Retrospectief onderzoek met behulp van doelgerichte deep sequencing onthult mutatie verschillen tussen de gastro-oesofageale overgang en maagcarcinomen

Retrospectief onderzoek met behulp van doelgerichte deep sequencing onthult mutatie verschillen tussen de gastro-oesofageale overgang en maagcarcinomen
Abstracte achtergrond
Adenocarcinomen van zowel de gastro-oesofageale overgang en de maag zijn moleculair complex, maar verschillen met betrekking tot de epidemiologie, etiologie en overleving. Er zijn weinig data direct vergelijken van de frequenties van enkele nucleotide mutaties in kankergerelateerde genen tussen de twee locaties. Sequencing van gerichte gen panelen kunnen nuttig zijn bij het opsporen van meerdere genomische afwijkingen met behulp van een enkele test.
Methoden
DNA van 92 gastro-oesofageale overgang en 75 adenocarcinoom resectie exemplaren werd geëxtraheerd uit in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsel. Gerichte diepe sequencing van 46 kanker-gerelateerde genen werd uitgevoerd door middel van emulsie PCR en halfgeleiders gebaseerde sequentiebepaling. Gastro-oesofageale overgang en gastrische carcinomen contrast ten opzichte mutatieprofielen, immunohistochemie en in situ hybridisatie
, alsmede een overeenkomstige clinicopathologic data.
Resultaten
gastro-oesofageale overgang carcinomen werden geassocieerd met jongere leeftijd, vaker intestinale-type histologie, vaker p53 overexpressie, en erger ziektevrije overleving op multivariabele analyse. Van alle gevallen werden 145 mutaties gedetecteerd in 31 genen. TP53
mutaties waren de meest voorkomende abnormaliteit gedetecteerd, en kwamen vaker voor bij gastro-oesofageale overgang carcinomen (42% vs. 27%, p = 0,036). Mutaties in de Wnt pathway componenten APC
en CTNNB1
vaker voor bij maag- carcinomen waren (16% vs. 3%, p = 0,006) en de maag carcinomen hadden meer kans om ≥3 driver mutaties ontdekt hebben (11% versus 2%, p = 0,044). Twintig procent van de gevallen had potentieel bruikbare mutaties geïdentificeerd. R132H en R132C missense mutaties in het IDH1
gen werden waargenomen, en zijn de eerste gerapporteerde mutaties in hun soort in maagcarcinoom.
Conclusies
Panel sequencing van routine pathologie materiaal kan mutatie informatie opleveren over verschillende driver genen, waaronder enkele die gerichte therapieën beschikbaar. Verschillende tarieven van de mutaties en clinicopathologic verschillen ondersteunen een onderscheid tussen adenocarcinomen die zich voordoen in de gastro-oesofageale overgang en degenen die zich voordoen in de maag juiste.
Sleutelwoorden
Maagkanker gastro-oesofageale overgang kanker Maagkanker genomics Maagkanker sequencing Achtergrond
Gastric kanker is goed voor meer dan 10.000 doden per jaar in de Verenigde Staten [1], en is de tweede meest voorkomende oorzaak van kankersterfte in de wereld [2]. Hoewel carcinomen van de gastro-oesofageale overgang (GEJ) zijn gegroepeerd met maagcarcinomen bij kanker registers en in klinische proeven voor gerichte therapieën [3], laesies deze twee plaatsen hebben verschillende klinische kenmerken. Adenocarcinomen van de maag juiste worden voornamelijk veroorzaakt door Helicobacter pylori infectie
[4] en dalen in incidentie wereldwijd [1]. Daarentegen zijn GEJ kankers meest geassocieerd met gastro-oesofageale refluxziekte [2-5] en obesitas [6], en de incidentie van GEJ carcinomen heeft in de afgelopen 20 jaar [7] stabiel gebleven. Daarnaast is de prognose van GEJ carcinomen opgemerkt slechter dan de maag carcinomen, en er is onzekerheid of GEJ carcinomen moet worden opgevoerd als de maag of de slokdarm tumoren [8]. Waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen carcinomen van de GEJ, slokdarm en maag kan het verzamelen van betekenisvolle epidemiologische data verbeteren en resulteren in een verhoogde precisie leiding [9].
