Survivin genet nivåer i perifert blod hos pasienter med magekreft uavhengig forutsi survival

Survivin genet nivåer i perifert blod hos pasienter med magekreft uavhengig forutsi overlevelse
Abstract
Bakgrunn
deteksjon av sirkulerende tumorceller (CTC) er ansett som en lovende verktøy for å forbedre risikovurderingen hos pasienter med solide tumorer. Vi undersøkte om uttrykket av CTC relaterte gener legger noen prognostisk strøm til TNM staging system hos pasienter med magekreft.
Metoder
Sytti pasienter med TNM stadium I-IV magekreft ble retrospektivt registrert. Perifere blodprøver ble testet ved hjelp av kvantitativ sanntids-PCR (qrtPCR) for ekspresjon av fire CTC relaterte gener: carcinoembryonic antigen (CEA), cytokeratin-19 (CK19), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og Survivin (BIRC5).
Resultater
Gene uttrykk for survivin, CK19, CEA og VEGF var høyere enn i normale kontroller i 98,6%, 97,1%, 42,9% og 38,6% av tilfellene henholdsvis, noe som tyder på en mulig diagnostisk verdi av både survivin og CK19 . På multivariabel overlevelsesanalyse, ble TNM staging og Survivin mRNA nivåer beholdt som uavhengige prognostiske faktorer, viser at Survivin uttrykk i perifert blod legger prognostisk informasjon til TNM-systemet. I motsetning til tidligere publiserte data ble avskrift overflod av CEA, CK19 og VEGF ikke assosiert med pasientens kliniske utfall.
Konklusjoner
genuttrykk nivåer av Survivin tilføre betydelig prognostisk verdi til gjeldende TNM staging system. Valideringen av disse funnene i større prospektive og multicentric serien kan føre til gjennomføringen av denne biomarkør i rutinen klinisk setting for å optimalisere risikolagdeling og til slutt tilpasse terapeutiske behandlingen av disse pasientene.
Bakgrunn
Magekreft representerer den fjerde vanligste kreftformen og andre ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Den estimerte nåværende forekomst av magekreft er ca 16,2 /100 000 personer /år (verden standardisert rate, WSR), med høyest forekomst i Øst-Asia, Øst-Europa og Sør-Amerika [1]. I dag er den eneste prognostisk system rutinemessig ansatt for behandling av magekreftpasienter er basert på International Union Against Cancer Tumor-Node-metastaser (TNM) staging system [2], hvor graden av svulst penetrasjon (PT) og lymfeknutestatus (PN) [3] er de to viktigste prognostiske indikatorer i pasienter uten fjernt metastatisk sykdom. Pasienter i tidlige stadier anses kandidater for helbredelse ved kirurgi. Men 50% av magekreftpasienter som lider av tumor tilbakefall selv etter radikal kirurgi [4, 5]. Dermed gjør den nåværende staging system ikke ut til å nøyaktig forutsi enkelte pasient risikoen for kreft tilbakefall. Faktisk denne klassifiseringen identifiserer hovedkategorier med vesentlig forskjellig prognostisk undergruppe innenfor hvert trinn, som gjør dette systemet suboptimal for en personlig terapeutisk tilnærming. Dette er eksemplifisert ved det faktum at noen pasienter i dag klassifisert som "lav risiko" ikke er sendt til adjuvant behandling, selv om de opplever sykdommen tilbakefall. Vice versa, noen pasienter for tiden gjennomgår adjuvant behandling på grunn av "høy risiko" TNM klassifisering, ville ikke trenger denne behandlingen [6]. For å løse dette problemet og forbedre prognosen for pasienter, er nye parametere pålitelig forutsi pasientens utfall presserende behov. Pasienter som hadde gjennomgått potensielt kurative operasjoner beholde risikoen for tilbakefall som stammer fra mikroskopiske kreft rester kjent som minimal restsykdom (MRD). MRD kan påvirke ulike kropps avdelinger, inkludert benmargen, lymfeknuter og perifert blod [7]. I de senere år har flere studier rettet på påvisning av sirkulerende tumorceller (CTC) med hensyn til deres kliniske implikasjoner for pasienter med magekreft. Som et resultat, har kvantitative sanntid polymerase kjedereaksjon (qrtPCR) og variasjoner av denne teknikken, som anses å være den mest følsomme metode for evaluering av genekspresjon, er brukt i påvisning av tumor markører som indikerer tilstedeværelse av CTC i blod [8].
