revisione retrospettiva utilizzando sequenziamento profondo mirato rivela differenze tra mutazioni giunzione gastroesofagea e carcinomas

gastrico revisione retrospettiva utilizzando il sequenziamento profondo mirato rivela differenze tra mutazioni giunzione gastroesofagea e carcinomi gastrici
Abstract
sfondo
adenocarcinomi sia della giunzione gastroesofagea e lo stomaco sono molecolarmente complesso, ma si differenziano per quanto riguarda l'epidemiologia, eziologia e la sopravvivenza. Ci sono pochi dati che confrontano direttamente le frequenze di mutazioni singolo nucleotide nei geni correlati al cancro tra i due siti. Il sequenziamento dei pannelli genica mirata può essere utile a scoprire più aberrazioni genomiche utilizzando un singolo test.
Metodi
DNA da 92 gastroesofageo giunzione e 75 adenocarcinoma gastrico campioni di resezione è stato estratto da tessuto incluso in paraffina fissati in formalina. sequenziamento profondo mirato di 46 geni correlati al cancro è stata effettuata attraverso emulsione PCR seguita da sequenziamento dei semiconduttori basati su. giunzione gastroesofagea e carcinomi gastrici erano in contrasto con il rispetto di profili delle mutazioni, immunoistochimica e ibridazione in situ
, così come corrispondente di dati clinico-patologici.
Risultati
carcinomi giunzione gastroesofagea sono stati associati con l'età più giovane, più frequente tipo intestinale istologia, più frequenti sovraespressione di p53, e peggio sopravvivenza libera da malattia di analisi multivariata. Tra tutti i casi, 145 mutazioni sono state rilevate in 31 geni. TP53
mutazioni erano l'anomalia più comune rilevata, ed erano più comuni nei carcinomi gastroesofageo di giunzione (42% vs. 27%, p = 0,036). Le mutazioni nel Wnt pathway componenti APC
e CTNNB1
erano più comuni tra i carcinomi gastrici (16% vs 3%, p = 0.006), e carcinomi gastrici avevano una maggiore probabilità di avere ≥ 3 mutazioni del driver rilevati (11% vs. 2%, p = 0,044). Venti per cento dei casi ha avuto mutazioni potenzialmente attuabili identificate. Sono stati osservati R132H e R132C missense mutazioni nel gene IDH1
, e sono le prime mutazioni riportate nel loro genere nel carcinoma gastrico.
Conclusioni
sequenziamento del pannello di materiale patologia routine può fornire informazioni mutazionale di parecchi geni del driver, tra cui alcuni per i quali le terapie mirate sono disponibili. Differenze nei tassi di mutazioni e le differenze clinico-patologiche supportano una distinzione tra adenocarcinomi che sorgono nella giunzione gastroesofagea e quelli che sorgono nello stomaco corretta.
Parole
cancro gastrico gastroesofageo cancro gastrico giunzione genomica del cancro gastrico cancro sequenziamento Sfondo
gastrico il cancro per oltre 10.000 decessi ogni anno negli Stati Uniti [1], ed è la seconda causa più comune di mortalità per cancro in tutto il mondo [2]. Anche se carcinomi della giunzione gastroesofagea (GEJ) sono state raggruppate con carcinomi gastrici in registri tumori e in studi clinici per terapie mirate [3], lesioni a questi due siti hanno caratteristiche cliniche distinte. Gli adenocarcinomi dello stomaco corretta sono principalmente causate da Helicobacter pylori
infezione [4] e sono in diminuzione in incidenza mondiale [1]. Al contrario, i tumori ġej sono più associati con la malattia da reflusso gastroesofageo [2-5] e l'obesità [6], e l'incidenza di carcinomi GEJ è rimasto stabile negli ultimi 20 anni [7]. Inoltre, la prognosi dei carcinomi GEJ è stato notato per essere peggio di carcinomi gastrici, e non vi è incertezza sul fatto carcinomi GEJ dovrebbe essere messo in scena come tumori gastrici o esofagei [8]. Riconoscendo la distinzione tra carcinomi del GEJ, esofago e stomaco può migliorare la raccolta di dati epidemiologici significativi e provocare un aumento della precisione di gestione [9].
