Revue rétrospective en utilisant le séquençage profond ciblé révèle des différences mutationnels entre gastroesophageal jonction et carcinomas

gastrique Revue rétrospective en utilisant le séquençage profond ciblé révèle des différences mutationnels entre gastroesophageal jonction et carcinomes gastriques
Résumé de l'arrière-plan
adénocarcinomes tant de la jonction gastro-oesophagienne et de l'estomac sont moléculairement complexe, mais diffèrent en ce qui concerne l'épidémiologie, l'étiologie et la survie. Il existe peu de données comparant directement les fréquences des mutations nucléotidiques simples dans les gènes liés au cancer entre les deux sites. Le séquençage des panneaux de gènes ciblés peuvent être utiles dans la découverte de multiples aberrations génomiques en utilisant un seul test.
Méthodes
ADN à partir de 92 gastroesophageal jonction et 75 adénocarcinome gastrique spécimens de résection a été extrait à partir de tissus en paraffine fixés au formol. Le séquençage de profondeur ciblée de 46 gènes associés au cancer a été réalisée par PCR en émulsion suivie d'un séquençage à base de semiconducteur. jonction gastro-œsophagien et les carcinomes gastriques ont été contrastés par rapport aux profils mutationnels, immunohistochimie et hybridation de de in situ, ainsi que des données clinico correspondant.: Résultats
carcinomes de jonction gastro-oesophagien ont été associés à un plus jeune âge de type intestinal, plus fréquents histologie, plus fréquentes p53 surexpression, et pire encore la survie sans maladie sur l'analyse multivariée. Parmi tous les cas, 145 mutations ont été détectées dans 31 gènes. TP53 de les mutations étaient l'anomalie la plus courante détectée, et étaient plus fréquents dans les carcinomes gastro-oesophagien de jonction (42% contre 27%, p = 0,036). Des mutations dans le Wnt composants de la voie APC
et CTNNB1
étaient plus fréquents chez les carcinomes gastriques (16% contre 3%, p = 0,006), et les carcinomes gastriques étaient plus susceptibles d'avoir ≥3 mutations pilote détectées (11% par rapport à 2%, p = 0,044). Vingt pour cent des cas présentaient des mutations potentiellement réalisables identifiés. R132H et R132C mutations faux-sens dans le gène de l'IDH1 ont été observés, et sont les premières mutations rapportées de leur genre dans le carcinome gastrique.
Séquençage du Panel Conclusions du matériel de pathologie de routine peut fournir des informations mutationnelle sur plusieurs gènes du pilote, dont certains pour lesquels thérapies ciblées sont disponibles. taux divergents des mutations et des différences clinicopathologiques soutiennent une distinction entre les adénocarcinomes qui se posent dans la jonction gastro-oesophagienne et ceux qui se posent dans l'estomac approprié.
Mots-clés
gastriques gastroesophageal cancer cancer de jonction génomique du cancer gastrique séquençage du cancer gastrique Contexte
gastrique cancer représente plus de 10.000 décès par an aux États-Unis [1], et est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité par cancer dans le monde [2]. Bien que les carcinomes de la gastro- jonction (GEJ) ont été regroupées avec les carcinomes gastriques dans les registres du cancer et dans les essais cliniques pour les thérapies ciblées [3], les lésions de ces deux sites ont des caractéristiques cliniques distinctes. Les adénocarcinomes de l'estomac proprement sont principalement causée par l'infection de Helicobacter pylori [4] et sont en baisse dans incidence mondiale [1]. En revanche, les cancers gej sont plus associés à la maladie de reflux gastro-oesophagien [2-5] et de l'obésité [6], et l'incidence des carcinomes gej est restée stable au cours des 20 dernières années [7]. En outre, le pronostic des carcinomes gej a été noté pour être pire que les carcinomes gastriques, et il y a une incertitude quant à savoir si les carcinomes de gej devraient être organisées sous forme de tumeurs gastriques ou de l'œsophage [8]. Reconnaissant la distinction entre les carcinomes du GEJ, de l'œsophage et de l'estomac peut améliorer la collecte des données épidémiologiques significatives et entraîner une augmentation de la précision de la direction [9].
