Survivin gén szintje a betegek perifériás vérében a gyomorrák függetlenül megjósolni túlélési

Survivin gén szintje a betegek perifériás vérében a gyomorrák függetlenül megjósolni túlélési
Abstract
alapon
A kimutatási keringő tumorsejtek (CTC) tartják ígéretes eszköz javítására rizikóstratifikáció betegeknél szilárd daganatok. Megvizsgáltuk-e a kifejezés CTC kapcsolatos gének bármilyen további prognosztikus erővel a TNM stádium rendszerben a betegek gyomorrák. Katalógusa módszerek katalógusa hetven betegek TNM I-IV gyomorrák visszamenőleg beiratkozott. A perifériás vér mintát vizsgáltak útján kvantitatív valós idejű PCR-rel (qrtPCR) a kifejezés a négy CTC kapcsolatos gének: karcinoembrionális antigén (CEA), citokeratin-19 (CK19), a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) és a survivin (BIRC5).
eredménye
génexpressziójának survivin, CK19, a CEA és a VEGF magasabb volt, mint a normál kontrollok 98,6%, 97,1%, 42,9% és 38,6% -ában, illetve, ami arra utal egy potenciális diagnosztikai értékét mindkét survivin és a CK19 . A többváltozós túlélési analízis TNM átmeneti és a survivin mRNS-szinteket visszatartását független prognosztikai faktorok, bizonyítva, hogy a survivin expresszióját a perifériás vérben hozzáadja prognosztikai információt a TNM rendszerben. Ezzel szemben a korábban közzétett adatok, az átirat rengeteg CEA, CK19 és VEGF nem járt együtt a beteg klinikai kimenetelt. Katalógusa Következtetések katalógusa génexpressziós szintje Survivin hozzá szignifikáns prognosztikai értéket az aktuális TNM stádium rendszerben. Az érvényesítési Ezeknek az eredményeknek a nagyobb, prospektív multicentrikus és sorozat vezethet ezen határozat végrehajtásához biomarker a rutin klinikai optimalizálása érdekében rizikóstratifikáció és végül személyre terápiás kezelésében betegnél. Katalógusa Háttér katalógusa Gyomorrák jelentése a negyedik leggyakoribb rák és a második vezető oka a rák okozta halál világszerte. A becslések szerint a jelenlegi előfordulása gyomorrák körülbelül 16,2 /100 000 fő /év (world standardizált ráta, WSR), a legmagasabb előfordulási Kelet-Ázsiában, Kelet-Európában és Dél-Amerikában. [1] Jelenleg az egyetlen prognosztikai rendszer rutinszerűen alkalmazott irányításáért gyomorrákos betegek alapul a Nemzetközi Rákellenes Unió Tumor-Node-metasztázis (TNM) staging rendszer [2], ahol a fokozatot tumor penetráció (PT) és a nyirokcsomó státusz (pN) [3] a két legfontosabb prognosztikai mutató betegeknél, akiknek távoli áttétes betegség. A betegek korai szakaszában tekintik jelöltek gyógymód a műtét. Azonban 50% -a gyomor rákos betegek szenvednek tumor visszaesések után is radikális műtét [4, 5]. Így a jelenlegi stádium rendszerben nem látszik pontosan megjósolni a beteg egyéni kockázata rák kiújulásának. Valójában ez a besorolás azonosítja tág kategória jelentősen eltérő prognosztikai alcsoport minden szakaszában, amely ezt a rendszert optimális személyre szabott terápiás megközelítés. Ezt példázza az a tény, hogy néhány betegnél jelenleg az "alacsony kockázatú" nem nyújtják az adjuváns terápia, bár ezek a tapasztalatok a betegség kiújulását. Fordítva, egyes betegeknél jelenleg folyik adjuváns kezelés, mert a "nagy kockázatú" TNM osztályozás, nem kell ezt a kezelést. [6] Annak érdekében, hogy ezt a kérdést és javítsa a betegek prognózisát, új paraméterek megbízhatóan előre betegek kimenetelét sürgősen szükség van. A betegek átesett potenciálisan kuratív műtét megtartja a kiújulás kockázata, ami abból mikroszkopikus tumor maradványok ismert minimális reziduális betegség (MRD). MRD hatással lehet a test különböző rekeszek, beleértve a csontvelő, a nyirokcsomók és a perifériás vér [7]. Az utóbbi években számos tanulmány foglalkozott a kimutatására keringő tumorsejtek (CTC) a szempontból, hogy a klinikai hatással betegek gyomorrák. Ennek eredményeként kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qrtPCR) és változata ezt a technikát, amely tekinthető a legérzékenyebb módszer értékelésére génexpresszió, már használják a kimutatására tumormarkerek, amelyek jelzik a jelenlétét CTC a vér [8].