Diversi studi hanno notato differenze nelle caratteristiche molecolari dei carcinomi GEJ rispetto a quelli che sorgono altrove nello stomaco. TP53
mutazioni sono più frequenti nel GEJ rispetto allo stomaco distale, mentre la perdita di eterozigosi del TP53
locus è anche più comune nei GEJ tumori [10,11]. Differenze significative nei tassi di metilazione del promotore di APC
e CDKN2A
sono stati anche descritti [12]. Inoltre, le differenze di APC
tassi di mutazione e l'espressione della proteina, così come le differenze di profili di espressione genica a livello mondiale tra i due siti sono stati anche dimostrato [13-16]
. Prove di amplificazioni del ERBB2
( noto anche come HER2
) gene nei tumori di giunzione gastrico e gastroesofageo è ormai pratica di routine in molte istituzioni [17]. Allo stesso modo, il test per le mutazioni del driver, in particolare per le sostituzioni a singolo nucleotide, in oncogeni e geni oncosoppressori attualmente informa trattamento in adenocarcinomi di altri siti, come il polmone e del colon [18-20]. Come ulteriori bersagli molecolari vengono scoperti attraverso siti di malattia, saggi efficaci saranno necessari per determinare la suscettibilità dei tumori 'di trattamento mirato.
Sequenziamento di prossima generazione possono essere utilizzati in un prossimo futuro di interrogare più geni in un singolo campione, e questi dati potrebbero essere utilizzati per informare i medici di mutazioni conducente e guidare il trattamento mirato. Mirata sequenziamento del pannello è una forma di sequenziamento di prossima generazione in cui vengono rilevate le varianti a singolo nucleotide in un numero limitato di precedentemente determinato loci genomici, che nelle intenzioni sono spesso prognostico e terapeutico fondamentale. sequenziamento del pannello permette il multiplexing dei campioni, e la copertura profonda (> 500x) facilita l'analisi del modello di materiale non ottimale dal tessuto d'archivio e campioni a bassa cellularità tumorale. L'insieme più ristretto di geni permette anche per un più rapido trattamento dei campioni e analisi bioinformatica. Così, i risultati attuabili possono essere ottenuti in pochi giorni, piuttosto che le settimane, rispetto a tutto il genoma e exome approcci. Tuttavia, i dati è limitato dalla selezione intrinsecamente parziale dei geni, e l'incapacità di rilevare i cambiamenti del numero di copie, la perdita di eterozigosi, e riarrangiamenti strutturali come fusioni geniche. Pertanto, l'uso efficace di NGS richiede un'attenta valutazione delle tecnologie, le limitazioni del test, i requisiti dei modelli, e la ricerca e questioni cliniche in esame.
Gli obiettivi di questo studio sono stati per sondare l'utilità del pannello di sequenziamento su paraffinato fissato in formalina incorporato tessuto (FFPE), e per confrontare GEJ clinicamente annotati e carcinomi gastrici attraverso il pannello di sequenziamento dei punti caldi di 46 geni del cancro. Abbiamo anche cercato di confrontare le frequenze di mutazioni identificate con pannello sequenziamento di hotspot contro tutto il sequenziamento, utilizzando i dati pubblicamente disponibili da The Cancer Genome Atlas.