Plusieurs études ont noté des différences dans les caractéristiques moléculaires des carcinomes gej par rapport à ceux qui se posent ailleurs dans l'estomac. TP53 de les mutations sont plus fréquentes dans le GEJ que dans l'estomac distal, tandis que la perte d'hétérozygotie du locus du TP53 est également plus fréquente dans les tumeurs gej [10,11]. Des différences significatives dans les taux d'APC
et CDKN2A promoteur méthylation
ont également été décrites [12]. En outre, les différences dans APC
taux de mutation et l'expression des protéines, ainsi que des différences dans les profils d'expression génique globale entre les deux sites ont également été démontré [13-16] de. Essai des amplifications de l'ERBB2
( également connu sous le nom de HER2
) gène dans les cancers de jonction gastriques et gastro-oesophagien est maintenant pratique courante dans de nombreuses institutions [17]. De même, des mutations du conducteur, en particulier des substitutions de nucleotides uniques, en oncogènes et gènes suppresseurs de tumeur informe actuellement le traitement des adénocarcinomes d'autres sites, tels que le poumon et du côlon [18-20]. Comme d'autres cibles moléculaires sont découverts dans les sites de la maladie, des dosages efficaces seront nécessaires pour déterminer la susceptibilité des cancers à un traitement ciblé.
Séquençage de nouvelle génération peuvent être utilisés dans un avenir proche pour interroger plusieurs gènes dans un échantillon unique, et ces données pourrait être utilisé pour informer les cliniciens des mutations du pilote et de guider le traitement ciblé. séquençage du panneau ciblé est une forme de séquençage de nouvelle génération où les variantes d'un seul nucléotide sont détectées dans un nombre limité de loci génomiques précédemment déterminé, qui, par intention sont souvent prognostically et thérapeutique critique. séquençage du Panel permet le multiplexage d'échantillons, et la couverture profonde (> 500x) facilite l'analyse du matériel de modèle suboptimale à partir de tissus d'archives et des échantillons avec cellularité tumorale faible. L'ensemble plus restreint de gènes permet également un traitement plus rapide des échantillons et analyse bioinformatique. Ainsi, des résultats concrets peuvent être obtenus en quelques jours, plutôt que les semaines, par rapport à génome et Exome approches entières. Toutefois, les données est limité par la sélection de gènes intrinsèquement biaisée et l'incapacité à détecter les changements du nombre de copies, de la perte d'hétérozygotie et des réarrangements structuraux tels que les fusions de gènes. Ainsi, l'utilisation efficace de NGS exige une évaluation minutieuse des technologies, des limites d'analyse, les exigences du modèle, ainsi que la recherche et les questions cliniques à l'étude.
Les objectifs de cette étude étaient de sonder l'utilité du séquençage du panneau sur paraffin- fixés au formol intégré (FFPE) les tissus, et de comparer GEJ cliniquement annotée et carcinomes gastriques par séquençage du panneau des points chauds de 46 gènes du cancer. Nous avons également cherché à comparer les fréquences des mutations identifiées avec le séquençage du panneau de hotspots contre séquençage exome, en utilisant des données publiquement disponibles auprès de The Cancer Genome Atlas.
