revisión retrospectiva mediante secuenciación profunda dirigida revela diferencias mutacionales entre unión gastroesofágica y carcinomas gástricos

Estudio retrospectivo usando la secuenciación de profundidad dirigida revela diferencias mutacionales entre unión gastroesofágica y carcinomas gástricos
Abstract
Antecedentes
adenocarcinomas tanto de la unión gastroesofágica y el estómago son complejos molecularmente, pero difieren con respecto a la epidemiología, la etiología y la supervivencia. Hay pocos datos que comparen directamente las frecuencias de mutaciones de un solo nucleótido en genes relacionados con el cáncer entre los dos sitios. La secuenciación de los paneles de genes específicos puede ser útil en el descubrimiento de múltiples aberraciones genómicas utilizando una sola prueba.
Métodos
ADN de unión gastroesofágica 92 y 75 muestras de resección adenocarcinoma gástrico fue obtenida a partir de tejido incluido en parafina y fijado en formalina. Targeted secuenciación profunda de 46 genes relacionados con el cáncer se realizó mediante PCR emulsión seguida de la secuenciación basada en semiconductor. unión gastroesofágica y carcinomas gástricos se contrastaron con respecto a los perfiles mutacionales, inmunohistoquímica y la hibridación in situ
, así como los datos clínico-patológicas correspondiente.
: Resultados de la unión gastroesofágica carcinomas se asociaron con una menor edad, más frecuentes de tipo intestinal histología, la sobreexpresión de p53 más frecuentes, y peor supervivencia libre de enfermedad en el análisis multivariable. Entre todos los casos, se detectaron 145 mutaciones en 31 genes. TP53
mutaciones fueron la anomalía más frecuente detectada, y fueron más frecuentes en los carcinomas de la unión gastroesofágica (42% vs. 27%, p = 0,036). Las mutaciones en el Wnt componentes de la vía de APC Opiniones y CTNNB1
eran más comunes entre los carcinomas gástricos (16% frente al 3%, p = 0,006), y los carcinomas gástricos eran más propensos a tener ≥ 3 mutaciones detectadas conductor (11% vs. 2%, p = 0,044). El veinte por ciento de los casos tenían mutaciones potencialmente viables identificadas. Se observaron R132H y sin sentido R132C mutaciones en el gen Idh1
, y son las primeras mutaciones reportadas de su tipo en el carcinoma gástrico.
Conclusiones
secuenciación Panel de material patología rutina puede proporcionar información de mutaciones en varios genes conductor, incluyendo algunos para los que las terapias dirigidas están disponibles. diferentes tasas de mutaciones y diferencias clínico-patológicas apoyan una distinción entre los adenocarcinomas que surgen en la unión gastroesofágica y aquellos que surgen en el estómago adecuada.
Palabras clave
gástricos cáncer gastroesofágico cáncer gástrico cruce de secuenciación genómica del cáncer El cáncer gástrico fondo gástrico
el cáncer de más de 10.000 muertes al año en los Estados Unidos [1], y es la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [2]. A pesar de que los carcinomas de la unión gastroesofágica (UGE) se han agrupado con los carcinomas gástricos en los registros de cáncer y en ensayos clínicos de terapias dirigidas [3], las lesiones en estos dos sitios tienen características clínicas distintas. Los adenocarcinomas de estómago adecuada son causados ​​principalmente por la infección por Helicobacter pylori
[4] y están disminuyendo en incidencia mundial [1]. Por el contrario, los cánceres de la UGE son los más asociados con la enfermedad de reflujo gastroesofágico [2-5] y la obesidad [6], y la incidencia de carcinomas de la UGE se ha mantenido estable durante los últimos 20 años [7]. Además, el pronóstico de los carcinomas de la UGE se ha señalado a ser peor que los carcinomas gástricos, y hay incertidumbre en cuanto a si los carcinomas Gej deben disputarse en tumores de estómago y el esófago [8]. Reconociendo la distinción entre los carcinomas de la UGE, el esófago, el estómago y puede mejorar la recogida de datos epidemiológicos significativos y resultar en una mayor precisión de la gestión [9].