Metodi
caso la selezione e il recupero dei dati clinico-patologiche
etica istituzionali l'approvazione è stata ottenuta presso la University of British Columbia /British Columbia Cancer Agency etica della ricerca pensione (# H07-2807), e la ricerca è stata condotta in conformità con la dichiarazione di Helsinki. I casi di carcinoma gastrico sono stati recuperati da archivi dipartimentali dalla Columbia agenzia britannica Cancer (BCCA), un centro di riferimento provinciale. I criteri di inclusione erano rinvio alla agenzia tra il 2004 e il 2010, disponibile FFPE tessuto dalla resezione chirurgica del tumore primario, i dati clinico-patologiche completi tra cui esiti clinici sul follow-up, e l'assenza di malattia metastatica al momento della presentazione. Campioni bioptici di lesioni primari e metastatici sono stati esclusi a causa della mancanza di dati patologici completi. posizione GEJ è stata definita come lesioni con epicentro a 5 cm dalla estremità prossimale delle pieghe rugose gastriche [21]. Nessuna distinzione è stata fatta tra i tumori per quanto riguarda la posizione del loro epicentro all'interno dei 5 cm di GEJ (cioè tipo Siewert non è stato registrato) [22]. I carcinomi situate esclusivamente all'interno dell'esofago sono stati esclusi, secondo i più recenti criteri WHO [21]. Tutti i tumori gastrici situati distale al GEJ stati discretizzati insieme per questo studio. dati clinico-patologica sono stati raccolti retrospettivamente attraverso la revisione delle tabelle dei pazienti da un membro del team clinico, così come attraverso la revisione dei rapporti di patologia.
Tissue microarray costruzione, immunoistochimica e ibridazione in situ

costruzione del tessuto microarray era effettuata utilizzando due nuclei 0,6 mm da due sezioni separate di tumore. La colorazione immunoistochimica per p53 (1: 100; clone DO-7, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), Baf250a (1:75; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e il mismatch repair (MMR) proteine ​​tra cui hMLH1 (1,25; clone ES05, ​​Leica, Wetzlar, Germania), MSH2 (1: 5; clone 25D12, Leica), hMSH6 (1: 300; PU29 clone, Leica), e hPMS2 (1: 150; clone MOR4G, Leica ) è stato eseguito sulla piattaforma XT (Ventana). L'espressione di p53 è stato segnato come assente (< 1% colorazione nucleare), normale (1-60% colorazione nucleare di qualsiasi intensità), o sovraespressione (> 60% colorazione nucleare di qualsiasi intensità). proteine ​​Baf250a e MMR sono stati segnati come intatto (≥1% colorazione) o negativo (< 1% della marcatura) sulla base di espressione della proteina specificamente nelle cellule tumorali (cioè espressione immunitario e stromale è stato ignorato). ERBB2
argento in situ
ibridazione (SISH) è stata eseguita utilizzando la piattaforma XT automatica IHC /ISH colorazione (Ventana). A ERBB2
: rapporto CEP17 < 2.0 è stata classificata come non amplificata, e un valore ≥2.0 come amplificato. Enumerazione dei segnali SiSh si è basata su protocolli stabiliti [17].
Trasformazione campione di DNA, sequenziamento, e la variante chiamando
In ogni caso, ematossilina eosina diapositive sono stati usati per guidare macrodissection o lo scorrimento del tessuto tumorale da FFPE scivola seguente delineando dei tumori da un anatomo-patologo. Tumore DNA da ogni singolo caso è stato estratto utilizzando il kit Qiagen FFPE estrazione del DNA (Qiagen, Venlo, Paesi Bassi); nessun DNA germinale è stato estratto. Estratte DNA è stato quantificato con il saggio QUBIT HS dsDNA (Life Technologies Gaithersburg, MD, USA); tutti i casi avevano un minimo di 10 ng di DNA estratto da FFPE, in linea con un requisito precedentemente segnalato per il dosaggio [21]. Un rapporto minimo A260 /280 di 1,8 è stato richiesto per ciascun campione di DNA. DNA costruzione della libreria amplicone è stata effettuata utilizzando primer DNA dal v1 Ion Ampliseq ™ Cancer Panel Hotspot (Life Technologies). Il kit è composto