Méthodes
cas de sélection et de récupération des données clinico
éthique institutionnels approbation a été obtenue à l'Université de Cancer Agency /Colombie-Britannique Colombie-Britannique comité d'éthique de la recherche (# H07-2807), et de la recherche a été effectuée conformément à la déclaration d'Helsinki. Les cas de cancer de l'estomac ont été récupérés à partir des archives départementales de l'Agence de la Colombie-Britannique Cancer (BCCA), un centre de référence provincial. Les critères d'inclusion étaient référence à l'agence entre 2004 et 2010, disponible tissus FFPE de la résection chirurgicale de la tumeur primaire, les données clinicopathologiques complets, y compris les résultats cliniques sur le suivi, et l'absence de maladie métastatique à la présentation. Les biopsies de lésions primaires et métastatiques ont été exclus en raison de l'absence de données complètes pathologiques. JGO emplacement a été défini comme étant des lésions avec un épicentre à moins de 5 cm de l'extrémité proximale des plis Rugal gastriques [21]. Aucune distinction n'a été faite entre les tumeurs en ce qui concerne l'emplacement de leur épicentre dans les 5 cm du GEJ (à savoir le type Siewert n'a pas été enregistré) [22]. Les carcinomes situés exclusivement dans l'oesophage ont été exclus, selon les plus récents critères de l'OMS [21]. Toutes les tumeurs gastriques situées en aval de la GEJ ont été binned ensemble pour cette étude. les données clinicopathologiques ont été recueillies rétrospectivement par l'examen des dossiers des patients par un membre de l'équipe clinique, ainsi que par l'examen des rapports de pathologie. construction
microréseau tissulaire, l'immunohistochimie et l'hybridation de situ
construction de microréseaux de tissus en était réalisée à l'aide de deux noyaux de 0,6 mm à partir de deux sections séparées de la tumeur. La coloration immunohistochimique pour p53 (1: 100; clone DO-7, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), Baf250a (1:75; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), et la réparation des mésappariements (MMR) protéines, y compris hMLH1 (01:25; clone ES05, ​​Leica, Wetzlar, Allemagne), MSH2 (1: 5; clone 25D12, Leica), hMSH6 (1: 300; clone PU29, Leica), et hPMS2 (1: 150; clone MOR4G, Leica ) a été effectuée sur la plate-forme XT (Ventana). L'expression de p53 a été marqué comme absent (< 1% coloration nucléaire), normal (1-60% coloration nucléaire de toute intensité), ou la surexpression (> 60% coloration nucléaire de toute intensité). protéines Baf250a et ROR ont été marqués comme intacte (≥1% coloration) ou négative (< 1% coloration) basée sur l'expression des protéines spécifiquement dans les cellules tumorales (par exemple l'expression immunitaire et stromale a été ignorée). ERBB2
argent de situ l'hybridation (SISH) en a été réalisée en utilisant la boîte automatique /ISH plate-forme de coloration IHC XT (Ventana). A ERBB2
: rapport CEP17 < 2.0 a été classé comme non-amplifié, et une valeur ≥2.0 comme amplifié. Énumération des signaux Sish était basée sur des protocoles établis [17].
Traitement des échantillons d'ADN, le séquençage, et la variante appelant
Dans chaque cas, des diapositives hématoxyline et l'éosine ont été utilisés pour guider macrodissection ou défilement du tissu tumoral de FFPE glisse suivant décrivant des tumeurs par un anatomopathologiste. L'ADN de la tumeur de chaque cas a été extrait en utilisant un kit d'extraction d'ADN Qiagen FFPE (Qiagen, Venlo, Pays-Bas); aucun ADN a été extrait de la lignée germinale. Extrait l'ADN a été quantifié en utilisant le test QUBIT HS dsDNA (Life Technologies Gaithersburg, MD, USA); tous les cas ont un minimum de 10 ng d'ADN extrait à partir FFPE, conformément à une exigence précédemment pour l'essai [21]. Un minimum A260 /280 rapport de 1,8 a été nécessaire pour chaque échantillon d'ADN. Bibliothèque amplicon construction d'ADN a été effectuée en utilisant des amorces d'ADN à partir de la v1 ion Ampliseq ™ Cancer Panel point sensible (Life Technologies). Le kit se compose de paires 207 d'amorces qui couvrent 739 hotspots au sein de 46 