Gen-expressie analyse van een Helicobacter pylori-geïnfecteerde en high-zout-dieet behandelde muizen maag tumor model: identificatie van CD177 als een roman prognostische factor bij patiënten met maagkanker

Gen-expressie analyse van een Helicobacter pylori
geïnfecteerde en high-zout-dieet behandelde muizen maag tumor model: identificatie van CD177 als een roman prognostische factor bij patiënten met maagkanker
Abstracte achtergrond
Helicobacter pylori
(H. pylori
) infectie en overmatig zoutgebruik staan ​​bekend als belangrijke risicofactoren voor maagkanker bij de mens. Echter, interacties van deze twee factoren met genexpressieprofielen bij maagkanker onduidelijk. In de huidige studie, onderzochten we de wereldwijde genexpressie geassocieerd met maagcarcinogenese en prognose van de menselijke maagkanker met behulp van een muismodel.
Methoden Belgique Om kandidaat-genen die betrokken zijn bij maagcarcinogenese vinden we in de eerste plaats gebouwd een carcinogeen-geïnduceerde muis maagtumor model gecombineerd met H. pylori
infectie en high-zout dieet. C57BL /6J muizen kregen N
methyl-N
-nitrosourea in hun drinkwater en opgeofferd na 40 weken. Dieren uit een combinatie groep werden ingeënt met H. pylori Kopen en gevoed een high-zout dieet. Genexpressieprofielen in de voormaag van muizen werden onderzocht door oligonucleotide microarray. Tweede onderzochten we een beschikbaarheid van het kandidaatgen als prognostische factor voor menselijke patiënten. Immunohistochemische analyse van CD177, een van de up-gereguleerde genen werd uitgevoerd in humane gevorderde maagkanker monsters aan de unie prognose evalueren.
Resultaten
De talrijke maagtumor in-carcinogeen behandelde muizen was significant verhoogd door het combineren van H. pylori
infectie en high-zout dieet. In de microarray analyse, 35 en 31 meer dan twee maal opgereguleerd en down-gereguleerde genen, respectievelijk, werden gedetecteerd in de H. pylori
-infection en high-zout dieet gecombineerde groep vergeleken met de andere groepen. Kwantitatieve RT-PCR bevestigde significante over-expressie van twee kandidaat-genen waaronder Cd177 Kopen en Reg3g
. Op immunohistochemische analyse van CD177 in menselijke gevorderde maagkanker monsters overexpressie bleek uit 33 (60,0%) van de 55 gevallen aanzienlijk correleren met een goede prognose (P
= 0,0294). Multivariate analyse inclusief klinische en pathologische factoren als covariaten geopenbaard hoge expressie van CD177 een onafhankelijke prognostische factor voor algeheel overleven.

Conclusies Deze resultaten suggereren dat onze muismodel gecombineerd met H. pylori infectie
en high-zout dieet is handig voor profilering van genexpressie in de maag carcinogenese, waaruit blijkt dat CD177 is een nieuwe voorspellende factor voor maagkanker. Dit is het eerste rapport met een prognostische correlatie tussen CD177 expressie en vaste tumor gedrag.
Sleutelwoorden
Cd177 Maagkanker Helicobacter pylori
Microarray Salt Achtergrond
Maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. Helicobacter pylori
(H. pylori
) wordt nu erkend als een belangrijke risicofactor voor chronische ontwikkeling gastritis en maagkanker [2]. Bovendien zijn milieu- en gastheerfactoren ook aangetoond maagkanker beïnvloeden, en zout (natriumchloride, NaCl) en zoute voeding van bijzonder belang, gebaseerd op gegevens over een aantal epidemiologische en experimentele studies [3-6]. Aldus gecombineerde blootstelling aan H. pylori
infectie en overmatig zoutgebruik lijkt zeer belangrijk voor de ontwikkeling en progressie van maag tumoren, hoewel de precieze werking, vooral wat genexpressieprofielen, moeten nog worden opgehelderd.