da coppie di primer 207 che coprono 739 hotspot nel raggio di 46 geni correlati al cancro (file aggiuntivo 1: Tabella S1). biblioteche ampliconi indicizzati sono stati riuniti per la reazione a catena della polimerasi in emulsione e sequenziamento sulla piattaforma Ion Torrent PGM (Life Technologies). è stato richiesto un minimo di almeno 500x copertura coppia di basi per ciascun caso. chiamata Variant è stata effettuata utilizzando il v2.2 Torrent Variante del chiamante (Life Technologies) con il genoma di riferimento hg19. Solo varianti presenti a frequenze ≥5% sono stati considerati. Perché il DNA germinale non era disponibile per il confronto, le varianti sono stati esclusi come possibili mutazioni somatiche se fossero identificati come polimorfismi a singolo nucleotide con frequenze alleliche medi di >.... 0 all'interno del database dbSNP (www NCBI nlm NIH gov /SNP); il loro status di varianti non germinali è stata ulteriormente confermata utilizzando una ricerca PubMed (www. NCBI. nlm. NIH. gov /PubMed)
. confronto con la Cancer Genome Atlas (TCGA) dati
A cura chiamate mutazione somatica di 281 TCGA campioni stomaco adenocarcinoma con noti siti anatomici sono stati recuperati dal Portale dei dati TCGA (http:... //TCGA-dati NCI NIH gov /TCGA /) il 19 febbraio 2014. mutazioni codificanti proteine ​​situati nelle regioni amplificate dal v1 Cancer Panel Ion Ampliseq ™ Hotspot in ciascuno dei 46 geni sono stati ottenuti per i casi e stratificati per posizione (60 Cardia /prossimale e giunzione gastroesofagea contro
221 fundus /corpo, antro /distale e lo stomaco NOS). Copiare i dati numerici, dati di espressione di RNA, e dati di espressione di proteine ​​non sono stati considerati come il nostro test rileva solo le varianti a singolo nucleotide (SNVs) e piccole inserzioni paio di basi /delezioni (indels). Le frequenze di mutazioni, a prescindere dal tipo di mutazione, sono stati confrontati contro l'hotspot più sequenziamento pannello che abbiamo effettuato.
Analisi dei dati
Mann-Whitney U-test e t di Student-test sono stati usati per confrontare le variabili lineari, ove opportuno. Fisher esatte e chi-quadrato test, se del caso, sono stati utilizzati per confrontare i valori categoriali. Sopravvivenza analisi sono state effettuate utilizzando log-rank (Kaplan-Meier) e Cox test di rischio proporzionale. I 46 geni del pannello sono state mappate l'Enciclopedia di Kyoto di geni e genomi (KEGG) [22,23] e il programma di analisi Pathway Ingenuity® integrato (Qiagen) per individuare percorsi oncogeni e reti arricchito da mutazioni, e per verificare le differenze statisticamente significative tra la giunzione gastroesofagea e campioni di adenocarcinoma gastrico. P
valori sono stati corretti per test multipli utilizzando la correzione Benjamini-Hochberg (BH) [24]. Tutti i test statistici sono stati a due code e un valore di P
di < .05 È stato considerato statisticamente significativo. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software SPSS Statistics (V22, IBM, Armonk, NJ, USA) e il v.2.15.1 R linguaggio statistico (R Core Team (2012) R:.. Un linguaggio e ambiente per il calcolo statistico R Fondazione per . Statistical Computing, Vienna, Austria ISBN 3-900051-07-0, URL http:... //www R-progetto org /)
Risultati
All'interno archivi dipartimentali al BCCA, 229 esemplari resezione di carcinomi gastrici e GEJ sono stati ottenuti 2004-2010 ed erano disponibili per la costruzione di un tessuto microarray. DNA era disponibile per l'estrazione per 176 casi. Nessun dato clinico-patologica era disponibile per la correlazione in 6 casi. Tre casi avevano la malattia metastatica documentata entro un mese dalla presentazione, e questi sono stati esclusi dall'analisi. Dei restanti 167 casi, 92 origine nella giunzione gastroesofageo e 75 origine nel resto dello stomaco (Figura 1). Figura 1 Diagramma di flusso dettagli selezione dei casi e di esclusione per lo studio di coorte.
