PLoS ONE: Intestinale Stammzell-Marker in der intestinale Metaplasie des Magens und des Barrett-Ösophagus

Abstrakt

Magen-Darm-Metaplasie (IM) ist eine sehr weit verbreitete präneoplastischen Läsion; jedoch sind die molekularen Mechanismen ihrer Entwicklung gehören nach wie vor unklar. Wir haben früher, dass eine Population von Zellen gezeigt, dass die Darm-Stammzellen (ISC) Marker exprimieren LGR5
erhöht sich merklich in IM. In dieser Studie untersuchten wir weiter die molekularen Eigenschaften dieser LGR5
<sup>+ Zellen im IM durch das Expressionsprofil von mehreren ISC Marker untersuchen. Bemerkenswert ist, fanden wir, dass ISC Marker-inklusive OLFM4
und EPHB2
-sind positiv im Zusammenhang mit der CDX2
Ausdruck in nicht-tumorösen Magengewebe. Dieser Befund wurde in Magen-Läsionen mit oder ohne Metaplasie bestätigt, die zeigten, dass OLFM4 und EPHB2 Ausdruck allmählich mit metaplastischen Progression erhöht. Außerdem ergab RNA in situ Hybridisierung, dass LGR5
+ Zellen koexprimiert mehrere Marker ISC und blieb mit der Basis von metaplastischen Drüsen beschränkt, erinnernd an die der normalen Darmkrypten, während die in normalen Drüsen antral keine ausgedrückt dieser Marker. Darüber hinaus wurden eine große Anzahl von ISC Marker exprimierenden Zellen diffus in Magen Adenome verteilt, was darauf hindeutet, dass diese Marker Magen tumorigenesis erleichtern. eine ähnliche Verteilung von ISC Markern, die das Vorhandensein eines Stammzellpopulation mit intestinaler Differenzierungspotential zusätzlich Barrett-Ösophagus (BE) -Welches histologisch ähnlich wie intestinale Metaplasie ist-ausgestellt. Abschließend haben wir festgestellt, dass LGR5
+ Zellen im Magen-IM und BE koexprimiert ISC Marker und die gleiche Expressionsprofil wie bei normalen Darmkrypten gefunden aufweisen. Zusammengenommen implizieren diese Ergebnisse eine Darm-ähnlichen Stammzellpopulation in der Pathogenese von IM, und stellen eine wichtige Grundlage für das Verständnis der Entwicklung und Wartung dieser Krankheit</sup>

Citation:. Jang BG, Lee BL, Kim WH (2015) Darmzellmarker in der intestinale Metaplasie des Magens und des Barrett-Ösophagus Stamm. PLoS ONE 10 (5): e0127300. doi: 10.1371 /journal.pone.0127300

Academic Editor: Anthony W. I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Empfangen: 8. Januar 2015; Akzeptiert: 13. April 2015; Veröffentlicht am: 21. Mai 2015

Copyright: © 2015 Jang et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Korea Health Technology R &unterstützt wurde; D-Projekt durch die Korea Health Industry Development Institute (Khidi), gefördert durch das Ministerium für. Gesundheit & Welfare, Republik Korea (Grant-Nummer: HI14C1277). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Präkanzeröse intestinale Metaplasie (iM) mit einem erhöhten Risiko für Magenkarzinom assoziiert und stellt in etwa ein Viertel der Menschen weltweit. [1] iM resultiert häufig aus chronische atrophische Gastritis nach der Infektion mit Helicobacter pylori
, die magen epitheliale Dysplasie oder Karzinom dann fortschreiten können. [2] Eine Vielzahl von genetischen und epigenetischen Veränderungen sind in der Pathogenese von menschlichen iM gebracht worden [3]. Darüber hinaus hat lang~~POS=TRUNC iM induziert durch CDX2 Expression gewesen gezeigt zu Magenkrebs in transgenen Mäusen zu führen, was darauf hinweist, dass iM selbst eine wesentliche Rolle bei der Entstehung des Magenkarzinoms spielt. [4]

