La expresión de genes de un modelo de tumor infectada por Helicobacter pylori y la dieta alta en sal tratada ratón gástrica: identificación de CD177 como un factor pronóstico novela en pacientes con cáncer gástrico

La expresión de genes de un modelo de Helicobacter pylori
-sal de alta infectado con la dieta y el ratón tratado con gástrica tumor: identificación de CD177 como un factor pronóstico novela en pacientes con cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

Helicobacter pylori gratis (H. pylori
), la infección y la ingesta excesiva de sal son conocidos como factores de riesgo importantes para el cáncer de estómago en los seres humanos. Sin embargo, las interacciones de estos dos factores con los perfiles de expresión génica durante la carcinogénesis gástrica siguen sin estar claros. En el presente estudio, se determinó la expresión génica global asociado con la carcinogénesis del estómago y el pronóstico del cáncer gástrico humano utilizando un modelo de ratón.
Métodos
a encontrar genes candidatos implicados en la carcinogénesis del estómago, que en primer lugar construimos un ratón inducidos por carcinógenos modelo de tumor gástrico combinado con H. pylori
la infección y la dieta alta en sal. C57BL /6J ratones se les administró N-metil-N

-nitrosourea en su agua potable y se sacrificaron después de 40 semanas. Los animales de un grupo de combinación fueron inoculados con H. pylori
y alimentados con una dieta alta en sal. Perfiles de expresión génica en el estómago glandular de los ratones fueron investigados por microarrays de oligonucleótidos. En segundo lugar, se analizó una disponibilidad del gen candidato como factor pronóstico para los pacientes humanos. El análisis inmunohistoquímico de CD177, uno de los genes regulados, se llevó a cabo en muestras de cáncer gástrico avanzado en humanos para evaluar la asociación con el pronóstico.
Resultados México La multiplicidad de tumor gástrico en ratones tratados con carcinógenos se incrementó significativamente por la combinación de H. pylori
la infección y la dieta alta en sal. En el análisis de microarrays, 35 y 31 de más de dos veces hasta reguladas y abajo de los genes regulados, respectivamente, fueron detectados en el pylori
: infección y alto contenido de sal grupo de dieta combinada H. comparación con los otros grupos. RT-PCR cuantitativa confirmó significativa sobre-expresión de dos genes candidatos, incluyendo Cd177 Opiniones y Reg3g
. El análisis inmunohistoquímico de CD177 en muestras de cáncer gástrico avanzado humanos, la sobre expresión era evidente en 33 (60,0%) de los 55 casos, la correlación significativa con un pronóstico favorable (P = 0,0294
). El análisis multivariado incluyendo factores clínico-patológicos como covariables mostraron alta expresión de CD177 ser un factor pronóstico independiente de la supervivencia global.
Conclusiones
Estos resultados sugieren que nuestro modelo de ratón combinado con H. pylori
y la dieta alta en sal es útil para perfiles de expresión génica en la carcinogénesis gástrica, proporcionando evidencia de que CD177 es un factor pronóstico novedoso para el cáncer de estómago. Este es el primer informe que muestra una correlación entre la expresión de CD177 pronóstico y el comportamiento del tumor sólido.
Cáncer Palabras clave
Cd177 gástrica por Helicobacter pylori
Microarray Sal Antecedentes
cáncer de estómago es el cuarto cáncer más común y la segunda causa que conduce de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Helicobacter pylori gratis (H. pylori
) es ahora reconocido como un importante factor de riesgo para el desarrollo de gastritis crónica y cáncer de estómago [2]. Además, los factores ambientales y de acogida también se han demostrado que influyen en la carcinogénesis gástrica, y (cloruro de sodio, NaCl) sal y alimentos salados son de particular importancia, basado en la evidencia de una serie de estudios epidemiológicos y experimentales [3-6]. Por lo tanto, la exposición combinada a H. pylori
la infección y la ingesta excesiva de sal parece ser muy importante para el desarrollo y la progresión de los tumores gástricos, aunque los mecanismos detallados, especialmente en términos de perfiles de expresión génica, se tienen que aclarar.