gènes liés au cancer (fichier supplémentaires 1: Tableau S1). les bibliothèques d'amplicon indexées ont été rassemblées pour une réaction en chaîne par polymérase et l'émulsion de séquençage sur la plate-forme Ion Torrent PGM (Life Technologies). Un minimum d'au moins 500x paire de bases couverture a été nécessaire pour chaque cas. appelant la variante a été réalisée en utilisant la v2.2 Torrent Variant Caller (Life Technologies) en utilisant le génome de référence hg19. variantes Uniquement présent à des fréquences ≥5% ont été considérés. Étant donné que l'ADN de la lignée germinale est indisponible pour la comparaison, des variantes ont été exclues d'éventuelles mutations somatiques comme si elles ont été identifiées comme des polymorphismes d'un seul nucléotide avec des fréquences alléliques moyennes >.... 0 au sein de la base de données dbSNP (www NCBI NLM NIH gov /SNP); (/Www. Ncbi. Nlm. Nih. Gov PubMed) Comparaison avec le Cancer Genome Atlas (TCGA) de. Données leur statut de variantes non germinale a été confirmée en utilisant une recherche PubMed
Curated appels de mutation somatique pour 281 TCGA échantillons d'adénocarcinome de l'estomac avec des sites anatomiques connus ont été récupérés à partir du portail de données TCGA (http:... //TCGA-données nci nih gov /TCGA /) le 19 Février 2014. mutations codant pour des protéines situées dans les régions amplifiées par le v1 Panel Ion Ampliseq ™ Cancer Hotspot dans chacun des 46 gènes ont été obtenus pour les cas et stratifiées par emplacement (60 cardia /proximale et gastroesophageal jonction contre
221 fundus /corps, antrum /distale et de l'estomac NOS). Copier des données numériques, des données d'expression de l'ARN, et les données d'expression de protéines ne sont pas considérés comme notre propre test ne détecte que des variants nucléotidiques simples (SNVs) et petites insertions /suppressions de paires de bases (indels). Les fréquences des mutations, quel que soit le type de mutation, ont été comparés par rapport au séquençage du panneau multiple hotspot que nous avons réalisé.
Analyse des données
Mann-Whitney U-tests et des tests t étudiants ont été utilisés pour comparer les variables linéaires, le cas échéant. Fisher tests exacts et chi-carré, le cas échéant, ont été utilisés pour comparer les valeurs catégoriques. Les analyses de survie ont été effectuées à l'aide du log-rank (Kaplan-Meier) et risques proportionnels de Cox tests. Les 46 gènes du panneau ont été cartographiés à l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et génomes (KEGG) [22,23] et le programme d'analyse Pathway Ingenuity® intégré (Qiagen) pour identifier les voies oncogéniques et des réseaux enrichis pour les mutations, et de tester des différences statistiquement significatives entre gastroesophageal jonction et spécimens d'adénocarcinome gastrique. les valeurs P ont été corrigées pour des tests multiples en utilisant la correction Benjamini-Hochberg (BH) [24]. Tous les tests statistiques ont été deux à queue et un P
valeur de < .05 A été considérée comme statistiquement significative. Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel SPSS Statistics (v22, IBM, Armonk, NJ, USA) et le v.2.15.1 R de langage statistique (R équipe de base (2012) R:.. Un langage et un environnement pour le calcul statistique R Fondation pour . calcul statistique, Vienne, Autriche ISBN 3-900051-07-0, URL http:... Résultats de //www R-projet org /)
dans les archives départementales à la BCCA, 229 échantillons de résection de carcinomes gastriques et gej ont été obtenus 2004-2010 et étaient disponibles pour la construction d'un tissu microarray. ADN était disponible pour l'extraction de 176 cas. Aucune donnée clinicopathologique était disponible pour la corrélation dans 6 cas. Trois cas avaient une maladie métastatique documentée dans un mois de la présentation, et ceux-ci ont été exclus de l'analyse. Sur les 167 cas restants, 92 provenaient de la jonction gastro-oesophagien et 75 provenaient du reste de l'estomac (Figure 1). Figure 1 Débit schéma détaillant la sélection des cas et l'exclusion pour la cohorte de l'étude.