i dagens analyse, vi forsøkte å profilere perifert blod på 70 patenter berørt med adenokarsinom i ventrikkel ved hjelp qrtPCR. Vi testet fire biomarkører, to av tilstedeværelse, ad to av aggressivitet av svulsten, og en av disse, Survivin, legge uavhengig prognostisk strøm til TMN staging system. Dette kan gi rom for en bedre lagdeling av pasientens risiko og dermed en bedre terapeutisk ledelse, spesielt i adjuvant
Metoder
Pasienter
I denne studien har vi registrert 70 pasienter (39 menn, 31 kvinner,. Aldersgruppe 28 - 90 år, median alder 68 år) som gjennomgikk kirurgi (hel eller delvis gastrektomi) for histologisk påvist magekreft mellom oktober 1998 og november 2007, og for hvem en perifer blodprøve var tilgjengelig. Studien, som er i samsvar med Helsinkideklarasjonen, ble godkjent av den lokale etiske komiteen ved Universitetet i Padova (godkjenningsnummer: 70/2006). Skriftlig informert samtykke om bruk av biologiske prøver for prøvingsformål ble innhentet fra alle pasienter. På tidspunktet for analysen, 33 (47,1%) var i live, mens 37 (52,9%) hadde dødd. Median oppfølgingstid på 15 måneder (spredning: 6-119 måneder). Median overlevelse var 25 måneder. Tumor egenskaper er oppsummert i tabell 1. Dybden av tumorinvasjon (T kategori), ble graden av lymfeknutemetastaser (N kategori) og makroskopiske metastase (M kategori) kategorisert i henhold til de UICC TNM staging system.Table 1 Pasienter og tumor egenskaper .
Parametere
N product: (%)
Pasienter
alle 70
(100,0)
male 39 product: (55,7)
kvinnelige
31 product: (44,3)
Alder (år)
≤ 65
21
(30,0)
> 65
49 product: (70,0)
beliggenhet
multicentric
5 product: (7.1)
øvre tredjedel
11 product: (15,7)
midtre tredjedel
19 plakater (27,1)
nedre tredjedel
35
(50,0)
TNM stadium
I (IA + IB)
10 plakater (14,3)
II
14 product: (20,0)
III (IIIA + IIIB)
19 plakater (27,1)
IV
27 plakater (38,6)
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
human gastrisk karsinom cellelinje NCI-N87, erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, USA), ble inkubert i RPMI-1640-medium (Invitrogen - Gibco, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt kalveserum . (Euroclone - Celbio, Pero, MI), 10 mM Hepes, 1 mM natriumpyruvat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ved 37 ° C i 5% CO 2
NCI-N87 er en gastrisk karsinom cellelinje avledet fra en levermetastase fra et godt differensiert karsinom i magen tatt før kjemoterapi. Ifølge produsentens dataark, celler uttrykker overflate glykoproteiner carcinoembryonic antigen (CEA).
Cell spiking eksperimenter, En celle spiking studie ble utført for å bestemme sensitiviteten av denne qrtPCR teknikk for å påvise kreftceller i perifert blod mononukleære celler (PBMC). PBMC ble oppnådd fra friske frivillige og ble tellet og fortynnet 1: 1 i RPMI-medium. Gastric kreftceller N87 ble talt og serielt fortynnet fra 1 × 10 6 celler /ml til en celle /milliliter i PBMC. Total RNA ble ekstrahert og reverse transkribert fra 2 ml av hver fraksjon. qrtPCR for to gener av interesse ble deretter utført som beskrevet nedenfor.