Varios estudios han observado diferencias en las características moleculares de los carcinomas Gej frente a los que surgen en el estómago en otros lugares. TP53
mutaciones son más frecuentes en la UGE que en el estómago distal, mientras que la pérdida de heterocigosidad del TP53
locus También es más común en los tumores Gej [10,11]. diferencias significativas en las tasas de metilación del promotor de APC Opiniones y CDKN2A
También se han descrito [12]. Además, las diferencias en las tasas de mutación APC
y expresión de la proteína, así como las diferencias en los perfiles de expresión génica global entre los dos sitios también se han demostrado [13-16].
Ensayos de amplificaciones de la ErbB2
( también conocido como HER2
) de genes en el cáncer de unión gástricas y gastroesofágico es ahora práctica habitual en muchas instituciones [17]. Del mismo modo, las pruebas de mutaciones del conductor, en particular las sustituciones de nucleótido único, en oncogenes y genes supresores de tumores actualmente informa tratamiento en los adenocarcinomas de otros sitios tales como el pulmón y colon [18-20]. Como otras dianas moleculares se descubren a través de sitios de la enfermedad, serán necesarios ensayos eficaces para determinar la susceptibilidad de cáncer 'para el tratamiento dirigido.
Secuenciación de próxima generación se puede utilizar en un futuro próximo para interrogar múltiples genes en una sola muestra, y estos datos podría utilizarse para informar a los médicos de mutaciones del conductor y guiar el tratamiento específico. la secuenciación del panel dirigida es una forma de secuenciación de próxima generación, donde se detectan variantes de nucleótido único en un número limitado de loci genómico previamente determinado, que por la intención es a menudo el pronóstico y terapéuticamente crítico. secuenciación del panel permite la multiplexación de las muestras, y la cobertura de profundidad (> 500 veces) facilita el análisis del material de la plantilla subóptima de archivo de tejidos y muestras con baja celularidad del tumor. El conjunto más reducido de genes también permite el rápido procesamiento de las muestras y el análisis bioinformático. Por lo tanto, los resultados de acciones concretas se pueden obtener en cuestión de días, en lugar de las semanas, en comparación con el genoma y el exoma enfoques integrales. Sin embargo, los datos está restringido por la selección inherentemente sesgada de genes, y la incapacidad para detectar los cambios de número de copias, la pérdida de heterocigosidad, y reordenamientos estructurales, tales como fusiones de genes. Por lo tanto, el uso efectivo de NGS requiere una cuidadosa evaluación de las tecnologías, las limitaciones del ensayo, los requisitos de la plantilla, y la investigación y cuestiones clínicas que se examinan.
Los objetivos de este estudio fueron investigar la utilidad de la secuenciación del panel sobre parafina fijado en formol incrustado el tejido (FFPE), y comparar la UGE clínicamente anotado y carcinomas gástricos a través del panel de secuenciación de los puntos calientes de 46 genes del cáncer. Otro objetivo fue comparar las frecuencias de mutaciones identificadas con la secuenciación del grupo de puntos de acceso contra la secuenciación del exoma, a partir de datos públicamente disponible de The Atlas del Genoma del Cáncer.