Verschillende studies hebben verschillen in de moleculaire kenmerken van GEJ carcinomen versus defecten die genoteerd elders in de maag. TP53
mutaties vaker voor in de GEJ dan in de distale maag, terwijl het verlies van heterozygositeit van de TP53
locus is ook vaker voor bij GEJ tumoren [10,11]. Significante verschillen in de promoter methylering tarieven van de APC Kopen en CDKN2A
ook beschreven [12]. Bovendien verschillen in APC
mutatiesnelheden en eiwitexpressie, en de verschillen in globale genexpressieprofielen tussen de twee sites hebben ook aangetoond [13-16].
Testen van amplificaties van de ERBB2
( ook bekend als HER2
) gen in de maag en gastro-oesofageale overgang kanker is nu routine praktijk in veel instellingen [17]. Op dezelfde manier, het testen voor de bestuurder mutaties, in het bijzonder single nucleotide substituties, in oncogenen en tumorsuppressorgenen informeert momenteel behandeling in adenocarcinomen van andere bezienswaardigheden, zoals de longen en dikke darm [18-20]. Als verdere moleculaire doelwitten zijn ontdekt in aandoeningsplaatsen zal effectief assays vereist om kanker gevoeligheid 'gerichte behandeling.
Nieuwe generatie sequencing kan worden gebruikt in de nabije toekomst meerdere genen ondervragen in een enkel monster, en deze gegevens kunnen worden gebruikt om artsen van de bestuurder mutaties te informeren en te begeleiden gerichte behandeling. Gerichte panel sequencing is een vorm van next-generation sequencing, waar single nucleotide varianten worden gedetecteerd in een beperkt aantal vooraf bepaalde genomische loci, die door opzet vaak prognostisch en therapeutisch kritisch. Panel sequencing maakt multiplexing van de monsters, en diepe dekking (> 500x) vergemakkelijkt de analyse van suboptimale template materiaal uit archiefmateriaal weefsel en monsters met een lage tumor cellulariteit. De smallere reeks genen maakt het ook mogelijk voor een snellere specimen verwerking en bioinformatica analyse. Zo kunnen bruikbare resultaten te verkrijgen binnen enkele dagen, in plaats van de weken, vergeleken met gehele genoom en exome benaderingen. Echter, wordt data beperkt door de inherente vooringenomen selectie van genen, en het onvermogen om duplicaties, verlies van heterozygositeit en structurele herschikkingen zoals genfusies detecteren. Zo is het effectieve gebruik van NGS vereist een zorgvuldige beoordeling van technologieën, assay beperkingen, sjabloon eisen, en het onderzoek en klinische onderzoek onderworpen vraagstukken. Ondernemingen De doelstellingen van dit onderzoek werden aan het nut van panel sequencing op in formaline gefixeerde paraffine sonde ingebedde (FFPE) weefsel, en klinisch geannoteerde GEJ en maagcarcinomen vergelijken door paneel sequencing van de hotspots van 46 kankergenen. We hebben ook geprobeerd om de frequenties van mutaties geïdentificeerd met panel sequencing van hotspots tegen whole-exome sequencing, het gebruik van publiekelijk beschikbare gegevens van The Cancer Genome Atlas vergelijken.