Prøvetaking, RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese, En 6 ml prøve av venøst ​​blod ble oppnådd fra hver pasient ved tidspunktet for kirurgi. Utvalgets behandling ble utført i løpet av to timer etter blod trekning. Prøven ble sentrifugert ved 2000 x g i 10 minutter, og PBMC-fraksjon ble samlet opp og lagret i flytende nitrogen.
Frosne prøver ble tint og total-RNA ble ekstrahert ved bruk av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-metoden (Trizol reagens, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Integriteten av det isolerte RNA ble etablert ved qrtPCR analyse av det endogene gen referanse beta-aktin (b-aktin) som beskrevet under [9] Total RNA. Plakater (7 pg pr 100 ul sluttreaksjonsvolum) ble reverstranskribert ved å bruke tilfeldige primere og MultiScribe revers transkriptase (High-Capacity cDNA revers transkripsjon kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 10 minutter ved 25 ° C, deretter ved 37 ° C i 120 minutter. cDNA ble lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon
Den transkripsjonelle nivåer av fire gener (dvs. carcinoembryonic antigen [CEA], cytokeratin-19 [CK19], Survivin og vaskulær endotelial vekstfaktor [VEGF]) ble målt i det perifere blod hos pasienter ved hjelp av kvantitativ sanntid PCR (qrtPCR) ved hjelp av den relative kvantifisering metode (2 -ΔΔCt metode) [10, 11]. Ved hjelp av to -ΔΔCt metode dataene er presentert som fold-forandring i gen-ekspresjon normalisert med en referanse-gen og i forhold til en kalibrator prøve. Hensikten med normaliseringsprosessen er å justere verdien som representerer de transkripsjonelle nivået av hvert gen av mengden av mRNA til stede i hver prøve: dette oppnås vanligvis ved å dividere uttrykket nivåer av hvert gen av interesse ved de av en referanse-gen (også kalt "housekeeping" genet). Rengjøring gener uttrykkes konstitutivt og - ideelt sett - ikke er berørt av eksperimentelle manipulasjoner: Derfor bør de omtrent gjenspeile den totale mengden av mRNA testet i hver prøve [12]. Som referansegenet i denne studien vi brukte beta-aktin, en av de mest brukte husholdningsgener.
I en relativ kvantifisering PCR-undersøkelsen er den såkalte "kalibrator" representert ved genekspresjon av en valgt prøve ved hvilken uttrykket profilen for hver prøve av interesse justeres: denne fremgangsmåten gjør det mulig for undersøkeren å sammenligne ekspresjonsprofilen av prøvene av interesse med hverandre i form av deres fold-endring med hensyn til en enkelt prøve (kalibratoren)
. vanligvis er kalibratoren en ubehandlet prøve (for eksempel i en funksjonell undersøkelse), en prøve ved tiden null (for eksempel i en tidsstudium) eller en hvilken som helst ikke-relaterte prøve (f.eks friske kontroller i en pasienter undersøkelse, eller normale fibroblaster i en kreftcelle Online studie) [10]. En pool av cDNA avledet fra PBMC fra 20 friske donorer ble anvendt som kalibrator kilde i vårt studium. Evaluering av to -ΔΔCt indikerer ganger endring i genuttrykk i forhold til kalibratoren. For kalibratoren den ΔΔCt er lik null, og 2 0 er lik en, så at folden forandring i gen-ekspresjon i forhold til den kalibratoren er lik en, ved definisjon.