différences clinicopathologiques entre GEJ et carcinomes gastriques
Les caractéristiques clinico-pathologiques de ces cas sont résumés dans le tableau 1 et les données cliniques anonymisées sont fournis dans un fichier supplémentaire (fichier supplémentaires 2: Tableau S2). carcinomes gej ont été associés à un plus jeune âge à la résection, de type intestinal plus fréquentes et moins fréquentes diffuse histologie, plus fréquentes p53 surexpression et une perte moins fréquente de l'expression de p53, plus fréquente maladie de stade III, moins fréquentes maladies de stade I, et les récidives plus fréquentes. La survie sans maladie a été significativement pire chez les patients atteints de carcinomes de gej (Figure 2A), bien que les deux cohortes ne sont pas statistiquement différents en termes de survie globale (figure 2B). D'autres caractéristiques clinicopathologiques étaient similaires entre les tumeurs des deux endroits, y compris T-stade, la participation de la marge de résection, ERBB2 de l'amplification, et MMR perte de protéines (tableau 1). La proportion des carcinomes diffuses dans la classification Lauren) était similaire entre les deux sites. l'analyse du sous-groupe de seulement carcinomes de type intestinal a montré des différences persistantes entre GEJ et les carcinomes gastriques dans la survie sans maladie et de l'expression de p53. Les différences d'âge, l'expression de p53 et les résultats ont persisté lorsque l'on considère seulement les carcinomes de type intestinal, ainsi que lorsque les tumeurs ont été stratifiés en trois sous-types (proximal non diffuse, diffuse et distale non-diffus) comme suggéré par Shah et al. [16] (fichier supplémentaire 3: Tableau S3) .Table 1 Résumé des variables clinocopathologic dans les variables clinicopathologiques de la cohorte au sein de cardia et non-cardia adénocarcinomes
variables clinicopathologiques
jonction gastro-oesophagien (n = 92)
non-cardia (n = 75)
global (n = 167)
p
âge (moyenne, années)
61,5 + /- 9.6 [33-80]
66,3 +/- 11,9 [33-84]
63,7 +/- 10,9 [33-84]
0,001
Sex
0,297
Homme
70 (76)
51 (68)
121 (73)
22 (24) de Femme
24 (32)
46 (27)
histologiques sous-type (Lauren)
0,008
Intestinal
65 (71)
36 (48)
101 (60)
diffuse
15 (16)
26 (35)
41 (25)
mixte
12 (13)
13 (17)
25 (15)
Stage (AJCC)
0,031
IA-B
10 (11)
19 (25)
29 (17)
IIA-B
60 (65)
45 (60)
105 (63)
III-AC
22 (24)
11 (15)
33 (20) catégorie de circuit
0,415
bien différencié (G1)
4 (5)
10 (6)
Modérément différencié (G2)
39 (42)
25 (33)
64 (38)
peu différencié (G3)
47 (51)
46 (61)
93 (56)
marge résection
0,306
uninvolved
74 (80)
65 (87)
139 (83)
Participez
18 (20)
10 (13)
28 (17)
ERBB2 amplification
0,654
Absent
78 (85)
66 (88)
144 (86)
Présenter
14 (15)
9 (12)
23 (14)
BAF250a (ARID1A) expression
0,111
Intact
73 (79)
51 (68)
124 (74)
19 (21)
24 (32)
43 (26)
expression de p53 de
Absent 2.8x10 -4
0 - absent
32 (35)
47 (63)
79 (47)
1 - normale (1-60%)
17 (19)
14 (19)
31 (19)
2 - augmentation (> 60%)
43 (47)
14 (19)
57 (34)
protéines de réparation des mésappariements
0,244
Intact 77 (84)
57 (76)
135 (80)
Abnormal 15 (16)
18 (24)
33 (20)
Nombre de récurrences
57 (62)
32 (43)
89 (53)
0.019
médians de survie sans progression (mois)
12
18
15
Nombre de décès
69 (75)
48 (64)
117 (70)
0.130
médians de survie globale (mois )
18,0
23,0
20,0
Figure 2 Comparaison de la survie sans maladie et la survie globale entre les patients atteints de gastro-oesophagien et des carcinomes gastriques. A) La survie sans maladie était significativement plus mauvais pour les carcinomes gastro-oesophagien (lignes continues) par rapport aux carcinoms gastriques (lignes en pointillés), log-rank test; p = 0,002, bien que B) la survie globale ne différait pas entre les deux sites de la maladie (Log-rank test;. p = 0,225)
En analyse multivariée, l'emplacement GEJ était indépendamment associée à une survie sans maladie pire (risques proportionnels de Cox = [intervalle de confiance à 95%: 1,25 à 3,44] 2,08, p = 0,005) ainsi que l'état de la marge et l'instabilité des microsatellites (fichier complémentaire 4: Tableau S4). L'âge, le grade tumoral et la participation de la marge étaient indépendamment pronostique de la survie globale (fichier supplémentaire 5: Tableau S5).