differenze clinico-patologiche tra GEJ e carcinomi gastrici
Le caratteristiche clinico-patologiche di questi casi sono riassunti nella tabella 1 e dati clinici anonimi è fornito in un file supplementare (sui file 2: Tabella S2). carcinomi ġej sono stati associati con più giovane età alla resezione, più frequente tipo intestinale e meno frequenti istologia diffusa, più frequente sovraespressione di p53 e meno frequente perdita di espressione di p53, più frequente malattia in stadio III, la malattia mi fase meno frequenti, e ricorrenze più frequenti. La sopravvivenza libera da malattia era significativamente peggiore tra i pazienti con carcinomi GEJ (Figura 2A), anche se le due coorti non erano statisticamente differenti in termini di sopravvivenza globale (Figura 2B). Altre caratteristiche clinico-patologiche erano simili tra i tumori delle due località, tra cui T-fase, il coinvolgimento margine di resezione, ERBB2
amplificazione, e la perdita di proteine ​​MMR (Tabella 1). La percentuale di carcinomi diffusi nella classifica Lauren) è risultata simile tra i due siti. L'analisi per sottogruppi di soli carcinomi intestinali di tipo ha mostrato differenze persistenti tra GEJ e carcinomi gastrici nella sopravvivenza libera da malattia e di espressione di p53. Le differenze di età, di espressione di p53 e l'esito persistito se si considerano solo i carcinomi intestinali di tipo, così come quando i tumori sono stati stratificati in tre sottotipi (prossimale non diffusa, diffusa, e distale non diffuse) come suggerito da Shah et al. [16] (sui file 3: Tabella S3) .table 1 Sintesi delle variabili clinocopathologic nelle variabili clinico-patologiche della coorte all'interno Cardia e non cardia adenocarcinomi
variabile clinicopatologico
giunzione gastroesofagea (n = 92)
non-cardias (n = 75)
complessiva (n = 167)
p
Age (media, anni)
61,5 + /- 9.6 [33-80]
66,3 +/- 11,9 [33-84]
63,7 +/- 10,9 [33-84]
0.001
Sex
0,297
maschio
70 (76)
51 (68)
121 (73)
femminile
22 (24)
24 (32)
46 (27)
istologico sottotipo (Lauren)
0.008
intestinale
65 (71)
36 (48)
101 (60)
Diffuse
15 (16)
26 (35)
41 (25)
misto
12 (13)
13 (17)
25 (15)
stadio (AJCC)
0,031
IA-B
10 (11)
19 (25)
29 (17)
IIA-B
60 (65)
45 (60)
105 (63)
III-AC
22 (24)
11 (15)
33 (20)
grado
0,415
ben differenziato (G1) Pagina 4 (5)
10 (6)
differenziata moderatamente (G2)
39 (42)
25 (33)
64 (38)
scarsamente differenziato (G3)
47 (51)
46 (61)
93 (56)
margine di resezione
0.306
non coinvolti
74 (80)
65 (87)
139 (83)
Coinvolto
18 (20)
10 (13)
28 (17)
ERBB2 amplificazione
0,654
Assente
78 (85)
66 (88)
144 (86)
Presentare
14 (15)
9 (12)
23 (14)
BAF250a espressione (ARID1A)
0.111
Intact
73 (79)
51 (68)
124 (74)
Assente
19 (21)
24 (32)
43 (26)
espressione di p53
2.8x10 -4
0 - assente
32 (35)
47 (63)
79 (47)
1 - normale (1-60%)
17 (19)
14 (19)
31 (19) Pagina 2 - aumento (> 60%)
43 (47)
14 (19)
57 (34)
proteine ​​non corrispondente riparazione
0,244
Intact
77 (84)
57 (76)
135 (80)
anomala
15 (16)
18 (24)
33 (20)
Numero di ricorrenze
57 (62)
32 (43)
89 (53)
0.019
la sopravvivenza mediana libera da progressione (mesi)
12
18
15
Numero di decessi
69 (75)
48 (64)
117 (70)
0,130
sopravvivenza globale mediana (mesi )
18,0
23,0
20,0
Figura 2 Confronto di sopravvivenza libera da malattia e la sopravvivenza globale tra i pazienti con gastroesofageo e carcinomi gastrici. A) sopravvivenza libera da malattia era significativamente peggiore per i carcinomi gastroesofageo (linee continue) rispetto a carcinoms gastrici (linee tratteggiate), log-rank test; p = 0,002, anche se B) la sopravvivenza globale non differiva tra i due siti di malattia (Log-rank test;. p = 0,225)
All'analisi multivariata, la posizione GEJ era indipendentemente associata ad peggiore sopravvivenza libera da malattia (Cox proporzionale Hazard = 2.08 [95% intervallo di confidenza: 1,25-3,44], p = 0,005), insieme con lo stato dei margini e instabilità dei microsatelliti (sui file 4: Tabella S4). L'età, grado del tumore e il coinvolgimento margine erano indipendentemente prognostico di sopravvivenza globale (sui file 5: Tabella S5).