Métodos
la caja de selección y recuperación de datos clínico-
Ética Institucional la aprobación se obtuvo de la Universidad de Columbia Cancer Agency británica /British Columbia junta ética de investigación (# H07-2807), y la investigación se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki. Los casos de carcinoma gástrico fueron recuperados de archivos del departamento de la Agencia del Cáncer de Columbia Británica (BCCA), un centro de referencia provincial. Los criterios de inclusión fueron referido a la agencia entre 2004 y 2010, disponible tejidos FFPE de la resección quirúrgica del tumor primario, los datos clínico-patológicas completas incluyendo los resultados clínicos en el seguimiento, y la ausencia de enfermedad metastásica en el momento de presentación. Las muestras de biopsia de lesiones primarios y metastásicos fueron excluidos debido a la falta de datos completos patológicos. UGE ubicación se definió como lesiones con un epicentro a 5 cm del extremo proximal de los pliegues rugosos gástricas [21]. No se hace distinción entre los tumores con respecto a la ubicación de su epicentro dentro de los 5 cm de la UGE (es decir, el tipo Siewert no se registró) [22]. Se excluyeron los carcinomas localizados exclusivamente en el esófago, según los más recientes criterios de la OMS [21]. Todos los tumores gástricos situados distal a la UGE se binned juntos para este estudio. se recogieron los datos clínico-patológico de forma retrospectiva mediante la revisión de historias clínicas por un miembro del equipo clínico, así como mediante la revisión de los informes de patología.
Tissue microarrays construcción, inmunohistoquímica y la hibridación in situ

construcción de microarrays de tejido se llevado a cabo utilizando dos núcleos de 0,6 mm a partir de dos secciones separadas de tumor. La tinción inmunohistoquímica para p53 (1: 100; clon DO-7, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), Baf250a (1:75; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y la falta de coincidencia de reparación (MMR), incluyendo proteínas hMLH1 (1:25; clon ES05, ​​Leica, Wetzlar, Alemania), MSH2 (1: 5; clon 25D12, Leica), hMSH6 (1: 300; PU29 clon, Leica), y hPMS2 (1: 150; clon MOR4G, Leica ) se ha realizado en la plataforma XT (Ventana). La expresión de p53 se obtuvo como ausente (< 1% de tinción nuclear), normal (1 a 60% de tinción nuclear de cualquier intensidad), o sobreexpresión (> 60% de tinción nuclear de cualquier intensidad). proteínas Baf250a y MMR se anotó como intacta (≥1% de tinción) o negativo (< 1% de tinción), basado en la expresión de proteínas específicamente en las células tumorales (es decir, inmune y del estroma de expresión se ignoran). ErbB2 sobre Silver in situ
hibridación (SISH) se realizó utilizando la plataforma XT automática IHC /ISH tinción (Ventana). Un ErbB2
: relación CEP17 < 2,0 se clasificó como no amplificada, y un valor ≥2.0 como amplificado. La enumeración de las señales sish se basó en los protocolos establecidos [17].
Procesamiento de muestras de ADN, secuenciación, y la variante de llamar
En cada caso, hematoxilina y eosina diapositivas se utilizan para guiar macrodissection o desplazamiento de tejido tumoral de FFPE desliza siguiente delineando los tumores por un anatomopatólogo. ADN tumoral de cada caso se extrajo utilizando el kit de extracción de ADN Qiagen FFPE (Qiagen, Venlo, Países Bajos); Se extrajo el ADN de la línea germinal no. El ADN extraído se cuantificó usando el ensayo QUBIT SA ADN de doble cadena (Life Technologies Gaithersburg, MD, EE.UU.); todos los casos tenían un mínimo de 10 ng de ADN extraído de FFPE, de acuerdo con un requisito se informó anteriormente para el ensayo de [21]. Se requirió una relación mínima A260 /280 de 1,8 para cada muestra de ADN. DNA construcción de la biblioteca de amplificación se realizó usando cebadores de ADN de la v1 Ion Ampliseq ™ Panel cáncer Hotspot (Life Technologies). El kit se compone de pares de cebadores que cubren 207 739 puntos de acceso dentro de 46 genes relacionados con el cáncer (archivo adicional 1: Tabla S1). bibliotecas de amplicón indexadas se agruparon para la reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación emulsión en la plataforma Ion Torrent PGM (Life Technologies). Se requiere un mínimo de al menos 500 veces la cobertura de pares de bases para cada caso. llamada variante se realizó a través de Torrent v2.2 variante de llamadas (Life Technologies) utilizando el genoma de referencia hg19. Sólo variantes presentes en las frecuencias ≥5% se consideraron. Debido a que el ADN germinal no estaba disponible para la comparación, las variantes fueron excluidas como posibles mutaciones somáticas si ellos fueron identificados como polimorfismos de nucleótido único con frecuencias de los alelos medios de >.... 0 dentro de la base de datos dbSNP (www NCBI NLM NIH gov /SNP); su condición de variantes de la línea germinal no se confirmó además mediante una búsqueda en PubMed (www. NCBI. NLM. NIH. gov /PubMed).