Mutations identifiées avec le
du panneau de cancer Parmi tous les cas, 145 mutations ont été détectées dans 31 gènes, avec 75 mutations détectées parmi 57 des tumeurs de la JGO, et 70 mutations détectées chez 43 des tumeurs gastriques (figure 3). Aucune mutation n'a été détectée chez 35 (38%) et 32 ​​(43%) des tumeurs de l'estomac et GEJ, respectivement.
TP53 étaient les gènes les plus fréquemment mutés, avec des variantes identifiées dans 59 des 167 cas (35%). Les gènes suivants ont été le plus fréquemment muté PI3KCA
(6%) (5%) de CTNNB1 (5%) et de KRAS (4%) de SMAD4. D'autres variantes incluses mutations hotspot dans (2 cas) de IDH1, JAK3
(3 cas), et FLT3
(2 cas). Une seule mutation a été identifiée dans 70 cas (42%), 2 mutations ont été identifiées dans 20 cas (12%) et ≥3 mutations ont été identifiées dans 10 cas (6%). Figure 3 mutations somatiques identifiées dans la jonction gastro-oesophagien et des carcinomes gastriques. TP53 de les mutations ont été identifiées dans une plus grande proportion de tumeurs de jonction gastro-oesophagien, tandis que des anomalies dans APC
/CTNNB1
sont survenus plus fréquemment dans les tumeurs gastriques. blocs noirs représentent tronquant mutations, tandis que les blocs gris représentent des mutations faux-sens. Les cas et les gènes dont les mutations ne sont pas identifiées ne sont pas inclus.
Aucun mutations ont été identifiées dans les régions hotspot de ALK
, CSF1R
, EGFR
, FGFR2
, HNF1A
, HRAS
, JAK2
, MPL
, NPM1
, NRAS
, SRC
, STK11
ou VHL
. Tous les appels de variantes sont disponibles dans les données supplémentaires (fichiers supplémentaires 6: Tableau S6). Différences de mutations dans l'entre GEJ et de l'estomac
TP53 de les mutations ont été identifiées dans 39 des 92 (42%) des tumeurs gej et dans 20 des 75 (27%), les tumeurs gastriques (p = 0,036). Lorsque subdivisé en 3 sous-types proposés par Shah et al. [16], TP53 de les mutations sont survenus plus fréquemment dans les cancers non diffus proximales (44%) que dans les cancers diffus (37%) et les cancers distales non diffus (20%; p = 0,024). Cette classification a également montré des mutations plus fréquentes dans KRAS
les cancers du sein non diffus distal (12%) par rapport aux non diffus proximale (3%) et diffus (0%), les cancers (p = 0,12). Aucune différence significative dans la fréquence des mutations étaient présents parmi les autres gènes individuels dans le panneau. Deux composants de la voie Wnt, APC
et CTNNB1
, étaient au total muté plus fréquemment dans les carcinomes gastriques que dans les tumeurs gej (16% contre 3%, p = 0,006). carcinomes gastriques ont le plus souvent des mutations dans les gènes de 3 ou plus (11% contre 2%, p = 0,044; figure 4). Aucune différence dans l'implication des voies oncogéniques ont été notées entre les deux sites, en fonction des profils mutationnels. Figure 4 Proportions de GEJ et les carcinomes gastriques avec nombre de mutations totales et une action identifiés. zones sombres solides dans les colonnes représentent des cas avec 1 mutation, les zones bordées diagonales sombres représentent des cas avec 2 mutations, et repéré les zones représentent des cas avec 3 ou plusieurs mutations.