Mutazioni identificate con il pannello di cancro Con gli tutti i casi, 145 mutazioni sono stati rilevati in 31 geni, con 75 mutazioni identificate tra 57 dei tumori del GEJ, e 70 mutazioni identificate tra 43 tumori gastrici (Figura 3). No mutazioni sono stati rilevati in 35 (38%) e 32 (43%) dei tumori da rispettivamente GEJ e lo stomaco,. TP53
era geni più comunemente mutato, con varianti identificate in 59 di 167 casi (35%). I prossimi geni più comunemente mutato erano PI3KCA
(6%), CTNNB1
(5%), KRAS
(5%) e SMAD4
(4%). Altre varianti comprese mutazioni hotspot in IDH1
(2 casi), JAK3
(3 casi), e FLT3
(2 casi). Una singola mutazione venne identificato in 70 casi (42%), 2 mutazioni sono state identificate in 20 casi (12%), e ≥3 mutazioni sono state identificate in 10 casi (6%). Figura 3 mutazioni somatiche identificate nella giunzione gastroesofagea e carcinomi gastrici. TP53
mutazioni sono state identificate in una maggiore proporzione di tumori giunzione gastroesofagea, mentre anomalie nella APC
/CTNNB1
si sono verificati più frequentemente nei tumori gastrici. blocchi neri rappresentano truncating mutazioni, mentre blocchi grigi rappresentano mutazioni missense. Casi e geni in cui non sono state identificate mutazioni non sono inclusi.
No mutazioni sono state identificate nelle regioni hotspot di ALK
, CSF1R
, EGFR
, FGFR2
, HNF1A
, HRAS
, JAK2
, MPL
, NPM1
, NRAS
, SRC
, STK11
o VHL
. Tutte le chiamate variante sono disponibili nei dati aggiuntivi (file aggiuntivo 6: Tabella S6).
Le differenze di mutazioni tra il GEJ e lo stomaco
TP53
mutazioni sono state identificate in 39 di 92 (42%) dei tumori GEJ e in 20 dei 75 (27%) tumori gastrici (p = 0,036). Quando suddivisa nelle 3 sottotipi suggeriti da Shah et al. [16], TP53
mutazioni si sono verificati più frequentemente nei tumori nondiffuse prossimali (44%) rispetto a tumori diffusi (37%) e tumori distali nondiffuse (20%; p = 0,024). Questa classificazione ha anche mostrato mutazioni più frequenti in KRAS
all'interno tumori nondiffuse distali (12%) rispetto nondiffuse prossimale (3%) e diffusa (0%) carcinomi (p = 0,12). Nessuna differenza significativa nella frequenza di mutazione erano presenti tra gli altri geni singoli nel pannello. Due componenti del pathway Wnt, APC
e CTNNB1
, sono stati complessivamente mutato più frequentemente nei carcinomi gastrici che nei tumori GEJ (16% vs 3%, p = 0,006). carcinomi gastrici più frequentemente avevano mutazioni in 3 o più geni (11% vs. 2%, p = 0,044; Figura 4). Non ci sono differenze nel coinvolgimento di percorsi oncogeni sono stati osservati tra i due siti, in base a profili delle mutazioni. Figura 4 Proporzioni di GEJ e carcinomi gastrici con i numeri di mutazioni totali e attuabili identificati. aree scure solide nelle colonne rappresentano casi con 1 mutazione, aree allineate in diagonale scure rappresentano casi con 2 mutazioni, e individuato aree rappresentano casi con 3 o più mutazioni.