Methods
Case selectie en het ophalen van gegevens clinicopathologic
Institutional ethiek goedkeuring werd verkregen van de Universiteit van British Columbia /British Columbia Cancer Agency onderzoek ethiek board (# H07-2807), en het onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van Helsinki. Gevallen van maagcarcinoom werden opgehaald uit departementale archieven van het British Columbia Cancer Agency (BCCA), een provinciale referentiecentrum. Inclusie criteria waren doorverwijzing naar het bureau tussen 2004 en 2010, beschikbaar FFPE weefsel van chirurgische resectie van de primaire tumor, compleet clinicopathologic gegevens, inclusief klinische resultaten over de follow-up, en de afwezigheid van metastatische ziekte bij presentatie. Biopten van primaire en metastatische laesies werden uitgesloten wegens het ontbreken van volledige pathologische data. GEJ locatie werd gedefinieerd als letsels met een epicentrum op 5 cm van het proximale uiteinde van de maag Rugal plooien [21]. Geen onderscheid gemaakt tussen tumoren met betrekking tot de locatie van het epicentrum binnen 5 cm van de GEJ (d.w.z. Siewert soort werd niet opgenomen) [22]. Carcinomen uitsluitend gelegen in de slokdarm werden uitgesloten, volgens de meest recente WHO criteria [21]. Alle maagtumoren zich distaal van de GEJ werden samen weggegooid voor deze studie. Clinicopathologische gegevens werden retrospectief verzameld via herziening van grafieken van patiënten door een lid van de klinische team, maar ook via de evaluatie van de pathologie rapporten.
Tissue microarray bouw, immunohistochemie en in situ
hybridisatie
Tissue microarray bouw was uitgevoerd met behulp van twee 0,6 mm kernen uit twee afzonderlijke delen van de tumor. Immunohistochemische kleuring voor p53 (1: 100; kloon DO-7, Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), Baf250a (1:75, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), en de mismatch reparatie (MMR) proteïnen waaronder hMLH1 (01:25; kloon ES05, ​​Leica, Wetzlar, Duitsland), MSH2 (1: 5; kloon 25D12, Leica), hMSH6 (1: 300; kloon PU29, Leica) en hPMS2 (1: 150; kloon MOR4G, Leica ) werd uitgevoerd op de XT platform (Ventana). Expressie van p53 werd gescoord als afwezig (< 1% nucleaire kleuring), normaal (1-60% nucleaire kleuring van elke intensiteit), of overexpressie (> 60% nucleaire kleuring van elke intensiteit). Baf250a en MMR eiwitten werden als intacte (≥1% kleuring) of negatief (< 1% kleuring) gebaseerd op eiwitexpressie specifiek tumorcellen (d.w.z. immune en stromale expressie werd genegeerd). ERBB2
zilver in situ hybridisatie
(SISH) werd uitgevoerd met het XT automatische IHC /ISH kleuring platform (Ventana). A ERBB2 extra's: CEP17 verhouding < 2,0 werd geclassificeerd als niet-versterkte en een waarde ≥2.0 als versterkt. Opsomming van SISH signalen is gebaseerd op vastgestelde protocollen [17].
DNA monster verwerking, sequencing, en variant bellen
In elk geval, hematoxyline en eosine slides werden gebruikt om macrodissection of scrollen van tumorweefsel te leiden uit FFPE schuift volgende waarin van tumoren door een anatomische patholoog. Tumor DNA van elk geval werd geëxtraheerd met behulp Qiagen FFPE DNA extractie kit (Qiagen, Venlo, Nederland); geen kiemlijn DNA werd geëxtraheerd. Geëxtraheerd DNA werd gekwantificeerd met behulp van de qubit HS dsDNA assay (Life Technologies Gaithersburg, MD, USA); alle gevallen had minste 10 ng DNA geëxtraheerd uit FFPE, in overeenstemming met een eerder gerapporteerde vereiste voor de assay [21]. Een minimum A260 /280-verhouding van 1,8 nodig was voor elk DNA-monster. DNA amplicon bibliotheekconstructie werd uitgevoerd met behulp van DNA primers van de Ion Ampliseq ™ Cancer hotspot Panel v1 (Life Technologies). De kit bestaat uit 207 primer paren die 739 hotspots binnen 46 kanker-gerelateerde genen (Extra file 1: Tabel S1) te dekken. Geïndexeerde amplicon banken werden samengevoegd voor emulsie polymerase kettingreactie en sequencing op Ion Torrent PGM platform (Life Technologies). Een minimum van ten minste 500x basenparen dekking nodig was voor elk geval. Variant calling werd uitgevoerd met de Torrent variant beller v2.2 (Life Technologies) met de hg19 referentie genoom. varianten alleen aanwezig bij frequenties ≥5% werden beschouwd. Omdat kiemlijn DNA was niet beschikbaar voor vergelijking werden uitgesloten varianten mogelijk somatische mutaties als hun identiteit als enkelvoudige nucleotide polymorfismen gemiddelde allelfrequenties van >.... 0 in de dbSNP gegevensbank (NCBI NLM www nih gov /SNP); hun status van niet-kiembaan varianten werd verder bevestigd met behulp van een PubMed zoeken (www. NCBI. NLM. nih. gov /pubmed).