tecnología de alto rendimiento microarray proporciona una herramienta poderosa para el análisis de genes integral, ya aplicado para evaluar patrones de expresión génica en las dos muestras humanas y modelos animales de trastornos gástricos [7-16]. Aunque muchos investigadores se han centrado en la expresión génica en H. pylori
líneas de células gástricas tratados con [17-19], los resultados en el cultivo celular no se correlacionan necesariamente con la expresión de genes específicos en el vivo
microambiente en el que ofrecen el huésped inmune respuestas e interacciones estroma-epitelio en cáncer. gerbos de Mongolia tratados con carcinógenos se han utilizado como un modelo animal útil de H. pylori
-asociado carcinogénesis gástrica [20-24], y se informó anteriormente de que una interacción sinérgica entre H. pylori infección
y alto contenido de sal ingesta acelera la inflamación crónica y el desarrollo de tumores en el estómago de estos animales [25, 26]. Por desgracia, hay poca información disponible para el genoma jerbo, lo que dificulta el análisis genético y molecular. Por lo tanto, la atención se ha centrado en modelos de ratones [12, 13], y el establecimiento de un modelo de ratón de cáncer de estómago con sal y se necesita H. pylori
exposición para las investigaciones dirigidas a genes implicados en la carcinogénesis gástrica.
Anteriores estudios de microarrays usando modelos de roedores no distinguir y caracterizar los perfiles de expresión basados ​​en la interacción de H. pylori
infección y el consumo de sal. En el presente estudio, se analizó la expresión de genes en la mucosa gástrica por H. pylori en un modelo de dieta
tratadas con sal alta y un ratón infectado con gástrica tumor mediante microarrays de oligonucleótidos y encontramos dos candidatos genes regulados incluyendo Cd177
y Reg3g
. También se investigó la expresión de CD177 en el cáncer gástrico avanzado humanos mediante técnicas de inmunohistoquímica, y se obtuvo evidencia como un posible factor pronóstico para la carcinogénesis del estómago.
Métodos
La inoculación con H. pylori
H. pylori
fue preparado por el mismo método como se describe anteriormente [27, 28]. Brevemente, H. (Sydney cepa 1) pylori
se inoculó en agar Brucella placas (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, EE.UU.) que contiene 7% (v /v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y se incubó a 37 ° C en condiciones microaerófilas a alta humedad durante 2 días. Entonces, las bacterias cultivadas en las placas se introdujeron en caldo Brucella (Becton Dickinson) complementado con 7% (v /v) de FBS y se incubaron en las mismas condiciones durante 24 h. Después de 24 h de ayuno, los animales fueron intra-gástricamente inocularon H. pylori gratis (1.0 × 10 8 unidades formadoras de colonias). Antes de la inoculación, los caldos de cultivo de H. pylori
se examinan bajo un microscopio de contraste de fase para la forma bacteriana y la movilidad.
Animales y protocolo experimental
Cincuenta y seis masculinos específica libre de patógenos, de 5 ó 6 -Semana de edad, C57BL /6J (CLEA Japan, Tokyo, Japón) se utilizaron en este estudio. Todos los animales fueron alojados en jaulas de plástico en las camas de madera chip en una sala de riesgo biológico con aire acondicionado y una luz /12 h oscuridad ciclo de 12 h, y se les permite el acceso libre a comida y agua a lo largo. El diseño experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales del Instituto de Investigación de Aichi Centro de Cáncer, y los animales se cuidaron de acuerdo con las directrices institucionales, así como las Directrices para el buen desarrollo de los Experimentos con Animales (Consejo de Ciencias de Japón 1 de junio, de 2006 ).