High throughput microarray technologie een krachtig hulpmiddel voor uitgebreide genanalyses reeds toegepast om genexpressie patronen beoordelen zowel humane monsters en diermodellen van maagaandoeningen [7-16]. Hoewel veel onderzoekers hebben zich gericht op genexpressie in H. pylori
behandelde maag cellijnen [17-19], resulteert in celkweek niet noodzakelijkerwijs correleren met expressie van specifieke genen in het in vivo
micro kenmerken gastheerimmuunsysteem reacties en stromale-epitheliale interacties in kankers. Carcinogeen behandelde Mongoolse gerbils werden gebruikt als een bruikbaar diermodel van H. pylori-geassocieerde gastrische
carcinogenese [20-24], en we eerder gemeld dat een synergistische interactie tussen H. pylori infectie
en hoge zoutconcentratie inname versnelt chronische ontsteking en tumorontwikkeling in de magen van deze dieren [25, 26]. Helaas is er weinig informatie beschikbaar is voor de gerbil genoom, belemmert de genetische en moleculaire analyse. Daarom is de aandacht gericht op muismodellen [12, 13], en de vestiging van een muismodel voor maagkanker met zout en H. pylori
blootstelling nodig is voor het onderzoek gericht genen betrokken bij maagkanker.
Vorige microarray studies met behulp van knaagdiermodellen geen onderscheid en karakteriseren van expressie profielen gebaseerd op de interactie van H. pylori
infectie en zoutinname. In de huidige studie onderzochten we de genexpressie in het maagslijmvlies in een H. pylori
geïnfecteerde en high-zout-dieet behandelde muizen maag tumor model door oligonucleotide microarray en vond twee kandidaat-up-gereguleerde genen waaronder Cd177
en Reg3g
. We onderzochten ook de expressie van CD177 in menselijke gevorderde maagkanker door immunohistochemie, en verkregen bewijzen als een potentiële voorspellende factor voor maagcarcinogenese.
Methoden
Inenting met H. pylori
H. pylori
werd bereid volgens dezelfde werkwijze als eerder beschreven [27, 28]. Kort samengevat, H. pylori
(Sydney stam 1) geënt op Brucella agarplaten (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) met 7% (v /v) hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), en geïncubeerd bij 37 ° C onder microaërofiele omstandigheden bij hoge vochtigheid gedurende 2 dagen. Vervolgens bacteriën gekweekt op de platen werden in Brucella-bouillon (Becton Dickinson) aangevuld met 7% (v /v) FBS en geïncubeerd onder dezelfde omstandigheden gedurende 24 uur. Na 24 uur vasten werden de dieren intra- gastrically geïnoculeerd H. pylori
(1,0 x 10 8 kolonievormende eenheden). Voor enting werden de bouillon culturen van H. pylori
gecontroleerd onder een fase-contrast microscoop voor bacteriële vorm en mobiliteit.