la comparación con la del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) de datos
Curated llamadas mutación somática para TCGA 281 muestras de adenocarcinoma de estómago con sitios anatómicos conocidos fueron recuperados desde el Portal de datos TCGA (http:... //TCGA-NCI datos NIH gov /TCGA /) el 19 de febrero de 2014. mutaciones que codifican proteínas localizadas en las regiones amplificadas por el Grupo v1 Ion Ampliseq ™ el cáncer de hotspot en cada uno de los 46 genes se obtuvieron de los casos y estratificadas por ubicación (60 cardias /proximal y unión gastroesofágica frente
221 del fondo de ojo /cuerpo, antro /distal y el estómago NOS). Copiar datos numéricos, datos de expresión de ARN, y los datos de expresión de proteínas no se consideraron como nuestra propia ensayo sólo detecta variantes de nucleótido único (SNVS) y pequeñas inserciones /deleciones de pares de bases (indeles). Las frecuencias de las mutaciones, con independencia del tipo de mutación, se compararon frente a la secuenciación de varias capas punto de acceso que hemos realizado.
Análisis de los datos
de Mann-Whitney U-test y pruebas t de estudiantes se utilizaron para comparar las variables lineales, donde corresponda. Test exacto de Fisher y Chi-cuadrado, en su caso, se utilizaron para comparar los valores categóricos. Análisis de supervivencia se realizó mediante log-rank (Kaplan-Meier) y Cox de riesgos proporcionales de pruebas. Los 46 genes del panel fueron asignadas a la Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas (KEGG) [22,23] y el programa Pathway Analysis Ingenuity® Integrado (Qiagen) para identificar las vías oncogénicas y redes enriquecidas para las mutaciones, y para probar las diferencias estadísticamente significativas entre la unión gastroesofágica y de adenocarcinoma gástrico. P
valores fueron corregidos para múltiples pruebas utilizando el Benjamini-Hochberg (BH) de corrección [24]. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos colas y un
valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS Statistics (v22, IBM, Armonk, Nueva Jersey, EE.UU.) y el v.2.15.1 lenguaje estadístico R (Equipo Central R (2012) R:.. Un lenguaje y entorno para el cálculo estadístico R Fundación para la . estadística Informática, Viena, Austria ISBN 3-900051-07-0, URL http:... //www R-proyecto org /)
resultados Bienvenidos en los archivos del departamento en el BCCA, 229 muestras de resección de los carcinomas gástricos y de la UGE se obtuvieron 2004-2010 y estaban disponibles para la construcción de un microarray de tejido. ADN estaba disponible para la extracción de 176 casos. No hay datos clínico-patológico estaba disponible para la correlación en 6 casos. Tres casos tenían enfermedad metastásica documentada dentro de un mes de la presentación, y estos fueron excluidos del análisis. De los 167 casos restantes, 92 se originaron en la unión gastroesofágica y 75 se originó en el resto del estómago (Figura 1). Figura 1 Diagrama de flujo que detalla la selección de casos y la exclusión de la cohorte del estudio.
