicon indexadas foram reunidas por reacção em cadeia da polimerase e sequenciação de emulsão sobre a plataforma Ion Torrent PGM (Life Technologies). Foi necessário um mínimo de pelo menos 500x cobertura de par de bases em cada caso. chamada variante foi realizada utilizando o v2.2 Torrent Variant chamador (Life Technologies) usando o genoma de referência hg19. Apenas as variantes presentes em frequências ≥5% foram considerados. Como o DNA germinal não estava disponível para comparação, as variantes foram excluídos como possíveis mutações somáticas se eles foram identificados como polimorfismos de nucleotídeo único com freqüências alélicas médias de >.... 0 no banco de dados dbSNP (www NCBI NLM nih gov /SNP); sua condição de variantes não-germinativas foi ainda confirmada usando uma pesquisa PubMed (www. NCBI. nlm. nih. gov /PubMed).
comparação com o Cancer Genome Atlas (TCGA) dados
Curadoria chamadas de mutações somáticas para 281 amostras de adenocarcinoma de estômago TCGA com sítios anatômicos conhecidos foram obtidos a partir do Portal de dados TCGA (http:... //TCGA-dados NCI nih gov /TCGA /) em 19 de Fevereiro de 2014. mutações de codificação de proteínas localizadas nas regiões amplificadas pela v1 Painel Ion Ampliseq ™ Cancer Hotspot em cada um dos 46 genes foram obtidos para casos e estratificada por localização (60 cárdia /proximal e da junção gastroesofágico contra
221 fundo de olho /corpo, antro /distal e estômago NOS). Copiar dados de números, dados de expressão de RNA, e dados de expressão de proteína não foram considerados como nosso próprio ensaio só detecta variantes de nucleotídeo único (SNVS) e pequenas inserções de pares de bases /deleções (Indels). As frequências das mutações, independentemente do tipo de mutação, foram comparados em relação ao hotspot sequenciamento do painel múltiplo que realizamos.
A análise dos dados
Mann-Whitney U-testes e estudantes testes t foram usados ​​para comparar variáveis ​​lineares, onde apropriado. Fisher teste exato e qui-quadrado, quando apropriado, foram usados ​​para comparar valores categóricas. Survival análises foram realizadas com log-rank (Kaplan-Meier) e Cox testes de riscos proporcionais. Os genes do painel 46 foram mapeados para a Enciclopédia Kyoto de genes e genomas (KEGG) [22,23] e do programa de Análise de Caminho Ingenuity® Integrado (Qiagen) para identificar vias oncogênicas e redes enriquecido para mutações, e para testar as diferenças estatisticamente significativas entre junção gastro-esofágico e amostras de adenocarcinomas gástricos. Os valores de P
foram corrigidos para testes múltiplos utilizando a correção Benjamini-Hochberg (BH) [24]. Todos os testes estatísticos foram bicaudais e um valor
P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS Statistics (v22, IBM, Armonk, Nova Jersey, EUA) e do v.2.15.1 R linguagem estatística (R Core Team (2012) R:.. A linguagem e ambiente para computação estatística Fundação R para . Computing estatística, Viena, Áustria ISBN 3-900051-07-0, URL http:... //www R-projeto org /)
resultados
Dentro arquivos departamentais na BCCA, 229 espécimes de ressecção de carcinomas gástricos e Gej foram obtidos 2004-2010 e estavam disponíveis para a construção de um tissue microarray. DNA estava disponível para a extração de 176 casos. Não existem dados clínico-patológico estava disponível para correlação em 6 casos. Três casos tinha doença metastática documentado dentro de um mês da apresentação, e estes foram excluídos da análise. Dos restantes 167 casos, originou 92 na junção 75 gastroesofágico e originado no restante do estômago (Figura 1). Figura 1 diagrama de fluxo detalhando seleção de casos e de exclusão para o grupo estudo.