a jelenlegi elemzés arra törekedtünk, hogy a profilalkotás a perifériás vérben 70 szabadalom érintett gyomor adenokarcinóma segítségével qrtPCR. Teszteltük négy biomarkerek, két jelenlétének, ad két agresszivitás a tumor, és ezek egyike, a survivin, adjunk hozzá független prognosztikai áramot a TMN stádium rendszerben. Ez lehetővé teheti a jobb rétegződése beteg kockázati és így jobb terápiás kezelése, különösen az adjuváns. Katalógusa Módszerek katalógusa Betegek katalógusa Ebben a tanulmányban beiratkozott 70 beteg (39 férfi, 31 nő, életkor tartomány 28-90 éves, átlagos életkor 68 év) operáltak (teljes vagy részleges gastrectomia) a szövettanilag igazolt gyomorrák között 1998 októbere és 2007 novemberében, és akiknél a perifériás vérminta rendelkezésre. A tanulmány, amely összhangban van a Helsinki Nyilatkozat, jóváhagyta a helyi etikai bizottság a Padovai Egyetem (jóváhagyási szám: 70/2006). Írásos beleegyezési használatára vonatkozó biológiai minták esetében vizsgálati célból kapunk minden betegnél. Abban az időben az elemzés, 33 (47,1%) volt életben, míg 37 (52,9%) halt meg. Medián követési idő 15 hónap volt (tartomány: 6-119 hónap). A medián túlélés 25 hónap. Tumor jellemzőit az 1. táblázat tartalmazza a mélység tumor invázió (T kategória), mértéke nyirokcsomómetastasis (N kategória) és makroszkópos áttétek (M kategória) szerint osztályoztuk a UICC TNM stádium system.Table 1 Betegek és tumorjellemzők .
paraméterek Matton N Matton (%) Matton Betegek katalógusa minden
70
(100,0) hotelben férfi katalógusa 39 katalógusa (55,7) fiatal női katalógusa 31 katalógusa (44,3) hotelben Életkor (év) hotelben ≤ 65 katalógusa 21
(30,0) hotelben > 65 katalógusa 49 katalógusa (70,0) hotelben Location katalógusa multicentrikus katalógusa 5 katalógusa (7.1) hotelben felső harmadában katalógusa 11 katalógusa (15,7) hotelben középső harmadában
19 katalógusa (27,1) hotelben alsó harmadában katalógusa 35 katalógusa (50,0) hotelben TNM katalógusa I (IA + IB) hotelben 10 katalógusa (14.3)
II katalógusa 14 katalógusa (20,0) hotelben III (IIIA + IIIB) hotelben 19 katalógusa (27,1) hotelben IV
27 katalógusa (38,6) hotelben sejtvonalak
a humán gyomorkarcinóma sejtvonal NCI-N87, az American Type Culture Collection (Manassas, amerikai Egyesült Államok), inkubáljuk RPMI-1640 tápközegben (Invitrogen - Gibco, Carisbad, CA, USA), amely 10% magzati borjúszérumot (Euroclone - Celbio, pero, MI), 10 mM Hepes, 1 mM nátrium-piruváttal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 37 ° C-on, 5% CO 2.
NCI-N87 van egy gyomor karcinóma sejtvonal származik máj metasztázis egy jól differenciált karcinóma, a gyomor megelőzően tett citotoxikus kezelés. A gyártó szerint adatlapja, sejtek expresszálják a felületi glikoproteinek karcinoembrionális antigén (CEA).
Cell Kísérletek sora
Egy sejt spiking vizsgálatot végeztünk annak érdekében, hogy meghatározzák a érzékenysége qrtPCR technika ráksejtek kimutatására perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC). A PBMC-t kapott egészséges önkénteseken, és megszámoltuk, és 1: 1 arányban RPMI közegben. Gyomorrák sejteket N87 megszámoljuk, és sorozathígítást készítettünk 1 × 10 6 sejt /milliliter 1 sejt /milliliter a PBMC. A teljes RNS-t extraháltunk és reverse- átíródott 2 ml mindegyik frakció. qrtPCR két bíró gének ezután végre, az alábbiakban ismertetett módon.