Metode ble validert for vårt eksperimentelle system ved å bekrefte at den effektiviteten av amplifikasjon av mål og B-aktin-genene var like. TaqMan Gene Expression Analyser spesifikke for CEA, CK19, Survivin og VEGF ble kjøpt fra Applied Biosystems. For å unngå å amplifisere forurenset genomisk DNA, ble primerpar plassert ved overgangen mellom to eksoner. Den qrtPCR Analysen ble utført ved hjelp av ABI PRISM 7300 Sequence Detection system. PCR reaksjonen fortsette i en blanding (30 pl) inneholdende 15 ul av 2 x TaqMan Universal PCR masterblanding, 1,5 ul 20 x TaqMan Gene Expression assay (alle reagenser fra Applied Biosystems), 12,5 mL vann og 1 mL av cDNA templat . Femti sykluser med amplifisering ble utført ved 95 ° C (15 sek) og 60 ° C (1 minutt) og mRNA-ekspresjonsnivåer ble normalisert mot kvantifisert b-aktin mRNA-ekspresjon for hver prøve.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utføres ved hjelp av Stat Vis V. 4,57 programvare (Abacus Concepts, London, UK) og StatXact V7.0.0 programvare (Cytel Software Corporation, USA). Korrelasjonen mellom gen-nivåer (høy versus lav genekspresjon, som definert av medianverdien) og sykdom TNM stillas kategorier ble vurdert ved hjelp av Cochrane-Armitage trend test. Overlevelseskurver ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meyer-metoden, og univariat overlevelse sammenligninger ble beregnet i henhold til log-rank test. Den transkripsjonelle nivåer av fire gener, sammen med antropometriske faktorer og TNM trinn (i henhold til den femte utgave av den AJCC TNM staging system utgitt i 1997), ble benyttet som uavhengige variabler i den multivariate overlevelsesanalyse, som ble utført ved hjelp av Cox proporsjonal farer regresjonsmodell [13]. Utvalg av variablene som vesentlig bidrar til den prediktive modellen ble utført ved trinnvis fremgangsmåte. . Sannsynlighetsverdier og mindre enn 5% ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Cell spiking: sensitivitet av qrtPCR teknikk
I N87 cellelinje, mRNA nivåer av CEA, CK19, Survivin, og VEGF gener ble sterkt uttrykt (Figur 1): derfor representerte dette gastrisk karsinom cellelinje en gyldig positiv kontroll for våre eksperimenter. Figur 1 Gene ekspresjonsnivåene av fire gener av interesse i N87 humane magecancerceller (som målt ved kvantitativ sanntid PCR: se tekst for detaljer). Den naturlige logaritmen av uttrykket nivåer er rapportert på y-aksen: origo (0) representerer referanseprøven (kalt kalibrator) som alle eksperimentelle prøvene er sammenlignet i forhold kvantifisering metode (se tekst for detaljer)
. å etablere deteksjonsgrensen (følsomhet) av qrtPCR teknikk, ble serie 10 ganger fortynninger (i PBMC) av N87 gastrisk karsinom celler analysert i tre eksemplarer av qrtPCR hjelp CEA og survivin som genmarkører. CEA og Survivin mRNA ble detektert opp til en celle /10 8 PBMC fortynning:. Dette svarer til å finne en til 10 maligne celler pr 10 ml perifert blod (data ikke vist)
Expression markører i blodprøver
Perifere blodprøver fra alle 70 pasienter ble evaluert for de fire genmarkører. Uttrykket var positive (høyere enn kalibrator) på 98,6%, 97,1%, 42,9%, 38,6% av prøvene for Survivin, CK19, CEA, VEGF, henholdsvis (tabell 2). Siden Survivin og CK19 genet nivåer finnes i nesten alle pasienter er større enn hos friske kontroller, disse funnene peker til en diagnostisk potensial på begge genes.Table 2 Transkripsjon nivåer av fire prognostiske markører i perifert blod hos pasienter med magekreft.
Marker
Above kalibrator (%) *
Nedenfor kalibrator (%) *
Ikke målbart (%)

survivin
69 (98,6)
1 (1,4)
0 (0,0)
CK19
68 (97,1)
2 (2,9)
0 (0,0 )
CEA
30 (42,9)
21 (30,0)
19 (27,1)
VEGF
27 (38,6)
43 (61,4)
0 (0,0 ) product: * genekspresjon nivåene ble målt ved hjelp av kvantitativ sanntid PCR: ved hjelp av den relative mengde metode, ble prøvene klassifisert som over eller under nivåene funnet i kalibratoren (sammenslått perifere blodprøver fra friske donorer)
Videre har. hvis vi betraktet 75. persentil av survivin uttrykk nivåer per scenen, hadde vi en betydelig økt trend (p = 0,04) for trinn fra i til III, men ikke for stadium IV (figur 2). Figur 2 Survivin genet nivåer målt i perifert blod hos 70 pasienter med TNM stadium I-IV magekreft. Trenden test analyse viser en betydelig økning i Survivin transkripsjonsnivået i ulike pasienter med stadium I-III magekreft (trend test P-verdi = 0,04). For hver kolonne er rapportert gjennomsnitt ± SD
Survival analyse
Etter en gjennomsnittlig oppfølging på 26 måneder, median total overlevelse (OS) for TNM stadium I-II ble ikke nådd.; median OS for stadium III og IV var 25 og 13 måneder, henholdsvis (log-rank test P-verdi < 0,0001, figur 3). Figur 3 Total overlevelse for TNM stadium I-II, III og IV for alle pasienter (log-rank test P-value < 0,0001).