El diseño experimental se ilustra en la Figura 1A. Los ratones se dividieron en 4 grupos (Grupos A-D); 21, 5, 15, y 15 ratones fueron asignados a los grupos A, B, C, y D, respectivamente, al comienzo del experimento. Animales de los grupos B y D fueron inoculados con H. pylori
intra-gástricamente en semanas alternas (un total de 7 veces), mientras que los ratones de los otros grupos se inocularon con caldo Brucella solo. se les dio a todos los ratones
N-metil-N
-nitrosourea (MNU, Sigma Chemical, St Louis, MO, EE.UU.) en el agua de bebida a una concentración de 120 ppm en semanas alternas (exposición total fue de 5 semanas) . Para este propósito MNU estaba recién disuelto en agua destilada tres veces por semana. Los ratones de los Grupos C y D recibió CE-2 dietas (contenido de sodio basal de 0,36%; CLEA Japón) que contienen 10% de NaCl. Durante el período de exposición, un animal del grupo B, uno de los grupos C y seis del Grupo D muerto o moribundo y se convirtió en que fueron excluidos del experimento. A las 40 semanas, los animales permanecieron se sometieron a anestesia profunda y la laparotomía con escisión del estómago. Figura 1 Diseño experimental y hallazgos histopatológicos. A: Diseño experimental. De cinco a seis semanas de edad, machos ratones C57BL /6J se inocularon con H. pylori SS1
cepa (Grupos B y D) o caldo Brucella (grupos A y C). Todos los animales se les administró 120 ppm MNU en su agua potable en semanas alternas (exposición total, 5 semanas). Los ratones de los Grupos C y D se les dio la dieta basal (CE-2) que contiene 10% de NaCl. B: Los hallazgos histopatológicos de los tumores gástricos ratones inducido por MNU. (A y b) adenoma gástrico en la región pilórica de un tratado con MNU y H. pylori
ratón infectado con (Grupo B). (C y d) adenocarcinoma gástrico observado en el Grupo B. Nota la alta densidad celular y la atipia celular y estructural. Barra = 200 (A y C) o 100 mm (B y D).
La evaluación histológica
Para el análisis histológico, los estómagos fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra para 24 h, en rodajas a lo largo del eje longitudinal en tiras de igual anchura, y embebidos en parafina. secciones gruesas de cuatro micras fueron preparadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) para la observación histológica. Los tumores se clasifican en adenoma y adenocarcinoma basado en atipia celular y morfológica y el crecimiento invasivo para submucosa como se informó anteriormente [21].
Preparación de ARN y el análisis de microarrays de oligonucleótidos
ARN total fue extraído de toda la mucosa gástrica incluyendo tanto tumor y los tejidos periféricos utilizando un kit RNeasy Mini Plus (Qiagen, Hilden, Alemania) y su calidad comprobado con un sistema de electroforesis microchip (i-chip SV1210; Hitachi Chemical, Tokyo, Japón). Se seleccionaron muestras de alta calidad, y se agruparon para cada grupo para evitar las diferencias individuales para la evaluación de microarrays de oligonucleótidos (grupo A, n = 3; B, n = 4; C, n = 6; D, n = 7). El CodeLink ratón Genoma Bioarray (microarrays se aplica, Tempe, AZ, EE.UU.), que contiene 35,587 sonda fija por chip se utilizó para analizar los perfiles de expresión génica. La hibridación, el procesamiento y la exploración se realizaron por Filgen, Inc. (Nagoya, Japón), las imágenes de datos de exploración se analizaron usando un paquete de software (Herramienta de análisis de datos de microarrays, Filgen). Complete-vinculación agrupación jerárquica se examinó también en los cuatro grupos que utilizan un subconjunto de sonda cualificado (Filgen).
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR de los perfiles de expresión en ratones estómago
relativa cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó utilizando un sistema StepOne real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) con la deshidrogenasa de ratón específico de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH
) de genes como un control interno. Después del tratamiento con DNasa, primeras cadenas de cDNA se sintetizaron a partir de ARN total usando un Kit de Síntesis de ADNc superíndice VILO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). La PCR se llevó a cabo básicamente siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando un kit de QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). Las secuencias de los cebadores para cada gen se enumeran en la Tabla 1. La especificidad de las reacciones de PCR se confirmó usando un programa de curva de fusión se proporciona con el software StepOne y la electroforesis de las muestras de PCR en 3% geles de agarosa. Los niveles de expresión de ARNm se normalizaron a nivel de mRNA de Gapdh
y se comparan con los ratones de control (grupo A) por las secuencias de cebador ΔΔCT method.Table 1 de relación cuantitativa en tiempo real RT-PCR de genes


secuencias
longitud del producto
adhesión no.