diferenças clínico-patológicas entre JGE e carcinomas gástricos
As características clínico-patológicas destes casos estão resumidos na Tabela 1 e dados clínicos anônimos é fornecido em um arquivo suplementar (arquivo adicionais 2: Tabela S2). carcinomas Gej foram associados com idade mais jovem na ressecção, do tipo intestinal mais frequente e histologia difusa menos frequente, a superexpressão do p53 mais frequentes e menos perda frequente de expressão da p53, mais frequente doença em estágio III, doença Eu fase menos freqüentes, e retornos mais freqüentes. sobrevida livre de doença foi significativamente pior entre os pacientes com carcinomas Gej (Figura 2A), embora os dois grupos não foram estatisticamente diferentes em termos de sobrevida global (Figura 2B). Outras características clínico-patológicas foram similares entre os tumores dos dois locais, incluindo T-estágio, o envolvimento margem de ressecção, ERBB2
amplificação e perda de proteína MMR (Tabela 1). A proporção de carcinomas difusos na classificação Lauren) foi semelhante entre os dois locais. análise de subgrupo de apenas carcinomas do tipo intestinal mostraram diferenças persistentes entre JGE e carcinomas gástricos na sobrevida livre de doença e expressão da p53. As diferenças de idade, a expressão de p53 e resultado persistiu quando considerando apenas os carcinomas do tipo intestinal, bem como quando os tumores foram estratificados em três subtipos (não-proximal difuso, difuso, e distais não difusas) Tal como sugerido por Shah et ai. [16] (arquivo adicionais 3: Tabela S3) .table 1 Resumo das variáveis ​​clinocopathologic em variáveis ​​clínico-patológicas da coorte dentro cárdia e não-cárdia adenocarcinomas
variável Correlação
junção gastroesofágico (n = 92)
não-cárdia (n = 75)
geral (n = 167)
p
Idade (média de anos)
61,5 + /- 9,6 [33-80]
66,3 +/- 11,9 [33-84]
63,7 +/- 10,9 [33-84]
0,001 Sexo seguro
0,297
Masculino
70 (76)
51 (68)
121 (73)
Feminino
22 (24)
24 (32)
46 (27)
histológica subtipo (Lauren)
0,008
intestinal
65 (71)
36 (48)
101 (60)
difusa
15 (16)
26 (35)
41 (25)
Mixed
12 (13)
13 (17)
25 (15)
Stage (AJCC)
0,031
IA-B
10 (11)
19 (25)
29 (17)
IIA-B
60 (65)
45 (60)
105 (63)
III-AC
22 (24)
11 (15)
33 (20)
Grade
0,415
bem diferenciados (G1)
4 (5)
10 (6)
moderadamente diferenciado (G2)
39 (42)
25 (33)
64 (38)
pouco diferenciado (G3)
47 (51)
46 (61)
93 (56)
margem de ressecção
0,306
uninvolved
74 (80)
65 (87)
139 (83)
Envolvidos
18 (20)
10 (13)
28 (17)
amplificação ERBB2
0,654
Ausente
78 (85)
66 (88)
144 (86)
Apresente
14 (15)
9 (12)
23
BAF250a expressão (ARID1A) (14)
0,111
Intact
73 (79)
51 (68)
124 (74)
Ausente
19 (21)
24 (32)
43 (26)
expressão da p53
2.8x10 -4
0 - ausente
32 (35)
47 (63)
79 (47)
1 - normal (1-60%)
17 (19)
14 (19)
31 (19) Página 2 - aumentou (> 60%)
43 (47)
14 (19)
57 (34)
proteínas de reparo incompatibilidade
0,244
Intact
77 (84)
57 (76)
135 (80)
anormal
15 (16)
18 (24)
33 (20)
número de recorrências
57 (62)
32 (43)
89 (53)
0,019
médio de sobrevivência livre de progressão (meses)
12
18
15
Número de mortes
69 (75)
48 (64)
117 (70)
0,130
médio de sobrevida global (Meses )
18,0
23,0
20,0
Figura 2 Comparação de sobrevida livre de doença e sobrevida global entre os pacientes com gastroesofágico e carcinomas gástricos. A) Doença de sobrevida livre foi significativamente pior para carcinomas gastroesofágico (linhas sólidas) em comparação com carcinoms gástricas (linhas pontilhadas), a Log-rank; p = 0,002, embora B) sobrevida global não diferiu entre os dois locais de doença (Log-rank;. p = 0,225)
Na análise multivariada, JGE localização foi independentemente associada com pior sobrevida livre de doença (Cox proporcional Hazard = 2,08 [95% de intervalo de confiança: 1,25-3,44], p = 0,005), juntamente com o status de margem e instabilidade de microssatélites (arquivo adicionais 4: Tabela S4). Idade, grau do tumor e comprometimento de margens foram independentemente prognóstico da sobrevida global (arquivo adicionais 5: Tabela S5).