Vergelijking met het Cancer Genome Atlas (TCGA) gegevens
Curated somatische mutatie oproepen tot 281 TCGA maag adenocarcinoom monsters met bekende anatomische plaatsen werden opgehaald uit de TCGA data Portal (http:... //TCGA-gegevens NCI NIH gov /TCGA /) op 19 februari 2014. eiwit-coderende mutaties in de geamplificeerde de Ion Ampliseq ™ Cancer hotspot Panel v1 in elk van de 46 genen gebieden werden verkregen kisten en gestratificeerd op locatie (60 cardia /proximale en gastro-oesofageale overgang versus
221 fundus /body, antrum /distale maag en NOS). Nummer kopiëren van gegevens, RNA-expressie data, en eiwitexpressie gegevens werden niet beschouwd als onze eigen test alleen detecteert single nucleotide varianten (SNVs) en kleine basenparen inserties /deleties (INDELs). De frequentie van mutaties, ongeacht het type mutatie, vergeleken versus de hotspot MPF sequentie die we uitgevoerd.
Gegevensanalyse
Mann-Whitney U-test en student t-testen werden gebruikt om lineaire variabelen te vergelijken, waar passend. Fisher exact en chi-kwadraat testen, in voorkomend geval, werden gebruikt om categorische waarden te vergelijken. Survival analyses werden uitgevoerd met behulp van log-rank (Kaplan-Meier) en Cox proportionele risico's testen. Het paneel 46 genen werden toegewezen aan de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) [22,23] en de Ingenuity® geïntegreerd traject analyseprogramma (Qiagen) oncogene routes en netwerken verrijkt mutaties te identificeren en te testen op statistisch significante verschillen tussen gastro-oesofageale overgang en adenocarcinoom van de maag exemplaren. P
waarden werden gecorrigeerd voor meerdere testen met behulp van de Benjamini-Hochberg (BH) correctie [24]. Alle statistische tests werden twee staart en een P
waarde van < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS Statistics software (v22, IBM, Armonk, NJ, USA) en de R statistische taal v.2.15.1 (R Core Team (2012) R:.. Een taal en omgeving voor statistische berekeningen R Stichting . statistische Computing, Wenen, Oostenrijk ISBN 3-900051-07-0, URL http:... //www R-project org /)
Resultaten
Binnen departementale archieven op BCCA, 229 resectie exemplaren van maag- en GEJ carcinomen werden verkregen 2004-2010 en waren beschikbaar voor de bouw van een tissue microarray. DNA beschikbaar was voor de winning van 176 gevallen. Geen clinicopathologic gegevens beschikbaar was voor correlatie in 6 gevallen. Drie gevallen had metastatische ziekte gedocumenteerd binnen een maand na de presentatie, en deze werden van de analyse uitgesloten. Van de overige 167 gevallen, 92 afkomstig uit het gastro-oesofageale overgang en 75 ontstaan ​​in de rest van de maag (figuur 1). Figuur 1 Stroomdiagram detaillering case-selectie en uitsluiting voor de studie cohort.