diferencias clínico-patológicas entre la UGE y carcinomas gástricos
Las características clínico-patológicas de estos casos se resumen en la Tabla 1 y se facilitan los datos clínicos anónimos en un archivo suplementario (archivo adicional 2: Tabla S2). carcinomas de la UGE se asociaron con una menor edad en la resección, más frecuentes de tipo intestinal y la histología difusa menos frecuente, la sobreexpresión de p53 más frecuentes y menos pérdida frecuente de la expresión de p53, las enfermedades más frecuentes en estadio III, enfermedad menos frecuente en estadio I, y las recurrencias más frecuentes. supervivencia libre de enfermedad fue significativamente peor en los pacientes con carcinomas de la UGE (Figura 2A), aunque las dos cohortes no fueron estadísticamente diferentes en términos de supervivencia global (Figura 2B). Otras características clínico fueron similares entre los tumores de los dos sitios, entre ellos T-etapa, la participación de los márgenes de resección, ErbB2
amplificación, y la pérdida de proteínas MMR (Tabla 1). La proporción de carcinomas difusos en la clasificación de Lauren) fue similar entre los dos sitios. El análisis de subgrupos de sólo carcinomas de tipo intestinal mostró diferencias persistentes entre la UGE y los carcinomas gástricos en la supervivencia libre de enfermedad y la expresión de p53. Las diferencias en la edad, la expresión de p53 y el resultado persistieron al considerar sólo carcinomas de tipo intestinal, así como cuando los tumores fueron estratificados en tres subtipos (proximal no difusa, difusa y distal no difusas) como se sugiere por Shah et al. [16] (archivo adicional 3: Tabla S3) .Tabla 1 Resumen de las variables clinocopathologic en las variables clínico-patológicas de la cohorte dentro de cardias y no cardias adenocarcinomas
variables clínico-patológico
unión gastroesofágica (n = 92)
no-cardias (n = 75)
general (n = 167) guía empresas p
Edad (media, años)
61,5 + /- 9,6 [33-80]
66,3 +/- 11,9 [33-84]
63,7 +/- 10,9 [33-84]
0,001 Sexo seguro
0,297
Hombre
70 (76)
51 (68)
121 (73)
Mujer
22 (24)
24 (32)
46 (27)
subtipo histológico (Lauren)
0,008
intestinal
65 (71)
36 (48)
101 (60)
difuso
15 (16)
26 (35)
41 (25)
Mixta página 12 (13) página 13 (17)
25 (15)
Etapa (AJCC)
0,031
IA-B
10 (11) página 19 (25)
29 (17)
IIA-B Opiniones 60 (65)
45 (60)
105 (63)
III-AC Hotel 22 (24) página 11 (15)
33 (20) Categoría del tour
0,415
bien diferenciado (G1) página 4 (5)
10 (6)
moderadamente diferenciado (G2)
39 (42)
25 (33)
64 (38)
pobremente diferenciado (G3)
47 (51)
46 (61)
93 (56)
margen de resección
0,306
no involucrado
74 (80)
65 (87)
139 (83)
Participa
18 (20)
10 (13)
28 (17)
amplificación de eRBB2
0,654
Ausente
78 (85)
66 (88)
144 (86)
presente página 14 (15) página 9 (12)
23 (14)
BAF250a expresión (ARID1A)
0,111
intacto
73 (79)
51 (68)
124 (74)
Ausente página 19 (21)
24 (32)
43 (26)
la expresión de p53
2.8x10 -4
0 - ausente
32 (35)
47 (63)
79 (47)
1 - normal (1-60%): perfil 17 (19) página 14 (19)
31 (19) página 2 - Aumento (> 60%)
43 (47) página 14 (19)
57 (34)
proteínas de reparación de genes
0,244
intacto
77 (84)
57 (76)
135 (80)
anormal
15 (16)
18 (24)
33 (20)
número de recurrencias
57 (62)
32 (43)
89 (53)
0.019
supervivencia media libre de progresión (meses)
12
18
15
Número de muertes
69 (75)
48 (64)
117 (70)
0.130
mediana de supervivencia global (Meses ): perfil del 18,0
23,0 20,0

Figura 2 Comparación de la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global entre los pacientes con gastroesofágico y carcinomas gástricos. A) la supervivencia libre de la enfermedad fue significativamente peor para los carcinomas gastroesofágico (líneas continuas) en comparación con carcinoms gástricos (líneas punteadas), log-rank test; p = 0,002, aunque B) la supervivencia global no fue diferente entre los dos sitios de la enfermedad (Log-rank test;. p = 0,225)
En el análisis multivariable, la UGE ubicación se asoció independientemente con la supervivencia libre de enfermedad peor (riesgo proporcional de Cox = 2,08 [IC del 95%: 1,25 a 3,44], p = 0,005) junto con el estado de los márgenes y la inestabilidad de microsatélites (archivo adicional 4: Tabla S4). La edad, el grado del tumor y la afectación de los márgenes eran de forma independiente pronóstico de supervivencia global (archivo adicional 5: Tabla S5).