Mutações identificadas com o painel câncer
Entre todos os casos, 145 mutações foram detectadas em 31 genes, com 75 mutações detectadas entre 57 dos tumores a partir de JGE e 70 mutações detectadas entre os 43 tumores gástricos (Figura 3). Sem mutações foram detectadas em 35 (38%) e 32 (43%) dos tumores do estômago e JGE, respectivamente. TP53 foi
os genes mutados mais comuns, com variantes identificadas em 59 de 167 casos (35%). Os próximos genes mais comumente mutados foram PI3KCA
(6%), CTNNB1
(5%), KRAS
(5%) e SMAD4
(4%). Outras variantes incluídas mutações de ponto de acesso em IDH1
(2 casos), JAK3
(3 casos), e FLT3
(2 casos). Uma única mutação foi identificada em 70 casos (42%), 2 mutações foram identificadas em 20 casos (12%), e ≥3 mutações foram identificadas em 10 casos (6%). Figura 3 mutações somáticas identificados em junção gastro-esofágico e de carcinomas gástricos. TP53
mutações foram identificadas em uma proporção maior de tumores junção gastroesofágica, enquanto que anormalidades na APC
/CTNNB1
ocorreram com maior frequência em tumores gástricos. blocos pretos representam truncando mutações, enquanto blocos de cinza representam mutações missense. Casos e genes em que não foram identificadas mutações não estão incluídos.
Nenhuma mutação foi identificada nas regiões de ponto de acesso de ALK
, CSF1R
, EGFR
, FGFR2
, HNF1A
, HRAS
, JAK2
, MPL
, NPM1
, as ARN
, SRC
, STK11
ou BVS
. Todas as chamadas variantes estão disponíveis nos dados suplementares (arquivo adicional 6: Tabela S6).
As diferenças de mutações entre o JGE e estômago
TP53
mutações foram identificadas em 39 de 92 (42%) dos tumores Gej , e em 20 de 75 (27%) tumores gástricos (p = 0,036). Quando os subdividida em 3 subtipos sugeridas por Shah et ai. [16], TP53
mutações ocorreram mais frequentemente em cancros nondiffuse proximais (44%) do que em cancros difusas (37%) e cânceres distais nondiffuse (20%, p = 0,024). Esta classificação também mostrou mutações mais frequentes em KRAS
dentro cancros nondiffuse distais (12%) versus carcinomas nondiffuse proximal (3%) e difusa (0%) (p = 0,12). Não houve diferenças significativas nas frequências de mutação estavam presentes entre os outros genes individuais no painel. Dois componentes da via Wnt, APC Comprar e CTNNB1
, foram no total mutado mais frequentemente em carcinomas gástricos do que em tumores Gej (16% vs. 3%, p = 0,006). carcinomas gástricos mais frequentemente tinham mutações em 3 ou mais genes (11% vs. 2%; p = 0,044; Figura 4). Não há diferenças no envolvimento de vias oncogênicas foram observadas entre os dois locais, com base em padrões de mutação. A Figura 4 proporções de JGE e carcinomas gástricos com números de mutações totais e acionáveis ​​identificados. áreas escuras sólidos nas colunas representam casos com uma mutação, áreas alinhadas diagonais escuras representam casos com 2 mutações, e viu áreas representam casos com 3 ou mais mutações.