mutations potentiellement réalisables
Les thérapies ciblées sont disponibles ou en développement pour mutations se produisant dans les gènes suivants:
AKT [25], [26], ERBB2
BRAF [27], ERBB4
[28], FGFR1
[29], FGFR3
[30], [31,32], IDH1
[33], JAK3
[31], KDR
FLT3 [34,35], [36], MET
KRAS
[34], PDGFRA
[37], PIK3CA
[25], PTEN
[25], PTPN11
[38], RET
[39], SMO
[40]. Les mutations dans ces gènes ont été identifiés dans 32 cas (19%), dont 6 cas (4%) avec 2 mutations et 3 cas (2%) avec ≥3 mutations. La répartition des mutations à une action n'a pas été significativement différente entre GEJ et carcinomes gastriques. (P = 0,327; Figure 4)
signification pronostique des mutations
les mutations ErbB4 ont été associées à de la survie sans maladie pire (p = 0,018 ), alors qu'il y avait une tendance à aggraver la survie sans maladie associée à des mutations (p = 0,063 de ABL1) et (p = 0,059 de JAK3). Aucune de ces mutations étaient prognostically significative après prise en compte de l'âge, le sexe, Lauren sous-type, le stade, le grade et le statut des marges. Des mutations dans (p <de 0,001) de BRAF, (p < 0,001)
FGFR3, (p < 0,001)
FLT3 ont été associés à la survie globale pire sur l'analyse univariée à la suite d'un seul cas des mutations dans ces trois gènes.). BRAF de la mutation est restée prognostically significative après prise en compte de l'âge, le sexe, Lauren sous-type, le stade, le grade et le statut des marges (p = 0,002) Comparaison avec les données TCGA
Lors de l'évaluation des régions hotspot couvertes par le panneau de séquençage. , le nombre total de gènes mutés par cas était similaire entre le TCGA et l'étude des cohortes (p = 0,659), y compris lorsque l'on compare soit GEJ (p = 0,399) ou gastrique (p = 0,845) tumeurs seulement (figure 5A). Une tendance à des cas plus fréquents avec des mutations dans les gènes ≥3 dans l'estomac par rapport à l'GEJ a également été observée dans les données TCGA (12% contre 3%, p = 0,054). La fréquence globale des TP53 de les mutations ne différait pas entre la cohorte de l'étude et la cohorte TCGA (p = 0,230). Aucune différence dans TP53
, KRAS
, et les taux de mutation d'APC
/CTNNB1 entre GEJ et carcinomes gastriques ont été observés dans l'ensemble de données TCGA (figures 5B-D). Les gènes mutés dans l'ensemble de données TCGA sont incluses dans les fichiers supplémentaires 7: Tableau S7. En ce qui concerne les mutations avec possible signification pronostique identifié dans notre cohorte, il y avait une tendance à la survie globale pire associée à BRAF de les mutations (p = 0,079), alors qu'aucune association pronostique n'a été trouvée dans la cohorte TCGA en association avec des mutations dans ERBB4
, ABL1
, JAK3
, FLT3
ou FGFR3
. Figure 5: Comparaison de la fréquence des mutations dans les points chauds identifiés dans la cohorte de l'étude en utilisant le séquençage du panneau, par rapport à des mutations identifiées en utilisant le séquençage de l'exome ensemble dans les données TCGA. A) Les mutations à travers les points chauds mutationnels dans les 46 gènes dans le panneau des mutations dans le signalisation Wnt composants APC
et CTNNB1
mutations KRAS
, B) Les mutations dans TP53
, C) et D) .