Las mutaciones identificadas con el panel del cáncer Estar entre todos los casos, se detectaron 145 mutaciones en 31 genes, con 75 mutaciones detectadas entre 57 de los tumores de la UGE, y 70 mutaciones detectadas entre los 43 tumores gástricos (Figura 3). No hay mutaciones se detectaron en 35 (38%) y 32 (43%) de los tumores de la UGE y el estómago, respectivamente. TP53
era los genes más comúnmente mutado, con variantes identificadas en 59 de 167 casos (35%). Los siguientes genes más frecuentemente mutados fueron PI3KCA gratis (6%), CTNNB1 gratis (5%), KRAS gratis (5%) y SMAD4 gratis (4%). Otras variantes incluyen mutaciones de punto de acceso en IDH1
(2 casos), JAK3 gratis (3 casos), y FLT3 gratis (2 casos). Una sola mutación se identificó en 70 casos (42%), 2 mutaciones se identificaron en 20 casos (12%), y ≥ 3 se identificaron mutaciones en 10 casos (6%). Figura 3 Las mutaciones somáticas identificadas en unión gastroesofágica y carcinomas gástricos. TP53
se identificaron mutaciones en una mayor proporción de tumores unión gastroesofágica, mientras que las anomalías en APC
/CTNNB1
fueron más frecuentes en los tumores gástricos. bloques negros representan truncando mutaciones, mientras que los bloques grises representan las mutaciones sin sentido. Los casos y los genes en los que no se identificaron mutaciones no están incluidos.
No se identificaron mutaciones en las regiones críticas de ALK
, CSF1R
, EGFR
, FGFR2
, HNF1A
, HRAS
, JAK2
, MPL
, NPM1
, las ANR
, SRC
, STK11
o BVS
. Todas las llamadas variantes están disponibles en los datos suplementarios (archivo adicional 6: Tabla S6).
Las diferencias en las mutaciones entre la UGE y el estómago
TP53
se identificaron mutaciones en 39 de 92 (42%) de los tumores Gej , y en 20 de 75 (27%) tumores gástricos (p = 0,036). Cuando subdividido en los 3 subtipos sugeridas por Shah et al. [16], TP53
mutaciones ocurrieron con mayor frecuencia en los cánceres nondiffuse proximales (44%) que en los cánceres difusas (37%) y los cánceres distales nondiffuse (20%; p = 0,024). Esta clasificación también mostró mutaciones más frecuentes en KRAS
dentro de cánceres nondiffuse distales (12%) frente a nondiffuse proximal (3%) y difusa (0%) carcinomas (p = 0,12). No hay diferencias significativas en las frecuencias de mutación estaban presentes entre los otros genes individuales en el panel. Dos componentes de la vía Wnt, APC
y CTNNB1
, estaban en agregados mutado más frecuentemente en carcinomas gástricos que en los tumores Gej (16% vs. 3%, p = 0,006). carcinomas gástricos con más frecuencia tenían mutaciones en 3 o más genes (11% frente a 2%, p = 0,044; Figura 4). No hay diferencias en la implicación de las vías oncogénicas se observaron entre los dos sitios, basado en perfiles mutacionales. Figura 4 Las proporciones de la UGE y carcinomas gástricos con un número de mutaciones totales y viables identificadas. Sólidos zonas oscuras en las columnas representan los casos con la mutación 1, oscuras áreas alineadas diagonales representan los casos con 2 mutaciones, y vistos áreas representan los casos con 3 o más mutaciones.