Da iM ein kritischer Vorläufer im Magen Karzinogenese ist, das Potential, diese Läsionen umkehren von großem Interesse ist. [5] Die bisherigen Untersuchungen, dass die Beseitigung von H
berichtet haben. pylori
reicht IM umkehren, noch andere gefunden haben, dass ein erheblicher Anteil der Patienten noch vorhanden mit IM auch nach wirksamen Tilgung. [5] IM wird angenommen, dass in der histologischen der "point of no return" zu sein Kaskade von chronischer Gastritis zum Adenokarzinom; [6] damit die Bemühungen um die molekularen Mechanismen, die Regulierung der Einrichtung und Wartung von IM sind von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Strategien zu verstehen, Magen-Krebsentstehung zu unterbrechen. Zum Beispiel wird CDX2 Autoregulation schlug einen großen Einfluss auf die Stabilität der IM-Läsionen zu haben. [7] Während IM Krypten im menschlichen Magen sind klonalen und multipotenter Stammzellen enthalten, [8] es schlecht bleibt verstanden, ob einheimische Magen Stammzellen die anfängliche Quelle von Metaplasie oder wenn sie nur dazu dienen, etablierten Läsionen zu halten.

die Entdeckung der normalen Magenschleimhaut Stammzellen fiel mit Identifizierung des Wnt Zielgens LGR5
als Stammzellmarker in das Darmepithel. [9] Eine abstammungs Tracing Studie ergab später, dass LGR5
<sup>+ Zellen sind multipotente Stammzellen verantwortlich für die Erneuerung des Magen-Epithel in den Mäusen. [10] Unsere Gruppe haben bereits gezeigt, dass eine kleine Anzahl von LGR5
+ Zellen befinden sich auch an der Unterseite des menschlichen antral Drüsen und dramatisch in iM Läsionen erhöhen. [11] Diese Befunde führte uns, dass LGR5 zu spekulieren
kann sein bei der Aufrechterhaltung der iM beteiligt ein Marker für Darm-Stammzellen (ISCs).</sup>

Barrett-Ösophagus (BE) ist eine metaplastischen Umwandlung Epithel zu Darm- und mit einem erhöhten Risiko des Adenokarzinoms, ähnlich der beobachteten verbunden ist Vor allem mit Magen-iM. [12], zeigen menschliche BE Läsionen eine Hochregulation von LGR5
Ausdruck, wenn in den normalen Plattenepithel verglichen und deutet auf das Vorhandensein eines LGR5
^{+ Stammzellen in BE. [13]}

Mehrere molekulare ISC-Marker haben zusätzlich zu LGR5
, einschließlich PROM1
[14], BMI1
[15], LRIG1
[16] und ASCL2
, die als Transkriptionsfaktor identifiziert wurde Darm-Stammzellen Schicksal zu kontrollieren. [17] Darüber hinaus OLFM4
[17] und EPHB2
[18] sind ebenfalls stark in ISCs ausgedrückt. In dieser Studie haben wir versucht zusätzliche ISC Marker in der Entstehung und Aufrechterhaltung des Magen-IM und BE und prüft ihre Kolokalisation mit einbezogen zu entdecken LGR5
<sup>+ Zellen durch RNA in situ Hybridisierung, um die molekulare offenbaren Eigenschaften von LGR5
+ Zellen im iM in Bezug auf die Darm-artigen Stammzell-Phänotyp.</sup>

Materialien und Methoden

Themen

Formalin -fixed und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Magen-Proben mit oder ohne intestinale Metaplasie (iM) von fünf Patienten gesammelt wurden, die von 2008 bis 2010 iM Läsionen endoskopisch Submukosadissektion an der Seoul National University Hospital (SNUH) wurden in kategorisiert wurden Magen-und -intestinal gemischt (GI) und ausschließlich Darm (I) Subtypen (auch unvollständige und vollständige Arten bekannt sind). [19] die Proben von Barrett-Ösophagus wurden von zwei Patienten mit einem Adenokarzinom der gastro-Kreuzung isoliert, und eine normale Dünndarm Probe war von einem Patienten mit Darmkrebs erhalten. Frisch gefroren nicht tumoröse waren Magengewebe von 28 Patienten mit Magenkrebs zur Verfügung, die chirurgische gastrectomy 2001-2005 bei SNUH unterzogen hatte.