Gapdh
5'-AACGGATTTGGCCGTATTG-3 '
140
NM_008084
5'-TTGCCGTGAGTGGAGTCATA-3 '
Cd177
5'-AGGGGTGCCACTCACTGTTA-3'
128
NM_026862
5'-3-CCGATTGTTTTGGAGTCACC
Reg3g

5'-GTATGGATTGGGCTCCATGA-3 '
106
NM_011260
5'-GATTCGTCTCCCAGTTGATG-3'
MUC13
5'-CCTAATCCCTACGCAAACCA-3 '
124
NM_010739
5'-TCTGCCCATTTCTCCTTGTC-3 '
Gapdh
deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato, Reg3g
regeneración de islotes derivado de la proteína gamma 3, MUC13
mucina 13.
pacientes y muestras tumorales
un total de 55 casos de cáncer gástrico avanzado primaria, resecado quirúrgicamente en el hospital Cancer Center de Aichi (Nagoya, Japón) entre 1995 y 2002, fueron investigados después de obtener el consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Centro de Cáncer de Aichi. Los pacientes eran todos varones y la edad media y el período de seguimiento promedio fue de 58,6 ± 10,2 años y 83 semanas, respectivamente. Ninguno había recibido quimioterapia preoperatoria o radioterapia. Carcinomas con tejido mucosa adyacente se fijaron y se embebieron en parafina, y se seccionaron para la tinción con H & E. Clasificación de la estadificación del tumor y el diagnóstico de los casos avanzados se hicieron de acuerdo con la clasificación japonesa de carcinomas gástrico [29]. Los cánceres habían invadido la muscularis propria (T2 para la clasificación TNM), la subserosa (T3), o la serosa y la cavidad peritoneal (T4a), que algunas veces involucra órganos adyacentes (T4b).
La inmunohistoquímica utilizando el tejido de cáncer gástrico humano
se examinó la expresión de CD177, para los que se disponía de un anticuerpo primario comercial, en tejidos de cáncer gástrico humano mediante técnicas de inmunohistoquímica. Después de la inhibición de la actividad de peroxidasa endógena por inmersión en solución de peróxido de hidrógeno /metanol 3%, la recuperación de antígeno se llevó a cabo con tampón citrato 10 mM (pH 6,0) en un horno de microondas durante 10 min a 98 ° C. A continuación, las secciones se incubaron con un anticuerpo anti-CD177 monoclonal de ratón (clon 4C4, se diluyó 1: 100, Abnova, Taipei, Taiwan). La tinción para CD177 se realizó con un kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) y la unión se visualizó con un 0,05% 3,3 'diaminobencidina. Los resultados de la inmunotinción CD177 en células neoplásicas se clasificaron en cuatro grados; grado 0 (ninguno, 0-10% de células positivas), grado 1 (débil, 10-30%), 2 grado (moderado, 30 a 60%), y grado 3 (fuerte, más del 60%) en base a la proporción de las células teñidas, y los casos que muestran moderada a fuerte tinción fueron considerados como positivos.