Ved univariat overlevelse analyse, blant de fire genene vi har testet, bare Survivin uttrykk kunne identifisere to pasientgrupper med vesentlig forskjellig prognose. Faktisk vurderer 75-persentil av log-transformeres gentranskripsjon nivåer (1,508) som cutoff punktet, median OS for høy (> 1,508) og lav (≤1.508) Survivin mRNA overflod var 14 og 41 måneder, henholdsvis (log rang P-verdi = 0,036, figur 4). Figur 4 Kaplan-Meier-overlevelseskurver for pasienter med høy (mer enn 75. persentil) eller lav (< 75. persentil) transkripsjonelle nivå av Survivin målt i perifert blod. Log-rank test P-verdi = 0,036.
Multivariat overlevelsesanalyse inkludert TNM stadium, alder, kjønn og mRNA nivåer av de fire markører viste at bare TNM stadium og Survivin mRNA nivåer målt i perifert blod uavhengig forutsi pasientens OS . Hazard ratio (HR) i forbindelse med survivin nivåer indikerer økt risiko for død etter 100 gangers økning i Survivin uttrykk (tabell 3) .table 3 Multivariat overlevelsesanalyse av 70 pasienter med magekreft.
kovariater
HR
95% KI
P-verdi


Nedre grense
Øvre grense

TNM stadium I
1 (referanse) -
-
-
stadium II
1,20
1.01
1,45
0,048
stadium III
1,34
1.05
1,70
0,017
stadium IV
3.17
1,38
6,77
0,004
survivin *
1,34
1.14
1.53
< 0.001
HR: hazard ratio; KI: konfidensintervall; * HR forbundet med survivin nivåer indikerer økningen av dødsrisiko for 100-ganger økning i Survivin uttrykk.
Siden bare disse fire uavhengige variabler ble beholdt av Cox modell, tyder dette på analysen at Survivin genuttrykk kan legge til nyttig prognostisk informasjon til godt etablerte faktorer som TNM staging system.
diskusjon
i denne studien fant vi at transkripsjonsnivåer survivin målt i perifert blod hos pasienter med magekreft uavhengig korrelerer med deres total overlevelse.
Hvis validert i større prospektive studier, ville disse resultatene tillate å øke den prognostiske kraften i konvensjonelle prognostiske faktorer, som i dag er nedfelt av TNM staging parametere. Dette er av spesiell relevans for pasienter med TNM stadium I til III sykdom, for hvem optimal risikovurderingen er viktig å identifisere personer med høyest sannsynlighet for å ha nytte av adjuvant behandling.
Våre funn er av særlig relevans også fra tumorbiologi synspunkt fordi den survivin-genet koder for en nøkkel anti-apoptotiske protein som tilhører den hemmer av apoptose protein (IAP) familien. Foruten å være en av de beste karakterisert anti-apoptotiske faktorer [14], er Survivin gjenstand for intens undersøkelse på grunn av det faktum at hos voksne er det selektivt uttrykkes praktisk talt bare av cancer av forskjellig opprinnelse; dessuten har sitt uttrykk i den primære tumor er forbundet med dårligere prognose og resistens overfor konvensjonelle kjemoterapeutika [15]. Disse observasjonene gjør Survivin et ideelt mål for tumor-spesifikke behandlinger, for eksempel små molekyl hemmere og antigen-spesifikk immunterapi [16].