Clinicopathologische verschillen tussen GEJ en maagcarcinomen
De clinicopathologic kenmerken van deze gevallen zijn samengevat in tabel 1 en geanonimiseerde klinische gegevens wordt voorzien in een aanvullend bestand (Extra file 2: Tabel S2). GEJ carcinomen werden geassocieerd met jongere leeftijd bij resectie, vaker intestinaal-type en minder frequent diffuse histologie, vaker p53 overexpressie en minder frequent verlies van p53-expressie, vaker stadium III, minder frequent stadium I ziekte, en meer frequente recidieven. Ziektevrije overleving was significant slechter bij patiënten met GEJ carcinomen (Figuur 2A), hoewel de twee cohorten waren niet statistisch verschillend in termen van algemene overleving (Figuur 2B). Other features clinicopathologic waren vergelijkbaar tussen tumoren van de twee locaties, waaronder T-stadium betrokkenheid resectierand ERBB2
amplificatie en MMR eiwitverlies (tabel 1). Het percentage diffuse carcinomen in de indeling Lauren) was vergelijkbaar tussen de twee locaties. Subgroepanalyse van slechts intestinaal type carcinomen vertoonde hardnekkige verschillen tussen GEJ en maagcarcinomen in ziektevrije overleving en p53 expressie. Verschillen in leeftijd, p53 en resultaat bleef bij het overwegen alleen intestinaal type carcinomen, alsmede bij tumoren werden gestratificeerd in drie subtypen (proximaal niet- diffuse, diffuse en distale niet-diffuse) zoals voorgesteld door Shah et al. [16] (Extra file 3: Tabel S3) .table 1 Samenvatting van de clinocopathologic variabelen in clinicopathologic variabelen het cohort binnen cardia en non-cardia adenocarcinoom
Clinicopathologische variabele
Gastro-splitsing (n = 92)

Non-cardia (n = 75)
Algemeen (n = 167)
p
Age (gemiddelde, jaar)
61,5 + /- 9.6 [33-80]
66,3 +/- 11,9 [33-84]
63,7 +/- 10,9 [33-84]
0.001
Sex
0,297
Man
70 (76)
51 (68)
121 (73)
Vrouw
22 (24)
24 (32)
46 (27)
histologische subtype (Lauren)
0.008
Intestinale
(35) 65 (71)
36 (48)
101 (60)
Zend
15 (16)
26
41 (25)
Mixed
12 (13)
13 (17)
25 (15)
Stage (AJCC)
0,031 IA-B

10 (11)
19 (25)
29 (17)
IIA-B
60 (65)
45 (60)
105 (63)
III-AC
22 (24)
11 (15)
33 (20)
Grade
0,415
goed gedifferentieerd (G1) verhuur 4 (5)
10 (6)
Matig gedifferentieerd (G2)
39 (42)
25 (33)
64 (38)
slecht gedifferentieerde (G3)
47 (51)
46 (61)
93 (56)
resectie marge
0,306
niet-betrokken
74 (80)
65 (87)
139 (83)
Betrokken
18 (20)
10 (13)
28 (17)
ERBB2 versterking
0,654
Afwezig
78 (85)
66 (88)
144 (86)
Presenteer
14 (15)
9 (12)
23 (14)
BAF250a (ARID1A) expressie
0,111
Intact
73 (79)
51 (68)
124 (74)
Afwezig
19 (21)
24 (32)
43 (26)
p53 expressie
2.8x10 -4
0 - afwezig
32 (35)
47 (63)
79 (47)
1 - normaal (1-60%)
17 (19)
14 (19)
31 (19) Pagina 2 - verhoogd (> 60%)
43 (47)
14 (19)
57 (34)
mismatch repair eiwitten
0,244
Intact
77 (84)
57 (76)
135 (80)
Abnormale
15 (16)
18 (24)
33 (20)
aantal recidieven
57 (62)
32 (43)
89 (53)
0.019
mediane progressievrije overleving (maanden)
12
18
15
Aantal sterfgevallen
69 (75)
48 (64)
117 (70)
0.130
De mediane totale overleving (Maanden )
18,0
23,0
20.0
Figuur 2 Vergelijking van de ziektevrije overleving en de totale overleving tussen patiënten met gastro-en maag carcinomen. A) ziektevrije overleving was significant slechter voor gastro-oesofageale carcinomen (doorgetrokken lijnen) in vergelijking met de maag carcinoms (stippellijnen), log-rank test; p = 0,002, hoewel B) de totale overleving verschilde niet tussen de twee ziekte sites (Log-rank test;. p = 0,225)
Op multivariate analyse werd GEJ locatie onafhankelijk geassocieerd met een slechtere ziektevrije overleving (Cox = 2,08 [95% betrouwbaarheidsinterval: 1,25-3,44], p = 0,005), samen met de status van de marge en microsatelliet instabiliteit (Extra file 4: Tabel S4). Leeftijd, tumor rang en betrokkenheid marge waren onafhankelijk prognostische van de totale overleving (Extra file 5: Tabel S5).