El análisis estadístico
se utilizó la prueba de Chi-cuadrado con corrección de Bonferroni para evaluar la incidencia de tumor gástrico. valores cuantitativos incluyendo multiplicidad de tumor y la expresión relativa de ARNm se representan como la media ± SD o SE, y las diferencias entre las medias se analizaron estadísticamente mediante ANOVA o la prueba de Kruskal-Wallis seguido por la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. La supervivencia global se estimó mediante el método de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank para las comparaciones. Las correlaciones entre la expresión de CD177 y los factores clínico-patológicos fueron analizados por ANOVA o la prueba de Chi-cuadrado. Se realizó un análisis multivariado para examinar si la sobreexpresión CD177 es un factor pronóstico independiente utilizando el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. Los valores P Red de < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
: Resultados de la Incidencias y las multiplicidades de los tumores gástricos comentario El número efectivo de los ratones y las incidencias y las multiplicidades de los tumores gástricos observados se resumen en la Tabla 2. Los tumores desarrollados en la mucosa gástrica de todos los grupos tratados con MNU (grupos AD) (Figura 1B). En los grupos tratados con la dieta alta en sal (Grupos C y D), la incidencia de tumor gástrico en el Grupo D (H. pylori
infectado con; 100%) fue significativamente mayor que en el grupo C (no infectados; 50,0 %) (P
< 0,05). En grupos de la dieta basal (Grupos A y B), la incidencia también se incrementó por H. pylori
: infección (Grupo A, 61,9% y el Grupo B, 100%), aunque sin significación estadística. Las multiplicidades de tumores totales en ambos grupos infectados
pylori (H. Grupo B, 3.3 ± 1.0 tumores /ratón y el Grupo D, 2.6 ± 1.1) fueron marcadamente superiores a los de los grupos no infectados (Grupo A, 0,9 ± 0,8 y el Grupo C, 1,0 ± 1,2) (P Hotel < 0,05). La multiplicidad de adenocarcinoma gástrico en el Grupo D (2,1 ± 1,4) fue ligeramente mayor que en el grupo B (1,8 ± 1,0) y el aumento de manera significativa en el valor del Grupo C (0,8 ± 1,0) (P
< 0,05). Por el contrario, las multiplicidades de adenomas en los grupos A y D (0,1 ± 0,4 y 0,4 ± 0,5, respectivamente) fueron significativamente más bajos que en el grupo B (1,5 ± 0,6) (P
< 0,05 y 0,01) .Tabla 2 Incidencia y la multiplicidad de los tumores gástricos en el número
eficaz ratones tratados con MNU
Grupo
Tratamiento
Incidencia (%) guía empresas multiplicidad (no. de tumoral /ratón) guía empresas Adenoma
Carcinoma
tumoral total
Adenoma
Carcinoma
tumoral total

Un
21
MNU página 3 (14,3) página 13 (61,9) página 13 (61,9)
0,1 ± 0.4A
0,8 ± 0,7
0,9 ± 0,8 sobre B
4 de MNU + H. pylori
4 (100) b página 4 (100) página 4 (100)
1,5 ± 0,6
1,8 ± 1,0 3,3 ±
1.0c
C página 14
MNU + 10% de NaCl página 2 (14.3) página 6 (42,9) página 7 (50,0)
0,2 ± 0,6 0,8 ± 1,0

1.0 ± 1.2 D
página 9
MNU + H. pylori
+ 10% de NaCl
4 (44,4)
8 (88,8) página 9 (100) d
0,4 ​​± 2,1 ± 0.5e
1.4d
2.6 ± 1.1 d
Valores para la multiplicidad se expresan como media ± SD. Las incidencias se evaluaron en general, mediante la prueba de Chi-cuadrado, seguida de análisis por pares con la corrección de Bonferroni. Las multiplicidades se analizaron en general por ANOVA, seguido de la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. aP Hotel < 0,01 frente
Grupo B, BP Hotel < 0,01 frente
Grupo A, CP Hotel < 0,05 frente
Grupo A, dP Hotel < 0,05 frente
Grupo C, eP Hotel < 0,05 frente
Grupo B.