Dieren en experimentele protocol
Zesenvijftig specifieke pathogeen-vrij man, 5- of 6 -week-oude C57BL /6J muizen (CLEA Japan, Tokyo, Japan) werden gebruikt in deze studie. Alle dieren werden gehuisvest in plastic kooien op hardhout-chip beddengoed in een van airconditioning voorziene biohazard kamer met een 12-uur licht /12 uur donker cyclus, en de vrije toegang tot voedsel en water gedurende. Het experimentele ontwerp werd goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Aichi Cancer Center Research Institute, en de dieren werden in overeenstemming met de institutionele richtlijnen, alsmede de Richtlijnen voor het goede verloop van de Dierproeven (Science Raad van Japan, 1 juni 2006 verzorgd ). Ondernemingen De experimentele opzet is weergegeven in figuur 1A. De muizen werden verdeeld in 4 groepen (groepen A-D); 21, 5, 15 en 15 muizen toegewezen aan A, B, C en D groepen, respectievelijk aan het begin van het experiment. Dieren van de groepen B en D werden geënt met H. pylori
intra-gastrically op afwisselende weken (in totaal 7 keer), terwijl muizen van de andere groepen alleen werden ingeënt met Brucella bouillon. Alle muizen kregen N
methyl-N
-nitrosourea (MNU, Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) in hun drinkwater in een concentratie van 120 ppm op alternatieve weken (totale exposure was 5 weken) . Hiertoe werd MNU vers opgelost in gedestilleerd water driemaal per week. Muizen van Groepen C en D ontvingen CE-2 voeding (basale natriumgehalte van 0,36%, CLEA Japan) bevattende 10% NaCI. Gedurende de periode van belichting, één dier van groep B, een van Groep C en zes van Groep D stierven of werden stervende en ze werden uit het experiment uitgesloten. Op 40 weken werden de dieren onderworpen bleven aan diepe verdoving en laparotomie met excisie van de maag. Figuur 1 Experimentele design en histopathologische bevindingen. A: Experimental design. Vijf- tot zes weken oude mannelijke C57BL /6J muizen werden geïnoculeerd met H. pylori
SS1 stam (B en D) of Brucella bouillon (groepen A en C). Alle dieren werden 120 ppm MNU toegediend in hun drinkwater op alternatieve weken (totale exposure, 5 weken). Muizen van Groepen C en D waren basaal dieet (CE-2) bevattende 10% NaCI. B: Histopathologisch bevindingen voor MNU-geïnduceerde muizen maag-tumoren. (A en b) Maag adenoom in de pylorus gebied van een MNU-behandelde en H. pylori
geïnfecteerde muizen (groep B). (C en d) Maagdarmkanker waargenomen in groep B. Merk de hoge celdichtheid en cellulaire en structurele atypie. Bar = 200 (A en C) of 100 urn (b en d).
Histologisch
voor histologisch onderzoek, de magen werden in 10% neutrale gebufferde formaline gefixeerd gedurende 24 uur, gesneden langs de longitudinale as in stroken van gelijke breedte, en ingebed in paraffine. Vier pm dikke secties werden bereid en gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E) voor histologische waarneming. Tumoren werden ingedeeld in adenoom en adenocarcinoom op basis van cellulaire en morfologische atypia en invasieve groei submucosa zoals we eerder gemeld [21] RNA voorbereiding en oligonucleotide microarray analyse
.
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de hele maagslijmvlies zowel tumor en perifeer weefsel met behulp van een RNeasy Mini Plus Kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) en de kwaliteit gecontroleerd met een microchip elektroforesesysteem (i-chip SV1210, Hitachi Chemical, Tokyo, Japan). Hoogwaardige monsters werden geselecteerd en samengevoegd voor elke groep afzonderlijk verschil oligonucleotide microarray beoordelingen te vermijden (groep A, n = 3, B, n = 4, C, n = 6, D, n = 7). De CodeLink Mouse Whole Genome Bioarray (Applied Microarrays, Tempe, AZ, USA) met 35.587 probe sets per chip werd gebruikt om genexpressie profielen te analyseren. Hybridisatie, verwerking en scannen uitgevoerd door Filgen, Inc. (Nagoya, Japan), wordt scangegevens beelden geanalyseerd met een softwarepakket (Microarray Data Analysis Tool, Filgen). Complete koppeling hiërarchische clustering werd ook onderzocht op vier groepen die gekwalificeerde probe deelverzameling (Filgen).
Kwantitatieve real-time RT-PCR van expressieprofielen in maag muizen
relatieve kwantitatieve real-time RT-PCR werd uitgevoerd met een StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) met de muis-specifieke glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH
) -gen als een interne controle. Na DNase behandeling werden de eerste streng cDNA gesynthetiseerd uit totaal RNA met behulp van een SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De PCR werd in wezen uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant met een QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen). De primer sequenties voor elk gen worden weergegeven in tabel 1. Specificiteit van de PCR reacties werd bevestigd met behulp van een smelt curve programma voorzien StepOne de software en elektroforese van de PCR monsters in 3% agarose gels. De expressieniveaus van mRNA werden genormaliseerd naar het mRNA niveau van GAPDH Kopen en vergeleken met de controlemuizen (groep A) van de ΔΔCT method.Table 1 Primersequenties voor relatieve kwantitatieve real-time RT-PCR
Gene

Sequences
lengte van het product
toetreding geen.