Survivin protein uttrykk i primære svulster, inkludert magekreft, har blitt undersøkt som en prognostisk faktor, høyere nivåer er forbundet med dårligere kreft utfallet [17]. Om RNA uttrykk, har Survivin mRNA nivåer blitt undersøkt som en markør av sirkulerende tumorceller (CTC) i ulike typer kreft, men tilgjengelige data er knappe [18, 19]. I en serie av 26 magekreftpasienter, har Survivin mRNA (som målt ved hjelp av ELISA-baserte qrtPCR) i perifert blod blitt rapportert å korrelere med pasientenes prognose, idet TNM staging utelukkes fra slutt mutivariable modellen (tvinge alle variabler inn i Cox-modellen) [20]. I våre større serie (n = 70), den prognostiske rollen Survivin blodet er bekreftet, selv om TNM staging fortsatt en betydelig prognostisk faktor i den endelige multivariat modell (ved hjelp av trinnvis modus for variabel utvalg). Til tross for signifikant sammenheng med pasientenes prognose, gjorde Survivin mRNA nivåer ikke øke på tvers av alle fire TNM stadier: trenden for økt transkripsjonen overflod ble faktisk vist bare hos pasienter med stadium I-III sykdom (figur 2). Dette funnet makt avhenger av de lave utvalgsstørrelser av de enkelte TNM stadier (og påfølgende lav statistisk styrke), men kan også indikerer at Survivin spiller en rolle i lokoregionalt og ikke i fjerne metastatisk sykdom (der andre gener kan være mer relevant, som nylig rapportert [21])
motsetning til andre studier [9, 22-26], nivåene av CK19 og CEA ikke korrelerer med pasienter overlevelse i vår serie, enten på univariable (data ikke vist) eller multivariabel overlevelsesanalyse. dette kan avhenge av flere faktorer. Først av alt, gjør inkludering i våre multivariat analyse (med en trinnvis modus for variabel utvalg) av en markør ikke vurdert av andre forfattere enhver sammenligning drivverdige.
Av notatet, noen positive rapporter bare bruke univariable overlevelsesanalyse, som truer pålitelighet og reproduserbarhet av sine resultater, gang justering for godt etablerte prognostiske faktorer (dvs. TNM etapper) ble implementert [9, 25, 27, 28]. Videre, i tråd med våre resultater andre forskere gjør rapport manglende sammenheng mellom cytokeratins positive celler tilstedeværelse og prognose [29] (tabell 4) .table 4 Utvalgte serier analysere prognostisk rolle sirkulerende tumorceller (CTC) hos pasienter med magekreft.
Author

Year

Ref.

Patients

Method

Survival analyse
Markers
Funn
Koga T et. al.
2008 product: [9]
101
Kvantitativ RT-PCR
Univariat
CK18, CK19, CK20, CEA
CK19 er bedre markør, og er brukbart til anslå prognose eller for adjuvant behandling
Yie SM et. al.
2008 product: [20]
26 (magekreft)
RT-PCR ELISA
Multivariate
Survivin
Status for Survivin-uttrykke CTC er en sterk og uavhengig prediktor for tilbakefall
Hiraiwa K et. . Al
2008 product: [22]
44 (magekreft)
CellSearch system
Multivariate
CD45 (-) celler vs CK (+) celler
CTSS signifikant korrelert med avansert tumor stadium
Illert B et. al.
2005 product: [23]
70
Kvantitativ RT-PCR
Multivariate
CK20
CK20 er en uavhengig prognostisk markør
Yeh KH et. al.
1998 product: [24]
34
Nøstet kvantitativ RT-PCR
Univariat
CK19
CK19 uttrykke CTC er assosiert med dårlig prognose
Seo JH et. al.
2005 product: [25]
46
Kvantitativ RT-PCR
Ikke utført
CEA
CEA mRNA er signifikant korrelert med klinisk tilbakefall
Wu CH et. al.