mutações potencialmente viáveis ​​
terapias direcionadas estão disponíveis ou em desenvolvimento para mutações que ocorrem nos seguintes genes:
AKT [25], BRAF
[26], ERBB2
[27], ErbB4
[28], FGFR1
[29], FGFR3
[30], FLT3
[31,32], IDH1
[33], JAK3
[31], KDR
[34,35], KRAS
[36], MET
[34], PDGFRA
[37], PIK3CA
[25], PTEN
[25], PTPN11
[38], RET
[39], SMO
[40]. As mutações nestes genes foram identificados em 32 casos (19%), incluindo 6 casos (4%) com 2 mutações e 3 casos (2%) com ≥3 mutações. A distribuição de mutações acionáveis ​​não foi significativamente diferente entre JGE e carcinomas gástricos. (P = 0,327; Figura 4)
prognóstico importância das mutações
ErbB4
mutações foram associados com sobrevida livre de doença pior (p = 0,018 ), enquanto houve uma tendência para a sobrevida livre de doença pior associada a mutações no ABL1
(p = 0,063) e JAK3
(p = 0,059). Nenhuma destas mutações foram decisivos para o prognóstico após a contabilização de idade, sexo, Lauren subtipo, estágio, grau e status da margem. Mutações no BRAF
(p < 0,001), FGFR3
(p < 0,001), FLT3
(p < 0,001) foram associados com sobrevida global pior na análise univariada como resultado de um único caso com mutações em todos os três destes genes.). BRAF
mutação permaneceu prognostically significativa após a contabilização de idade, sexo, Lauren subtipo, estágio, grau e status da margem (p = 0,002).
Comparação com os dados TCGA
Ao avaliar as regiões hotspot abrangidos pelo painel de sequenciação , o número total de genes mutados por caso foi similar entre a TCGA e estudar coortes (p = 0,659), incluindo quando comparando quer JGE (p = 0,399) ou gástrica (p = 0,845) tumores apenas (Figura 5A). Uma tendência no sentido de casos mais frequentes com mutações em genes ≥3 no estômago em comparação com a JGE também foi observado nos dados TCGA (12% contra 3%, p = 0,054). A frequência global de TP53
mutações não foi diferente entre a coorte de estudo, a coorte TCGA (p = 0,230). Não foram observadas diferenças em TP53
, KRAS
e APC
/CTNNB1
taxas de mutação entre JGE e carcinomas gástricos no conjunto de dados TCGA (Figuras 5B-D). Os genes mutados no conjunto de dados TCGA estão incluídos no arquivo adicionais 7: Tabela S7. Em relação às mutações com possível significado prognóstico identificados em nossa coorte, houve uma tendência para a sobrevida global pior associado com BRAF
mutações (p = 0,079), enquanto que nenhuma associação de prognóstico foi encontrado na coorte TCGA em associação com mutações em erbB4
, ABL1
, JAK3
, FLT3
ou FGFR3
. A Figura 5 A comparação da frequência de mutações de pontos de acesso dentro de identificadas na coorte de estudo utilizando a sequenciação do painel, em relação a mutações identificadas, utilizando o conjunto de sequenciação exome nos dados TCGA. A) As mutações através de pontos de acesso mutacionais nos 46 genes no painel, B) mutações em TP53
, C) mutações no KRAS
, e D) mutações na via de sinalização Wnt
componentes APC e CTNNB1
.