GAPDH
5'-AACGGATTTGGCCGTATTG-3 '
140
NM_008084
5'-TTGCCGTGAGTGGAGTCATA-3 '
Cd177
5'-AGGGGTGCCACTCACTGTTA-3'
128
NM_026862
5'-CCGATTGTTTTGGAGTCACC-3
Reg3g

5'-GTATGGATTGGGCTCCATGA-3 '
106
NM_011260
5'-GATTCGTCTCCCAGTTGATG-3'
Muc13
5'-CCTAATCCCTACGCAAACCA-3 '
124
NM_010739
5'-TCTGCCCATTTCTCCTTGTC-3 '
GAPDH
glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase, Reg3g
regenereren-eilandje afkomstig eiwit 3 gamma, Muc13
mucine 13.
patiënten en tumor specimens
Een totaal van 55 gevallen van primaire gevorderde maagkanker, chirurgisch weggesneden bij Aichi Cancer Center Hospital (Nagoya, Japan) tussen 1995 en 2002, werden onderzocht na het verkrijgen van informed consent. De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Aichi Cancer Center. De patiënten werden alle mannelijke en de gemiddelde leeftijd en de mediane follow-up periode was 58,6 ± 10,2 jaar en 83 weken, respectievelijk. Niemand had preoperatieve chemotherapie of radiotherapie ontvangen. Carcinomen met aangrenzende mucosaweefsel werden gefixeerd en ingebed in paraffine en coupes voor het kleuren met H &E. Classificatie van stagering en diagnose van gevorderde gevallen werden volgens de Japanse indeling van maagcarcinomen [29]. De kanker had de muscularis propria (T2 voor TNM classificatie), de subserosa (T3), of de serosa en de buikholte (T4a) binnengevallen, soms met aangrenzende organen (T4b).
Immunohistochemie met behulp van menselijke maagkanker weefsel
We onderzochten expressie van CD177, waarvoor commerciële primair antilichaam beschikbaar was, in menselijke maagkanker weefsels door immunohistochemie. Na remming van endogene peroxidase activiteit door onderdompeling in 3% waterstofperoxide /methanoloplossing, antigeenterugtrekking werd uitgevoerd met 10 mM citraatbuffer (pH 6,0) in een magnetronoven gedurende 10 minuten uitgevoerd bij 98 ° C. Vervolgens werden secties geïncubeerd met een muizen monoklonaal anti-CD177 antilichaam (kloon 4C4, verdund 1: 100, Abnova, Taipei, Taiwan). Kleuring voor CD177 werd uitgevoerd met een Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) en de binding gevisualiseerd met 0,05% 3,3'-diaminobenzidine. De resultaten van CD177 immunokleuring in neoplastische cellen werden ingedeeld in vier graden; graad 0 (geen, 0-10% positieve cellen), klasse 1 (zwak, 10-30%), klasse 2 (matig, 30-60%), en graad 3 (sterk, dan 60%) op basis van percentage gekleurde cellen, en cases tonen matige tot sterke kleuring werden beschouwd als positief.