Mutaciones potencialmente viables
Las terapias dirigidas son disponibles o en desarrollo para las mutaciones que ocurren en los siguientes genes: AKT
[25], BRAF
[26], erbB2
[27], ERBB4
[28], FGFR1
[29], FGFR3
[30], FLT3
[31,32], Idh1
[33], JAK3
[31], KDR
[34,35], KRAS
[36], MET
[34], PDGFRA
[37], PIK3CA
[25], PTEN
[25], PTPN11
[38], RET
[39], SMO
[40]. Las mutaciones en estos genes fueron identificados en 32 casos (19%), incluyendo 6 casos (4%) con 2 mutaciones y 3 casos (2%) con ≥3 mutaciones. La distribución de las mutaciones viables no fue significativamente diferente entre la UGE y los carcinomas gástricos. (P = 0,327; Figura 4)
pronóstico importancia de las mutaciones
ERBB4
mutaciones se asocian con una peor supervivencia libre de enfermedad (p = 0,018 ), mientras que hubo una tendencia hacia una peor supervivencia libre de enfermedad asociado con mutaciones en ABL1
(p = 0,063) y JAK3
(p = 0,059). Ninguna de estas mutaciones eran pronóstico significativo tras considerar la edad, el sexo, subtipo Lauren, estadio, grado y estado de los márgenes. Las mutaciones en BRAF gratis (p < 0,001), FGFR3 gratis (p < 0,001), FLT3 gratis (p < 0,001) se asociaron con peor supervivencia global en el análisis univariado como resultado de un solo caso con mutaciones en estos tres genes.). BRAF
mutación se mantuvo el pronóstico significativo tras considerar la edad, el sexo, subtipo Lauren, estadio, grado y estado de los márgenes (p = 0,002).
Comparación con los datos del TCGA
Al evaluar las regiones de punto de acceso cubiertos por el panel de secuenciación , el número total de genes mutados por caso fue similar entre el TCGA y el estudio de cohortes (p = 0,659), incluyendo al comparar cualquiera de tumores UGE (p = 0,399) o gástrica (p = 0,845) solamente (Figura 5A). Una tendencia hacia los casos más frecuentes con mutaciones en genes ≥3 en el estómago en comparación con la UGE se observó también en los datos del TCGA (12% vs. 3%, p = 0,054). La frecuencia global de mutaciones TP53
no fue diferente entre el grupo de estudio y la cohorte TCGA (p = 0,230). No se observaron diferencias en TP53
, KRAS
, y APC
/CTNNB1
tasas de mutación entre la UGE y los carcinomas gástricos en el conjunto de datos TCGA (figuras 5B-D). Los genes mutados en el conjunto de datos TCGA se incluyen en el archivo adicional 7: Tabla S7. En cuanto a las mutaciones con posible importancia pronóstica identificado en nuestra cohorte, hubo una tendencia hacia una peor supervivencia global asociado a BRAF
mutaciones (p = 0,079), mientras que no hay asociación pronóstico se encontró en la cohorte TCGA en asociación con mutaciones en ERBB4
, ABL1
, JAK3
, FLT3
o FGFR3
. Figura 5 Comparación de la frecuencia de mutaciones dentro de puntos de acceso identificados en la cohorte del estudio usando la secuenciación del panel, en comparación con mutaciones identificadas utilizando la secuenciación del exoma todo en los datos del TCGA. A) Las mutaciones a través de puntos de acceso de mutaciones en los 46 genes en el panel, B) mutaciones en TP53
, C) las mutaciones en KRAS
, y D) mutaciones en el de señalización Wnt componentes APC Opiniones y CTNNB1
.