Ethical Aussage

Alle menschlichen Proben durch eine kurative chirurgische Resektion erhalten . Diese retrospektive Studie wurde unter Verwendung von gespeicherten Proben nach pathologischen Diagnose durchgeführt. Die Proben wurden vor der Studie anonymisiert, so dass schriftliche Zustimmung nicht erforderlich war. Das Studiendesign wurde von der Institutional Review Board an der Seoul National University Hospital unter der Bedingung der Anonymisierung genehmigt (Referenz: H-1209-037-424).

RNA in situ Hybridisierung

In situ Hybridisierung für LGR5
, ASCL2
, OLFM4
und EPHB2
wurde mit dem RNAscope FFPE-Assay-Kits (Advanced Cell Diagnostics durchgeführt, Inc. , Hayward, CA, USA) wie zuvor beschrieben [11]. Positive Flecken wurde als das Vorhandensein von braunen punctate Punkte im Zellkern und /oder Zytoplasma definiert. Das Ubiquitin C und bakterielle dapB
Gene diente als positive und negative Kontrollen.

RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA wurde aus Paraffin eingebetteten extrahiert Gewebeschnitte mit einem RNeasy FFPE Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) wie zuvor beschrieben [20]. revers transkribierter cDNA aus 1-2μg der gesamt-RNA mit zufälligen Hexamer-Primern und dem GoScript Reverse Transkriptionssystem (Promega, Madison, hergestellt wurde , WI, USA). Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) Reaktionen wurden unter Verwendung von Premix EX-Taq (Takara Bio, Shiga, Japan) durchgeführt gemäß den Empfehlungen des Herstellers und die Daten analysiert Sequence Detection System-Software (Version 1.4, Applied Biosystems). Die folgenden TaqMan Genexpression Assays wurden verwendet: Hs00173664_m1 ( LGR5
), Hs00362096_m1 ( EPHB2
), Hs00270888_s1 ( ASCL2
), Hs00197437_m1 ( OLFM4
), Hs01009250_m1 ( PROM1
), Hs00394267_m1 ( LRIG1
), Hs00995536_m1 ( BMI1
), Hs00178027_m1 ( DCLK1
), Hs010780810_m1 ( CDX2
), Hs00212584_m1 ( CLDN18
) und Hs0275899_g1 ( GAPDH
). GAPDH
als endogene Kontrolle diente.

Die Transfektion von CDX2

CDX2 cDNA (pCMV6-CDX2) wurde von OriGene gekauft (Rockville, MD, USA). Magenkrebs-Zellen wurden in 6-Well-Platte mit 1 × 10 ^{6 Zellen /Well ausgesät und mit 2,5 ug cDNA oder leeren Kontrollvektor transfiziert unter Verwendung von Lipofectamin 2000 Transfektionsreagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß dem Hersteller Anleitung. Die Zellen wurden etwa 24 Stunden nach der Transfektion zu qRT-PCR-Analyse unterzogen.}

Die statistische Analyse

Statistische Analysen wurden in Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA) durchgeführt. Korrelationen zwischen den Ausdrücken der intestinalen Stammzellmarker und CDX2
wurde durch lineare Regressionsanalyse ermittelt. Mittelwertsunterschiede zwischen den Gruppen von FFPE Magenproben wurden durch Einweg-ANOVA bewertet. Zwischen-Gruppenvergleiche nach der Transfektion von CDX2
bei Magenkrebs-Zelllinien wurden unter Verwendung des Student durchgeführt t
-Tests. Die Ergebnisse wurden als signifikant, wenn p
<betrachtet; 0,05.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Extra-Speiseröhren Pepsin von Magen refluxate Promoted Tonsillenhypertrophie
• PLoS ONE: Immer Gamble auf nüchternen Magen: Hunger ist im Zusammenhang mit Vorteilhafte Entscheidung Making