Mutaties geïdentificeerd met de kanker panel
Onder alle gevallen, 145 mutaties werden gedetecteerd in 31 genen, met 75 mutaties gedetecteerd bij 57 van de tumoren uit de GEJ en 70 mutaties gedetecteerd bij 43 maagtumoren (figuur 3). Geen mutaties werden gedetecteerd in 35 (38%) en 32 (43%) van de tumoren van de maag en GEJ respectievelijk. TP53
was het meest gemuteerde genen, met varianten die in 59 van 167 gevallen (35%). De volgende meest gemuteerde genen waren PI3KCA
(6%), CTNNB1
(5%), KRAS
(5%) en SMAD4
(4%). Andere varianten opgenomen hotspot mutaties in IDH1
(2 gevallen), JAK3
(3 gevallen), en FLT3
(2 gevallen). Een enkele mutatie werd geïdentificeerd in 70 gevallen (42%), werden 2 mutaties geïdentificeerd in 20 gevallen (12%) en ≥3 mutaties werden in 10 gevallen (6%). Figuur 3 Somatische mutaties geïdentificeerd in de gastro-oesofageale overgang en maag carcinomen. TP53
mutaties werden geïdentificeerd in een groter deel van de gastro-oesofageale overgang tumoren, terwijl afwijkingen in APC Twitter /CTNNB1
kwamen vaker voor in de maag tumoren. Zwarte blokken vertegenwoordigen afkappen mutaties, terwijl grijze blokken vertegenwoordigen missense mutaties. Gevallen en genen waarin mutaties niet werden geïdentificeerd zijn niet inbegrepen. Verhuur No mutaties werden geïdentificeerd binnen de hotspot regio's van ALK
, CSF1R
, EGFR
, FGFR2
, HNF1A
, HRAS
, JAK2
, MPL
, NPM1
NRI
, SRC
, STK11 golfreizen of VHL
. Alle variant gesprekken zijn beschikbaar in de aanvullende gegevens (Extra file 6: Table S6).
Verschillen in mutaties tussen de GEJ en maag
TP53
mutaties werden geïdentificeerd in 39 van de 92 (42%) van GEJ tumoren en in 20 van 75 (27%) maagtumoren (p = 0,036). Wanneer onderverdeeld in de 3 subtypen door Shah et al voorgesteld. [16], TP53
mutaties vaker voorkwamen bij nondiffuse proximale kankers (44%) dan in diffuse kankers (37%) en distale nondiffuse kanker (20%; p = 0,024). Deze indeling toonde ook vaker mutaties in KRAS
binnen distale nondiffuse kanker (12%) versus proximale nondiffuse (3%) en diffuse (0%) carcinomen (p = 0,12). Geen significante verschillen in mutatiefrequentie aanwezig tussen de andere individuele genen in het paneel. Twee componenten van de Wnt-route, APC
CTNNB1
, waren in totaal vaker gemuteerd in de maag carcinomen dan in GEJ tumoren (16% vs. 3%, p = 0,006). Maagcarcinomen had vaker mutaties in 3 of meer genen (11% vs. 2%, p = 0,044; Figuur 4). Geen verschillen in de betrokkenheid van oncogene routes opgemerkt tussen de twee locaties op basis mutatieprofielen. Figuur 4 aandelen van GEJ en maag carcinomen met nummers van geïdentificeerde totaal en bruikbare mutaties. Solid donkere gebieden in de kolommen vertegenwoordigen gevallen met 1 mutatie, diagonaal donker omzoomde gebieden vertegenwoordigen gevallen met 2 mutaties, en gevlekte gebieden vertegenwoordigen gevallen met 3 of meer mutaties.