Statistische analyse
De Chi-kwadraat test met Bonferroni correctie werd gebruikt om de incidentie van maag tumor te beoordelen. Kwantitatieve waarden waaronder veelheid van tumor en relatieve expressie van mRNA zijn voorgesteld als gemiddelden ± SD en SE, en verschillen tussen gemiddelden werden statistisch geanalyseerd met ANOVA of Kruskal-Wallis-test, gevolgd door de Tukey-test voor meerdere vergelijkingen. Totale overleving werd geschat met behulp van de Kaplan-Meier-methode en de log-rank test voor vergelijkingen. Correlaties tussen CD177 expressie en clinicopathologische factoren werden geanalyseerd door ANOVA of Chi-kwadraat test. Multivariate analyse werd uitgevoerd om te onderzoeken of CD177 over-expressie was een onafhankelijke prognostische factor met behulp van de Cox proportional-hazards regressie model. P
waarden van < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.
Resultaten
Het optreden en multipliciteit van maagtumoren Ondernemingen De effectieve aantal muizen en de waargenomen incidentie en multipliciteit van maag tumoren zijn samengevat in Tabel 2. Tumoren ontwikkelden in het maagslijmvlies van MNU-behandelde groepen (AD) (Figuur 1B). In high-zout dieet behandelde groepen (groepen C en D), de incidentie van maagtumor in groep D (H. pylori geïnfecteerde
; 100%) was significant hoger dan die in groep C (niet-geïnfecteerde; 50,0 %) (P Restaurant < 0,05). In basale dieet groepen (groepen A en B) was de incidentie eveneens met H. pylori
-infection (groep A, 61,9% en groep B, 100%), zij het zonder statistische significantie. De veelvouden van de totale tumoren in beide H. pylori
geïnfecteerde groepen (groep B, 3,3 ± 1,0 tumoren /muis en Groep D, 2,6 ± 1,1) waren aanzienlijk hoger dan die in niet-geïnfecteerde groepen (groep A, 0,9 ± 0,8 en Groep C, 1,0 ± 1,2) (P Restaurant < 0,05). De veelheid van adenocarcinoom van de maag in groep D (2,1 ± 1,4) was iets hoger dan die in groep B (1,8 ± 1,0) en aanzienlijk toegenomen in de groep C-waarde (0,8 ± 1,0) (P Restaurant < 0,05). Daarentegen zijn de veelvouden adenomen in groepen A en D (respectievelijk 0,1 ± 0,4 en 0,4 ± 0,5,) significant lager dan in groep B (1,5 ± 0,6) (P
< 0,05 en 0,01) .table 2 Incidentie en de veelheid van maag tumoren in MNU-behandelde muizen
Group
Effectief aantal
Behandeling
Incidentie (%)
Multiplicity (nr. van tumor /muis)
Adenoma
carcinoom
Total tumor
Adenoma
carcinoom
Total tumor
Hotels A
21
MNU
3 (14.3)
13 (61,9)
13 (61,9)
0,1 ± 0,4 A
0,8 ± 0,7
0,9 ± 0,8
B verhuur 4
MNU + H. pylori
4 (100) b verhuur 4 (100) verhuur 4 (100)
1,5 ± 0,6
1,8 ± 1,0
3,3 ± 1.0c
C
14
MNU + 10% NaCl
2 (14.3)
6 (42,9)
7 (50,0)
0,2 ± 0,6
0,8 ± 1,0
1,0 ± 1,2
D
9
MNU + H. pylori
+ 10% NaCl
4 (44.4)
8 (88,8)
9 (100) d
0,4 ​​± 0.5e
2,1 ± 1.4d
2,6 ± 1.1d
Waarden voor veelvoud zijn uitgedrukt als gemiddelden ± SD. Incidenties werden over het algemeen beoordeeld door Chi-kwadraat test, gevolgd door paarsgewijze analyse met Bonferroni correctie. Multipliciteiten zijn algemeen geanalyseerd met ANOVA, gevolgd door de Tukey-test voor meervoudige vergelijking. aP Restaurant < 0.01 vs.
Groep B BP Restaurant < 0.01 vs.
Groep A, cP Restaurant < 0.05 vs.
Groep A, dP Restaurant < 0.05 vs.
Groep C, eP Restaurant < 0,05 vs.