mutazioni potenzialmente attuabili
terapie mirate sono disponibili o in fase di sviluppo per mutazioni che si verificano nei seguenti geni: AKT
[25], BRAF
[26], ERBB2
[27], ERBB4
[28], FGFR1
[29], FGFR3
[30], FLT3
[31,32], IDH1
[33], JAK3
[31], KDR
[34,35], KRAS
[36], il TEM
[34], PDGFRA
[37], PIK3CA
[25], PTEN
[25], PTPN11
[38], RET
[39], SMO
[40]. Le mutazioni in questi geni sono stati identificati in 32 casi (19%), di cui 6 casi (4%) con 2 mutazioni e 3 casi (2%), con ≥ 3 mutazioni. La distribuzione delle mutazioni attuabili non era significativamente differente tra GEJ e carcinomi gastrici. (P = 0,327; Figura 4)
prognostico significato di mutazioni
ErbB4
mutazioni erano associate ad peggiore sopravvivenza libera da malattia (p = 0.018 ), mentre si registra una tendenza verso peggiore sopravvivenza libera da malattia associata con mutazioni nel ABL1
(p = 0,063) e JAK3
(p = 0,059). Nessuna di queste mutazioni erano la prognosi dopo la contabilizzazione di età, sesso, Lauren sottotipo, lo stadio, il grado e lo stato dei margini. Le mutazioni in BRAF
(p < 0,001), FGFR3
(p < 0,001), FLT3
(p < 0,001) sono stati associati con peggiore sopravvivenza globale sulla analisi univariata come risultato di un singolo caso con mutazioni in tutti e tre questi geni.). BRAF
mutazione è rimasta la prognosi dopo la contabilizzazione di età, sesso, Lauren sottotipo, lo stadio, il grado e lo stato dei margini (p = 0,002)
. Il confronto con i dati TCGA
Nel valutare le regioni hotspot coperti dal pannello di sequenziamento , il numero totale di geni mutati per caso era simile tra il TCGA e studiare coorti (p = 0.659), tra cui quando si confrontano sia GEJ (p = 0,399) o gastrico (p = 0.845) tumori solo (Figura 5A). Una tendenza verso i casi più frequenti con mutazioni in geni ≥3 nello stomaco rispetto al GEJ stata anche osservata nei dati TCGA (12% vs. 3%, p = 0,054). La frequenza complessiva di TP53
mutazioni non era differente tra la coorte studio e la coorte TCGA (p = 0.230). Non ci sono differenze di TP53
, KRAS
, e APC
/CTNNB1
tassi di mutazione tra GEJ e carcinomi gastrici sono stati osservati nel set di dati TCGA (figure 5B-D). I geni mutati nel set di dati TCGA sono incluse nel file aggiuntive 7: Tabella S7. Per quanto riguarda le mutazioni con possibile significato prognostico identificato nella nostra coorte, c'è stata una tendenza verso peggiore sopravvivenza generale associato con BRAF
mutazioni (p = 0,079), mentre nessuna associazione è stata trovata prognostico nella coorte TCGA in associazione con mutazioni in ERBB4
, ABL1
, JAK3
, FLT3
o FGFR3
. Figura 5 Confronto della frequenza delle mutazioni all'interno hotspot identificate nello studio di coorte utilizzando il pannello di sequenziamento, rispetto a mutazioni identificate utilizzando tutta sequenziamento nei dati TCGA. A) Le mutazioni attraverso hotspot mutazioni nei geni 46 nel pannello, B) mutazioni in TP53
, C) mutazioni nel gene KRAS
, e D) mutazioni nel segnale Wnt componenti APC
e CTNNB1
.