Discussão
Este estudo teve como objetivo investigar a utilidade de sequenciamento painel na identificação de alterações de nucleotídeo único em espécimes de ressecção gástrica rotineiramente processados, que poderiam ser usados ​​para orientar terapias direcionadas. Nós secundariamente procurou contrastar JGE e carcinomas gástricos através de sequenciação de profundidade alvo de um painel de 46 genes relacionados com o cancro, que revelou algumas diferenças no nível genômico que pode refletir diferentes perfis clínico-patológicas. Finalmente, também procurou comparar as freqüências de mutações obtidos utilizando este painel com os resultados de toda a sequenciação exome em The Cancer Genome Atlas.
Adenocarcinomas do trato gastrointestinal são molecularmente heterogênea e complexa [41-44]. No carcinoma gástrico, profunda sequenciamento do polimorfismo de nucleotídeo único e RNA matrizes de expressão revelaram recentemente anormalidades em várias vias, incluindo WNT, Hedgehog, ciclo celular, DNA reparação de danos e da transição epitelial-a-mesenquimal [45]. O uso atual de testes múltiplos de um único gene é insustentável dada essa complexidade, especialmente na presença de um número crescente de terapias direcionadas, recursos limitados e disponibilidade de tecido limitado. Assim, é desejável para investigar vários genes simultaneamente. Painel de sequenciação tem uma sensibilidade de cerca de 100% em relação a ensaios convencionais, tais como Sanger de sequenciação e métodos baseados em PCR, assim como uma capacidade de detectar SNVS e indels a frequências alélicas tão baixas como 5% e 20%, respectivamente, em ambos FFPE [21,46-48] e citologia espécimes [49-52]. sequenciamento painel alvo pode detectar aberrações nos genes relacionados com o cancro em cânceres gástrico precoce e lesões precursoras [53], e sua cobertura profunda poderia ser particularmente útil no câncer gástrico, fornecendo resultados adequados, apesar de material de biópsia escassa e a mistura de células tumorais com desmoplasia e células inflamatórias.
mutações condutoras putativos foram identificados na maioria dos carcinomas gástricos e JGE investigados neste estudo. De longe, o gene mutado mais frequentemente detectada foi
TP53, e estas mutações também foram detectadas nas lesões precursoras de palco e início utilizando o mesmo ensaio [53]. Várias mutações condutoras foram identificadas, em vários casos, reforçando a ideia de que múltiplos genes precisam de ser interrogados ao mesmo tempo em tumores genomicamente complexos, tais como adenocarcinomas gástricos. Um caso com uma mutação no BRAF
(bem como FLT3 e FGFR3) foi associado à sobrevida global pobre em ambos análise uni e multivariada. Esta constatação reflete uma tendência observada nos dados TCGA em relação a sobrevida global pobre em BRAF
tumores -mutated, sugerindo que em alguns casos o painel sequenciamento poderia ter um papel prognóstico.
Nós também foram capazes de detectar mutações potencialmente viáveis ​​em aproximadamente 20% dos casos, o que envolveu tanto genes ou caminhos onde terapias direcionadas estão disponíveis ou em desenvolvimento. Embora esse número seria idealmente superior, nosso ensaio abrangia apenas determinadas regiões hotspot destes genes, e não conta para alterações no número de cópias que também poderia fornecer informação útil. Outro refinamento dos referidos painéis de modo a incluir uma gama mais ampla de genes e segmentos de gene irá provavelmente aumentar a proporção de casos em que são identificadas mutações. Por exemplo, embora TP53
mutações ocorrem em todo o gene, o painel cobre principalmente exões 5-8, e alguns dos segmentos de genes que não foram sequenciados são mais frequentemente associados com a perda de p53 em imuno-histoquímica [54]. Este fato pode potencialmente explicar tanto as diferenças nas taxas de TP53
mutações e padrões de expressão imuno-histoquímica observadas no JGE e estômago. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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