2006 product: [26]
42
Kvantitativ RT-PCR
Ikke utført
hTERT, CK19, CK20,
CEA CEA mRNA er korrelert med økt risiko for postoperativ gjentakelse /metastase
UEN YH et. al.
2006 product: [27]
52
Kvantitativ RT-PCR
Univariat
c-MET, MUC1
c-Met og MUC1mRNA betydelig korrelerer med prognose
Mimori K et. al.
2008 product: [28]
810
Kvantitativ RT-PCR
Univariat
MT1-MMP
MT1-MMP er en selvstendig faktor for å bestemme tilbakefall og fjernmetastaser
Pituch-Noworolska A et. . Al
2007 product: [29]
57
Flowcytometri
Univariat
CD45 (-) celler vs CK (+) celler
nærvær av CK (+) celler er av ingen prognostisk verdi
Disse motstridende data kan avhenge av det faktum at CK19 og CEA er markører for CTC nærvær, men ikke nødvendigvis fra CTC evne til å metastasere: i faktisk er det vel akseptert at bare en delmengde av CTC har den biologiske potensialet til å gi opphav til metastatiske innskudd, mens de fleste CTC slutt dø uten å være skadelig for verten [7]. Følgelig kan markører for CTC "aggressivitet" som Survivin avslører å være mer informativ når det gjelder sammenheng med pasientenes prognose.
Av notatet, i denne studien mRNA overflod av Survivin og CK19 var alltid større enn det som finnes i friske kontroller med unntak av ett og to tilfeller, respektivt. Dette understreker viktigheten av å bruke en kvantitativ metode (qrtPCR) som gjorde oss i stand til å stratifisere pasienter risiko på en kontinuerlig skala, mens standard PCR ville ha klassifisert nesten alle pasienter som positive. På den andre siden, dette funnet - som etter beste overbevisning aldri har blitt rapportert før - tyder på at disse genene kan utnyttes også for diagnostiske formål, selv om en dedikert studie spesielt utviklet for dette formålet er garantert
Som en. endelig vurdering, ønsker vi å observere at PCR-baserte metoder ikke tillater å identifisere cellen kilden til de målte markører: faktisk alle disse metodene krever lysis av cellene høstet fra perifert blod fra pasienter for å trekke ut mRNA brukes for å vurdere ekspresjonen av målgener. Foruten CTC, andre potensielle kilder til PCR-oppdagede gener er PBMC, sirkulerende endotelceller (CEC), benmarg avledet sirkulerende stamceller samt hudceller (f.eks keratinocytter, fibroblaster, melanocytter) forurensende prøven i løpet av blod tilbaketrekning. Likevel CTC vil trolig være den viktigste cellen kilde for survivin som sin uttrykks er svært begrenset i normale voksne vev, og er i stedet i hovedsak begrenset til ondartede celler [30]. I denne forbindelse, cytometriske metoder som er mindre utsatt for falske positive resultater, som impliserer de antistoff-baserte cellesortering, etterfulgt av cytologisk identifikasjon av tumorceller som går forut for deres fenotypiske karakteriser [31].
Konklusjoner
Gene ekspresjonsnivåer av Survivin legge betydelig prognostisk verdi til gjeldende TNM staging system for pasienter med magekreft. Valideringen av disse funnene i større prospektive serien kan føre til optimalisere risiko- lagdeling og til slutt å tilpasse den terapeutiske behandling av disse pasientene.
Erklæringer
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale legges filer for bilder. 12967_2009_422_MOESM1_ESM.eps Forfatteroriginalfilen for figur 1 12967_2009_422_MOESM2_ESM.eps Forfatteroriginalfilen for figur 2 12967_2009_422_MOESM3_ESM.eps Forfatteroriginalfilen for figur 3 12967_2009_422_MOESM4_ESM.eps Forfatteroriginalfilen for figur 4 Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

• Clinicopathological funksjoner og prognostiske roller KRAS, BRAF, PIK3CA og NRAS mutasjoner i avansert magekreft
• Stent versus gastrojejunostomi for lindring av mage utsalgsstedet hindringer: en systematisk