Discussione
Questo studio ha lo scopo di sondare l'utilità del pannello di sequenziamento per identificare i cambiamenti singolo nucleotide nella routine processati campioni resezione gastrica, che potrebbero essere utilizzati per guidare terapie mirate. Abbiamo secondariamente cercato di contrastare GEJ e carcinomi gastrici attraverso sequenziamento profondo mirato di un gruppo di 46 geni correlati al cancro, che ha rivelato alcune differenze a livello genomico che può riflettere differenti profili clinico-patologiche. Infine, abbiamo anche cercato di confrontare le frequenze di mutazioni ottenuti con questo pannello con i risultati di sequenziamento dell'intero esoma in The Cancer Genome Atlas.
Adenocarcinomi del tratto gastrointestinale sono molecolarmente eterogeneo e complesso [41-44]. Nel carcinoma gastrico, profondo sequenziamento di polimorfismi a singolo nucleotide e RNA array di espressione hanno recentemente rivelato anomalie in diversi percorsi tra cui WNT, Riccio, ciclo cellulare, il DNA riparazione dei danni e l'epitelio-to-mesenchimale transizione [45]. L'uso corrente di test multipli singolo gene è insostenibile dato questa complessità, in particolare in presenza di un numero crescente di terapie mirate, risorse limitate e disponibilità tissutale limitata. Pertanto, è auspicabile indagare più geni contemporaneamente. sequenziamento pannello ha una sensibilità prossima al 100% rispetto al test convenzionali come Sanger sequenziamento e metodi basati sulla PCR, così come la capacità di rilevare SNVs e indels a frequenze alleliche a partire da 5% e 20%, rispettivamente, in entrambi FFPE [21,46-48] e citologia esemplari [49-52]. Mirato sequenziamento del pannello in grado di rilevare le aberrazioni nei geni correlati al cancro nei primi tumori gastrici e lesioni precursori [53], e la sua copertura profonda potrebbe essere particolarmente utile nel cancro gastrico, fornendo risultati adeguati nonostante materiale bioptico scarsa e la mescolanza di cellule tumorali con desmoplasia e cellule infiammatorie.
putativi del driver mutazioni sono state identificate in una maggioranza di GEJ e carcinomi gastrici indagato in questo studio. Di gran lunga il gene mutato più frequentemente rilevata era TP53
, e queste mutazioni sono stati rilevati anche nelle lesioni in fase iniziale e precursori utilizzando lo stesso saggio [53]. Molteplici mutazioni del driver sono stati identificati in diversi casi, rafforzando l'idea che più geni devono essere interrogato in una sola volta nei tumori genomicamente complessi come adenocarcinomi gastrici. Un caso con una mutazione in BRAF
(così come FLT3 e FGFR3) è stato associato con una scarsa sopravvivenza globale sia su analisi univariata e multivariata. Questo risultato rispecchia una tendenza osservata nei dati TCGA verso scarsa sopravvivenza complessiva in BRAF
tumori -mutated, suggerendo che in alcuni casi pannello di sequenziamento potrebbe avere un ruolo prognostico.
Siamo stati anche in grado di rilevare le mutazioni potenzialmente attuabili in circa 20% dei casi, che ha coinvolto sia i geni o le vie in cui sono disponibili o in fase di sviluppo terapie mirate. Mentre questo numero sarebbe idealmente essere più alto, il nostro saggio coperto solo alcune regioni hotspot di questi geni, e non si tiene conto di alterazioni del numero di copie che potrebbe anche fornire indicazioni utili. Ulteriore affinamento di tali pannelli per includere una più ampia gamma di geni e segmenti di geni probabilmente aumenterà la percentuale di casi in cui sono identificati mutazioni. Ad esempio, anche se TP53
mutazioni avvengono attraverso il gene, il pannello comprende principalmente esoni 5-8, e alcuni dei segmenti genici che non sono stati sequenziati sono più frequentemente associata con perdita di p53 sulla immunoistochimica [54]. Questo fatto può potenzialmente spiegare sia le differenze nei tassi di TP53
mutazioni e modelli di espressione immunoistochimica osservati nel GEJ e dello stomaco. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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