Discusión
objetivo del estudio fue investigar la utilidad de la secuenciación del panel en la identificación de cambios de un solo nucleótido en muestras de resección gástrica rutinaria procesados, que podrían ser utilizados para guiar terapias dirigidas. Nos secundariamente tratado de contrastar la UGE y los carcinomas gástricos mediante secuenciación profunda dirigida de un panel de 46 genes relacionados con el cáncer, que reveló algunas diferencias a nivel genómico que puede reflejar diferentes perfiles clínico-patológicas. Por último, también tratamos de comparar las frecuencias de mutaciones obtenidas utilizando este panel con los resultados de la secuenciación del exoma en el Atlas del Genoma del Cáncer.
Los adenocarcinomas del tracto gastrointestinal son molecularmente heterogénea y compleja [41-44]. En el carcinoma gástrico, secuenciación profunda del polimorfismo de nucleótido único y ARN arrays de expresión han revelado recientemente anomalías en varias rutas incluyendo WNT, erizo, el ciclo celular, reparación del daño en el ADN y la transición epitelio-mesenquimal [45]. El uso actual de múltiples pruebas de un solo gen es insostenible dada esta complejidad, especialmente en la presencia de un número creciente de terapias dirigidas, los recursos limitados y la disponibilidad limitada de tejido. Por lo tanto, es deseable para investigar múltiples genes al mismo tiempo. secuenciación Panel tiene una sensibilidad de cerca de 100% en relación con ensayos convencionales, tales como la secuenciación de Sanger y métodos basados ​​en PCR, así como una capacidad de detectar SNVS y los INDEL en frecuencias de los alelos tan bajas como 5% y 20%, respectivamente, en tanto FFPE [21,46-48] y citología especímenes [49-52]. secuenciación panel de Targeted puede detectar aberraciones en genes relacionados con el cáncer en los cánceres tempranos gástricas y lesiones precursoras [53], y su cobertura profunda podría ser particularmente útil en el cáncer gástrico, proporcionando resultados adecuados a pesar de material de biopsia escasa y la mezcla de las células tumorales con desmoplasia y células inflamatorias.
se identificaron mutaciones conductor putativos en la mayoría de la UGE y carcinomas gástricos investigado en este estudio. Con mucho, el gen mutado más frecuentemente detectado fue TP53
, y estas mutaciones también se han detectado en lesiones precursoras tempranas etapas y utilizando el mismo ensayo [53]. mutaciones del conductor múltiple se identificaron en varios casos, reforzando la idea de que necesitan ser interrogado a la vez en los tumores genómicamente complejos, tales como adenocarcinomas gástricos múltiples genes. Un caso con una mutación en BRAF
(así como FLT3 y FGFR3) se asoció con una pobre supervivencia global en ambos análisis univariado y multivariable. Este hallazgo refleja una tendencia observada en los datos del TCGA hacia la supervivencia global pobres en BRAF
tumores -mutated, lo que sugiere que en algunos casos la secuenciación del panel podría tener un papel pronóstico.
También pudimos detectar mutaciones potencialmente viables en aproximadamente 20% de los casos, lo que suponía cualquiera de los genes o vías en las terapias dirigidas están disponibles o en desarrollo. Si bien este número debería idealmente ser más alto, nuestro ensayo sólo cubría ciertas regiones críticas de estos genes, y no tuvo en cuenta las alteraciones del número de copias que también podría proporcionar información útil. Un refinamiento adicional de este tipo de paneles para incluir una gama más amplia de genes y segmentos de genes es probable que aumente la proporción de casos en los cuales se identifican mutaciones. Por ejemplo, aunque TP53
mutaciones se producen en todo el gen, el panel cubre principalmente exones 5-8, y algunos de los segmentos de genes que no fueron secuenciados están asociados más frecuentemente con la pérdida de p53 en inmunohistoquímica [54]. Este hecho puede explicar potencialmente tanto las diferencias en las tasas de mutaciones de TP53
y los patrones de expresión inmunohistoquímica observados en la UGE y el estómago. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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