Potentieel bruikbare mutaties
Gerichte therapieën beschikbaar zijn of in ontwikkeling voor mutaties die zich in de volgende genen: AKT
[25], BRAF
[26], ERBB2
[27], ErbB4
[28], FGFR1
[29], FGFR3
[30], FLT3
[31,32], IDH1
[33], JAK3
[31], KDR
[34,35], KRAS
[36], BMO
[34], PDGFRA
[37], PIK3CA
[25], PTEN
[25], PTPN11
[38], RET
[39], SMO
[40]. Mutaties in deze genen werden geïdentificeerd in 32 gevallen (19%), met inbegrip van 6 gevallen (4%) met 2 mutaties en 3 gevallen (2%) met ≥3 mutaties. De verdeling van bruikbare mutaties was niet significant verschillend tussen GEJ en maagcarcinomen. (P = 0,327; Figuur 4)
Prognostische significantie van mutaties
ErbB4
mutaties werden geassocieerd met slechtere ziektevrije overleving (p = 0,018 ), terwijl er een trend naar een slechtere ziektevrije overleving geassocieerd met mutaties in ABL1
(p = 0,063) en JAK3
(p = 0,059). Geen van deze mutaties waren prognostisch significant na controle voor leeftijd, geslacht, Lauren subtype, stadium, graad en margestatus. Mutaties in BRAF
(p < 0,001), FGFR3
(p < 0,001), FLT3
(p < 0,001) geassocieerd met slechtere overleving op univariate analyse als resultaat van één case met mutaties in deze drie genen.). BRAF mutatie
bleef prognostisch significant na de boekhouding voor leeftijd, geslacht, Lauren subtype, stadium, rang en marge-status (p = 0,002).
Vergelijking met TCGA data
Bij de beoordeling van de hotspot regio's die onder de sequencing-paneel het totale aantal gemuteerde genen per case vergelijkbaar tussen de TCGA en studiecohorten (p = 0,659), ook wanneer het vergelijken hetzij GEJ (p = 0,399) of gastrische (p = 0,845) tumoren alleen (Figuur 5A). Een trend naar frequentere gevallen met mutaties in genen ≥3 in de maag ten opzichte van de GEJ werd ook waargenomen in de TCGA data (12% vs. 3%, p = 0,054). De totale frequentie van TP53
mutaties was niet verschillend tussen de studie cohort en de TCGA cohort (p = 0,230). Geen verschillen in TP53
, KRAS
en APC Twitter /CTNNB1
mutatie tarieven tussen GEJ en maag- carcinomen werden waargenomen in de TCGA dataset (figuren 5B-D). De gemuteerde genen in de TCGA dataset zijn opgenomen in de aanvullende file 7: Tabel S7. Wat de mutaties met mogelijke prognostische betekenis die in ons cohort, was er een trend naar een slechtere overleving geassocieerd met BRAF
mutaties (p = 0,079), terwijl er geen voorspellende verband gevonden in de TCGA cohort geassocieerd met mutaties in ErbB4
, ABL1
, JAK3
, FLT3 golfreizen of FGFR3
. Figuur 5 Vergelijking van de mutatiefrequentie in hotspots die in de studie cohort gebruikend paneel sequencing tegenover mutaties geïdentificeerd onder toepassing exoom sequencing in het TCGA data. A) Mutaties over mutatie-hotspots in de 46 genen in het paneel, B) mutaties in TP53
, C) mutaties in KRAS
, en D) mutaties in de Wnt-signalering componenten APC Kopen en CTNNB1
.
Discussie
Dit onderzoek was gericht op het nut van paneel sequencing sonde identificeren enkele nucleotide veranderingen routinematig verwerkte maagresectie specimens die kunnen worden gebruikt voor gerichte therapieën te leiden. We wilden secundair contrast GEJ en maagcarcinomen door gerichte sequentie-analyse van een panel van 46 kanker-gerelateerde genen, waarvan sommige verschillen op genomisch niveau kan met uiteenlopende clinicopathologic profielen geopenbaard. Tenslotte hebben we ook getracht de frequentie van mutaties verkregen met dit paneel met resultaten van exoom sequentiebepaling De Cancer Genome Atlas vergelijken.