Discussion
Cette étude visait à sonder l'utilité du séquençage du panneau pour identifier les changements nucléotidiques simples dans régulièrement traitées échantillons de résection gastrique, qui pourraient être utilisés pour guider les thérapies ciblées. Nous secondairement cherché à opposer GEJ et carcinomes gastriques par séquençage en profondeur ciblée d'un panel de 46 gènes liés au cancer, qui a révélé quelques différences au niveau génomique qui peuvent refléter les différents profils clinicopathologiques. Enfin, nous avons également cherché à comparer les fréquences des mutations obtenues à l'aide de ce panneau avec des résultats du séquençage de l'exome ensemble dans The Cancer Genome Atlas. De adénocarcinomes du tractus gastro-intestinal sont moléculairement hétérogène et complexe [41-44]. Dans le cancer gastrique, profonde séquençage du polymorphisme nucléotidique et d'ARN réseaux d'expression ont récemment révélé des anomalies dans plusieurs voies, y compris WNT, Hedgehog, le cycle cellulaire, l'ADN de réparation des dommages et la transition épithéliale-mésenchymateuse [45]. L'utilisation actuelle de multiples tests de gènes unique est intenable compte tenu de cette complexité, en particulier en présence d'un nombre croissant de thérapies ciblées, des ressources limitées, et la disponibilité de tissu limité. Ainsi, il est souhaitable d'étudier plusieurs gènes simultanément. Le séquençage du panneau a une sensibilité voisine de 100% par rapport aux analyses classiques telles que le séquençage de Sanger et des méthodes basées sur la PCR, ainsi qu'une capacité à détecter SNVs et INDEL à des fréquences allèliques aussi faibles que 5% et 20%, respectivement, à la fois FFPE [21,46-48] et cytologie spécimens [49-52]. séquençage du panneau ciblé peut détecter des aberrations dans les gènes liés au cancer dans les cancers précoces gastriques et des lésions précurseurs [53], et sa couverture profonde pourrait être particulièrement utile dans le cancer gastrique en fournissant des résultats satisfaisants malgré le matériel de biopsie peu et le mélange de cellules tumorales avec desmoplasie et les cellules inflammatoires.
mutations du pilote putatifs ont été identifiés dans la majorité des carcinomes gastriques et JGO étudiés dans cette étude. De loin le gène muté le plus fréquemment détecté était TP53
, et ces mutations ont également été détectés dans les lésions de stade et précurseurs précoces en utilisant le même dosage [53]. Des mutations multiples du pilote ont été identifiées dans plusieurs cas, ce qui renforce l'idée que les gènes multiples doivent être interrogés à la fois dans les tumeurs génomiquement complexes tels que les adénocarcinomes gastriques. Un cas à une mutation BRAF
(ainsi que FLT3 et FGFR3) a été associée à la survie globale pauvre à la fois sur l'analyse univariée et multivariée. Ce constat reflète une tendance observée dans les données TCGA vers la survie globale pauvres dans les tumeurs -mutated de BRAF, ce qui suggère que, dans certains cas, le séquençage du panneau pourrait avoir un rôle pronostique.
Nous avons également été en mesure de détecter des mutations potentiellement réalisables dans environ 20% des cas, ce qui impliquait soit des gènes ou des voies où les thérapies ciblées sont disponibles ou en développement. Bien que ce nombre devrait idéalement être plus élevé, notre analyse ne couvrait que certaines régions hotspot de ces gènes, et n'a pas tenu compte du nombre de copies des modifications qui pourraient également fournir des informations utiles. Le perfectionnement de ces panneaux pour inclure une gamme plus large de gènes et des segments de gènes vont probablement augmenter la proportion de cas dans lesquels des mutations sont identifiées. Par exemple, bien que TP53 de les mutations se produisent à travers le gène, le panneau couvre principalement les exons 5-8, et certains des segments de gènes qui ne sont pas séquencées sont plus fréquemment associée à une perte de p53 sur immunohistochimie [54]. Ce fait peut potentiellement expliquer à la fois les différences dans les taux de TP53 de les mutations et les modes d'expression immunohistochimique observées dans la GEJ et de l'estomac. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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