Groep B.
profilering van genexpressie in de klieren magen van oligonucleotide microarray
Met oligonucleotide microarrays, in vergelijking met de niet-geïnfecteerde en basale dieet behandelde groep (groep A), 34 genen werden opwaarts gereguleerd en 169 werden meer dan tweevoudig neerwaarts gereguleerd in H. pylori
geïnfecteerde muizen (groep B), 56 opwaarts gereguleerd en 129 naar beneden gereguleerde hoog-zout-dieet behandelde muizen (groep C) en 69 opwaarts gereguleerd en 214 neerwaarts gereguleerd in de gecombineerde groep (groep D) (Figuur 2A). Samengevat, zoals getoond in Tabel 3, bleek dat 35 genen slechts opwaarts gereguleerd en 31 genen neerwaarts gereguleerd meer dan twee keer door de combinatie van H. pylori infectie
en high-zout dieet. Daarnaast werd hiërarchische clustering analyse uitgevoerd op de vier groepen met in totaal 303 gekwalificeerde probes met de volledige-koppeling clustering algoritme (Figuur 3). Eenendertig probes waaronder Cd177
, Reg3g Kopen en Muc13
werden bevestigd te zijn binnen een cluster van sondes alleen up-gereguleerd in groep D. Daaropvolgende analyse in het huidige onderzoek was gericht op deze genen, omdat het werd geoordeeld dat de genen waarin expressie werd gewijzigd worden in de gecombineerde groep zou kunnen houden met maagkanker en progressie bij de mens. Figuur 2 Global genanalyse in de glandulaire maag van MNU behandelde muizen middels oligonucleotide microarray. A: Aantal genen op- of neerwaarts gereguleerd meer dan tweevoudig in de maag van MNU-behandelde muizen. In diagram Venn van de cirkels geven up- (links) of neerwaarts gereguleerd (rechts) genen in de maag van MNU behandelde muizen met H. pylori infectie
, high-zout dieet of een combinatie daarvan. Het gearceerde gebied vertegenwoordigt slechts de omhoog- en omlaag-gereguleerde genen meer dan twee keer de combinatie. B: Kwantitatieve real-time RT-PCR analyse van drie geselecteerde genen opgereguleerd (Cd177
, Reg3g
en Muc13
) in de magen van MNU-behandelde muizen. Expressie van de genen in elk monster werden genormaliseerd door GAPDH
als interne controle met behulp ΔΔCT methode. Relatieve expressieniveaus werden voorgesteld als de X-voudige verandering ten opzichte van groep A (als vaste 1,0). Statistische analyse werd uitgevoerd met de Kruskal-Wallis test voor algemene analyse en Tukey test voor meervoudige vergelijking. Bars, SE; *, P Restaurant < 0.01 vs.
Groep A en < 0.05 vs.
Groep C; †, P Restaurant < 0.01 vs.
Groep C.
Tabel 3 gereguleerde genen door een combinatie van H. pylori-infectie en high-zout dieet in muizen maagslijmvlies
toetreding geen.
Symbol

Genes /eiwitten
Vouw veranderingen
Up-gereguleerde genen
XM_357640
IGK-V8
immunoglobuline kappa keten variabele 8 (V8)
14.4
XM_001472541
Ighg
immunoglobuline zware keten (gamma polypeptide)
9.2
NM_026862
Cd177
CD177 antigeen
7.3
NM_011260
Reg3g
regenereren-eilandje afgeleide 3 gamma
6.1
NM_023137
UBD
ubiquitine D
4.3
XM_144817
IGK-V34
immunoglobuline kappa keten variabele 34 (V34)
4.1
NM_007675
carcino-antigeen-gerelateerde Ceacam10
celadhesiemolecuul 10

• Curcumine verbetert expressie van SCF /c-kit tot verzachtende oxidatieve stress en NF-KB-activering in gastrische weefsels van diabetische gastroparese rats
• Nutrition deficiëntie verhoogt het risico op maagkanker sterfte