Adenocarcinomas van het maagdarmkanaal moleculair heterogeen en complex [41-44]. In maagcarcinoom, hebben diepe sequencing single nucleotide polymorfisme en RNA-expressie arrays onlangs onthuld afwijkingen in verschillende routes, waaronder WNT, Hedgehog, celdeling, DNA-schade te herstellen en de epitheliale-to-mesenchymale transitie [45]. Het huidige gebruik van meerdere enkele gentests onhoudbaar gezien die complexiteit name bij aanwezigheid van steeds meer gerichte therapie, beperkte middelen en beperkte beschikbaarheid weefsel. Aldus is het wenselijk om meerdere genen gelijktijdig te onderzoeken. Paneel sequencing een sensitiviteit van bijna 100% ten opzichte van conventionele testen zoals Sanger sequentiebepaling en PCR-gebaseerde methoden, alsmede het vermogen om SNVs en INDEL bij allel frequenties zo laag als 5% en 20%, respectievelijk detectie, in beide FFPE [21,46-48] en cytologie specimens [49-52]. Gerichte panel sequencing kunnen afwijkingen in kanker-gerelateerde genen op te sporen in het begin van maagkanker en voorlopers laesies [53], en zijn diepe dekking zou bijzonder nuttig zijn bij maagkanker te zijn door het verstrekken van adequate resultaten ondanks weinig biopsie materiaal en de vermenging van tumorcellen met desmoplasie en ontstekingscellen.
Vermeende driver mutaties werden geïdentificeerd in de meeste GEJ en maagcarcinomen onderzocht in deze studie. Verreweg de meest frequent gemuteerde gen gedetecteerd TP53
en deze mutaties zijn ook gedetecteerd in vroeg stadium en precursor laesies met dezelfde assay [53]. Meerdere driver mutaties werden geïdentificeerd in een aantal gevallen, de versterking van het idee dat meerdere genen nodig hebt om in een keer in het genoom complexe tumoren worden ondervraagd, zoals de maag adenocarcinomen. Een behuizing met een mutatie in BRAF
(en FLT3 en FGFR3) geassocieerd met een slechte overleving zowel univariate en multivariate analyse. Deze bevinding weerspiegelt een trend waargenomen in de TCGA gegevens in de richting van een slechte algehele overleving in BRAF
-mutated tumoren, wat erop wijst dat in sommige gevallen panel sequencing kan een prognostische rol hebben.
Wij waren ook in staat om potentieel bruikbare mutaties in ongeveer detecteren 20% van de gevallen die ofwel genen of routes waarbij gerichte therapieën beschikbaar of in ontwikkeling zijn betrokken. Hoewel dit aantal idealiter hoger zou zijn, alleen onze test gedekt bepaalde hotspot gebieden van deze genen, en hield geen rekening met copy aantal veranderingen die ook nuttige informatie kunnen opleveren. Verdere verfijning van dergelijke panelen een breder scala van genen en gensegmenten bevatten waarschijnlijk het aandeel van gevallen waarin mutaties zijn geïdentificeerd. Hoewel bijvoorbeeld TP53
mutaties optreden gedurende het gen, de deksels van vooral exons 5-8, en sommige van de gensegmenten die niet werden gesequenced worden vaker geassocieerd met verlies van p53 op immunohistochemie [54]. Dit feit kan mogelijk zowel de verschillen in de percentages van TP53
mutaties en patronen van immunohistochemische expressie waargenomen in de maag en GEJ leggen. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• De rol van de PET /CT in de opsporing van maagkanker recurrence
• Cytoreductieve chirurgie plus hypertherme intraperitoneale chemotherapie verbetert de overleving van maagkanker met peritoneale carcinomatosa: bewijsmateriaal van een experimentele study