Mintagyűjtés, RNS extrakció és cDNS-szintézis
egy 6 ml-es aliquot vénás vért vettünk minden egyes beteg a műtét idején. A minták feldolgozása végeztük követő két órán belül a vérvételt. Mintát addig centrifugáltuk 2000 x g 10 percig, és a PBMC-frakciót összegyűjtjük és folyékony nitrogénben tároljuk.
Fagyasztott mintákat felolvasztottuk, és a teljes RNS-t extraháltunk a guanidin-tiocianát-fenol-kloroform módszerrel (Trizol reagens, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A integritását az izolált RNS-t hozta létre qrtPCR elemzése az endogén referencia gén béta aktin (b-aktin) az alábbiakban ismertetett módon [9].
Az összes RNS-t (7 jig 100 ul végső reakció-térfogat) reverz transzkripcióval használatával random primerek és MultiScribe reverz transzkriptázt (nagy kapacitású cDNS reverz transzkripció kit, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A reakciókeveréket 10 percig inkubáljuk 25 ° C hőmérsékleten, majd 37 ° C-on 120 percig. cDNS-t tárolunk -80 ° C-on tároltuk felhasználásig.
Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció katalógusa A transzkripciós szintje négy gént (azaz, karcinoembrionális antigén [CEA], citokeratin-19 [CK19] a survivin és a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor [VEGF)] mértük a betegek perifériás vérében útján kvantitatív valós idejű PCR-rel (qrtPCR) a relatív mennyiségi módszer (2 -ΔΔCt módszer) [10, 11]. A 2 -ΔΔCt módszer az adatok bemutatása a fold-változás génexpressziós normalizáltuk egy referencia gén és relatív egy kalibrátor minta. A cél a normalizálás folyamat, hogy állítsa be az értéket képviselő transzkripciós szintjét az egyes gén által mRNS mennyiségét jelen minden mintában: ez általában hányadosaként kapott expressziós szinteket az egyes gént az említett egy referencia gén (szintén az úgynevezett "háztartási" gén). Háztartási gének konstitutívan fejeződik, és - ideális esetben - nem befolyásolja a kísérleti manipulációk: ezért arra ki közelítőleg tükrözik a teljes összeg a mRNS tesztelt egyes mintákban [12]. Mivel a referencia gén Ebben a tanulmányban használt béta-aktin, az egyik leggyakrabban használt háztartási gének.
Egy relatív mennyiségi PCR vizsgálatban, az úgynevezett "kalibrátor" képviseli a gén expresszióját egy kiválasztott minta, amellyel expressziós profilját az egyes minták érdekes állítjuk: ez a megközelítés lehetővé teszi a vizsgáló összehasonlítani expressziós profiljának a minták érdekes egymással szempontjából a kinyitható képest változást egyetlen mintán (a kalibrátor). katalógusa Általában, a kalibrátor a kezeletlen minta (pl egy funkcionális vizsgálat), a mintát a zéró időpontban (pl egy időfüggő vizsgálat) vagy bármilyen független minta (pl egészséges kontrollokat a betegek vizsgálatban vagy normális fibroblasztok rákos sejtben vonal tanulmány) [10]. A medence származó cDNS PBMC 20 egészséges donorok alkalmaztunk kalibrátor forrás a vizsgálatba. Értékelése 2 -ΔΔCt jelzi a szoros változást génexpresszió képest a kalibrátor. A kalibrátor a ΔΔCt nullával egyenlő, és a 2. 0 értéke egy, úgy, hogy a szoros változást génexpresszió relatív a kalibrátor értéke egy, a meghatározás szerint.
A módszert validálták a kísérleti rendszer ellenőrzi, hogy a hatékonysága erősítés a célok és a b-aktin gén hasonló volt. TaqMan Gene Expression Assays specifikus CEA, CK19, survivin és a VEGF-et Applied Biosystems. Annak elkerülése érdekében, amplifikáljuk szennyezett genomiális DNS-t, a primer pár került a csomópont között két exon. A qrtPCR vizsgálatot végeztünk az ABI PRISM 7300 Sequence Detection System. A PCR-reakciót eljárni keverékében (30 ul): 15 pl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix, 1,5 ul 20 × TaqMan Gene Expression assay (az összes reagenst az Applied Biosystems), 12,5

• Klinikopatológiai jellemzők és prognosztikai szerepének KRAS, BRAF, PIK3CA és a nemzeti szabályozó hatóságok mutációk előrehaladott gyomorrák cancer
• Stent versus gastrojejunostomia a tüneti gyomor kivezető akadály: a rendszeres review