perfiles de expresión génica en el estómago glandular por microarray de ADN Chat con microarrays de ADN, en comparación con los no infectados y grupo de la dieta basal tratados (grupo a), 34 genes fueron reguladas y 169 se redujeron regulado más de dos veces en H. pylori
ratones infectado con (grupo B), 56 hasta reguladas y 129 hacia abajo -regulated en los ratones tratados con la dieta alta en sal (grupo C), y 69 hasta regulada y 214 las reguladas en el grupo combinado (grupo D) (Figura 2A). Tomados en conjunto, como se muestra en la Tabla 3, se encontró que 35 genes fueron reguladas y 31 genes se redujeron reguladas más de dos veces sólo por la combinación de H. pylori
y la dieta alta en sal. Además, el análisis de agrupamiento jerárquico se realizó en los cuatro grupos con un total de 303 sondas cualificados utilizando el algoritmo de agrupamiento completa-vinculación (Figura 3). Treinta y un sondas incluyendo Cd177
, Reg3g Opiniones y MUC13
fueron confirmados para estar dentro de un grupo de sondas hasta reguladas sólo en el Grupo D. El posterior análisis en el presente estudio se centró en estos genes, porque se consideró que los genes en los que la expresión se vio alterada sólo en el grupo combinado podrían estar asociados con la progresión de la carcinogénesis gástrica y en los seres humanos. Figura 2 Análisis Global gen en el estómago glandular de los ratones tratados con MNU utilizando microarrays de oligonucleótidos. A: Número de genes hacia arriba o hacia abajo reguladas más de dos veces en el estómago de los ratones tratados con MNU. En el diagrama de Venn de, los círculos indican arriba (izquierda) o genes regulados (derecha) en el estómago de los ratones tratados con MNU con H. pylori
, dieta alta en sal o su combinación. El área sombreada representa los genes regulados por incremento o disminución, más de dos veces sólo por la combinación. B: cuantitativa en tiempo real RT-PCR análisis de los tres seleccionados hasta los genes regulados (Cd177
, Reg3g
y MUC13
) en los estómagos de los ratones tratados con MNU. Los niveles de expresión de los genes en cada muestra se normalizaron por Gapdh
de control como interna utilizando el método ΔΔCT. los niveles relativos de expresión se representan como el cambio de X veces en relación con el grupo A (fijo como 1.0). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Kruskal-Wallis para el análisis general y prueba de Tukey para comparaciones múltiples. Bares, SE; *, P Hotel < 0.01 vs.
Grupo A y < 0.05 vs.
Grupo C; †, P Hotel < 0.01 vs
Grupo C.
Tabla 3 genes regulados por la combinación de la infección por H. pylori y la dieta alta en sal en la mucosa gástrica de ratón
adhesión no.
Símbolo

genes /proteínas de
Desdoblar cambios
genes regulados
XM_357640
Igk-V8
variable de la cadena kappa de inmunoglobulina 8 (V8)
14.4
XM_001472541
Ighg
cadena pesada de inmunoglobulina (polipéptido gamma)
9.2
NM_026862
Cd177
CD177 antígeno
7.3
NM_011260
Reg3g
La regeneración de los islotes derivado 3 gamma
6.1
NM_023137
Ubd
ubiquitina D
4.3
XM_144817
Igk-V34
inmunoglobulina kappa variable de la cadena 34 (V34)
4.1
NM_007675
Ceacam10
carcinoembrionario molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno-10
3,7
NM_183322
Khdc1a
KH dominio que contiene 1A
3.3
NM_011475
Sprr2i
pequeña proteína rica en prolina 2I
3.2
NM_175165
TPRG
proteína relacionada con la transformación regulada 63
3.2
NM_175406
Atp6v0d2
ATPasa, transporte de H + , lisosomal V0 subunidad D2
3.0
NM_009703
Araf
v-raf sarcoma murino de 3611 homólogo oncogén viral
2.6
NM_026822
Lce1b
Late envoltura córnea 1B
2.5
NM_016958
KRT14
Queratina 14
2.5
NM_212487
Krt78
Queratina 78
2.4
NM_009807
CASP1
caspasa 1
2.4
NM_146037
Kcnk13
canal de potasio, K subfamilia, miembro de 13
2.4
NM_019450
Il1f6
interleucina-1, 6
miembro de 2.3
NM_008827
Pgf
Factor de crecimiento placentario
2.3
XM_893506
Klk12
calicreína relacionados con peptidasa 12
2.3
NM_016887
Cldn7
Claudín 7
2.3
NM_029360
Tm4sf5
4 transmembrana miembro de la superfamilia 5
2.2
NM_172301
ccnb1
ciclina B1
2.2
NM_010739
MUC13
mucina 13, transmembrana epitelial
2.2
NM_011165
Prl4a1
familia prolactina 4 subfamilia a miembro de 1

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