PLOS ONE: Ultra-Djupsekvensering avslöjar mikroRNA uttrycksmönstret för den mänskliga magen

Abstrakt

Bakgrund

Medan mikroRNA (miRNA) spelar en viktig roll i vävnadsdifferentiering och upprätthålla basala fysiologi, lite är känt om de miRNA expressionsnivåerna i magen vävnad. Förändringar i miRNA profil kan leda till cell avreglering, som kan inducera neoplasi.

Metodik /viktigaste resultaten

Ett litet RNA bibliotek med magen vävnad sekvenserades med hjälp av hög genomströmning SOLiD sekvensering. Vi erhöll 261.274 kvalitet läser med perfekta matchningar med den humana miRnome, och 42% av kända miRNA identifierades. Digital profilering av genuttryck (DGE) utfördes baserat på lästa överflöd och visade att femton miRNAs starkt uttrycktes i gastrisk vävnad. Därefter fick uttryck av dessa miRNA valideras i 10 friska individer genom RT-PCR visade en signifikant korrelation av 83,97% (P < 0,05). Sex miRNAs visade en låg varierande mönster av uttryck (MIR-29b, MIR-29c, MIR-19b, MIR-31, MIR-148a, MIR-451) och kan betraktas som en del av uttrycksmönstret för en sund mag-vävnad.

slutsatser /Betydelse

Denna studie syftade till att validera normala miRNA profiler av human gastrisk vävnad för att etablera en referensprofilen för friska individer. Fastställandet av regleringsprocesser som verkar i magen kommer att vara viktigt i kampen mot magcancer, som är den näst vanligaste orsaken till cancerdödlighet i världen

Citation. Ribeiro-dos-Santos Â, Khayat AS, Silva A , Alencar DO, Lobato J, Luz L, et al. (2010) Ultra-Djupsekvensering avslöjar mikroRNA uttrycksmönstret för den mänskliga magen. PLoS ONE 5 (10): e13205. doi: 10.1371 /journal.pone.0013205

Redaktör: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Mottagna: 30 mars 2010. Accepteras: 8 september 2010. Publicerad: 8 october 2010

Copyright: © 2010 Ribeiro-dos-Santos et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Arbetet stöddes av Genoma Paraense de Genomica e proteomik Project (Governo do Para /SEDECT /FAPESPA), PROPESP /UFPA, FADESP kappor (Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Nyligen Friedman et al.
2009 visade att majoriteten av mänskliga gener är under kontroll av miRNA. Den > 45.000 miRNA målställen inom mänskliga 3'UTRs bevaras, och > 60% av de humana proteinkodande gener har varit under selektivt tryck för att hålla ihopkopplingar till miRNAs [1]. miRNA är små, icke-kodande sekvenser av 17-25 bp som reglerar genexpression genom att binda till 3'-änden av mål-mRNA, vilket resulterar i inhibering av translation av mRNA [2], [3]. Cirka 14.000 miRNA har identifierats i djur, växter och svampar [4], [5], [6]

mekanismer som involverar miRNAs som negativa regulatorer av genuttryck är liknande i djur och växter. de reglerar grundläggande cellulära processer [6]. Hos människor är ca 3% av alla gener förutsägs koda miRNA prekursorer och över > 60% av proteinkodande gener kan regleras av miRNA [1]. MiRNA har viktiga funktioner i många cellulära processer såsom tillväxt och utveckling, cellulär proliferation, differentiering och apoptos. Följaktligen förändringar i miRNA uttryck bidra till mänskliga sjukdomar såsom cancer [7], [8].

Förändringar i miRNA uttryck mönster har observerats i många typer av human cancer, såsom bröst-, kolon, lunga, prostata, leukemi och mage cancer. miRNA uttryck förändringar leder till en förlust eller vinst på funktion och är förknippade med utvecklingen av mänskliga tumör via olika mekanismer [5].

Här presenterar vi en genetisk studie av miRNA av människans mage, eftersom trots vikten av orgeln, små genetiska data finns tillgängliga på deras närvaro och reglering hos människa. Detta arbete är det första hela miRnome sekvensering av normal mage vävnad med hjälp av nästa generations sekvenseringsteknologi.

Resultat

I den aktuella studien har profiler som erhållits genom ultra djup sekvensering med hjälp av solid plattform ( Life Technologies, CA, USA). Detta är den första studien att använda detta förfarande för att beskriva miRnome normal gastrisk vävnad. miRNAs isolerades från normal gastric cardia slemhinna en enda frisk patient. Profilerna validerades med Real Time PCR för att bestämma uttrycket av de 15 mest uttryckta miRNAs i ytterligare 10 friska patienter.

ULTRA-DEEP SEKVENS

Ultra djup sekvensering gav totalt 104 miljoner rå läser och 5.000.000 läser för gastric cardia miRNA bibliotek. För ytterligare analys, 3,2 miljoner läser valdes enligt sekvenskvalitet (åtminstone QV≥10 i de första 10 baserna) [8]. Efter kartläggning dessa det mänskliga genomet (släppa 19), kartlagt den totala läsa räkningen var 2.534.490 miljoner läser (75% av den totala kvalitet läser). Cirka 38% av 2,5 miljoner läser (963.460 läsningar) var repetitiva DNA-sekvenser, tRNA, rRNA eller andra små molekyler; 10% (261.274) godtogs läser, perfekt i linje med kända mogna miRNA (MirBase version 15, släpper 04/2010) [9]; och resten av läser (52%) matchades att genomsekvenser (Figur 1).

För expressionsanalys av miRNA, endast läser med tändstickor att mogna miRNA sekvenser (261.274 läsningar) ingick. I gastric cardia, identifierade vi 404 av 970 kända mogna miRNA sekvenser (42%). För att analysera uttrycket av miRNA, definierade vi fem intervall: 1 till 10 lästa räknas; 11-100; 101 till 1000; 1001 till 5000; och en läsa räkning av över 5000 (Figur 2) (ytterligare detaljer ges i tabell S1). Det första intervallet (1-10) innefattade 40% av miRNA observerade; det andra området (11 till 100) innefattade 26%; den tredje intervallet (101 till 1000) innefattade 20%; och den fjärde och femte intervall (> 1000 read count) bestod av 14%

Med denna klassificering, 347 mogna miRNA uttrycktes mellan den första och den tredje intervall och 57 mellan den fjärde och femte intervall.. För karakterisering av miRnome, valde vi en uppsättning av de 15 miRNA som uttrycktes på de högsta nivåerna (≥1,000 läsningar).

Tabell 1 och Figur 3 en förteckning över de 15 mogna miRNA identifierats i mänskliga gastric cardia de . Den heatmap i figur 4 sammanfattar uttrycket av dessa 15 miRNA i magsäcks magmunnen och över normala humana vävnader, DGE data tillgängliga i microRNA.org databanken [10], [11]. Mogna miRNA uttryck kan delas in i två grupper: i) Cardias-vävnader: miRNAs sällan uttrycks i andra vävnader, men uttrycks i gastric cardia, inklusive MIR-148a, MIR-192, MIR-200A och MIR-200b; ii) kvasi-överallt: miRNAs uttrycks i många vävnader och villkor, inklusive MIR-29c, MIR-21, MIR-24, MIR-29b, MIR-29a, MIR-451, MIR-31, MIR-145, MIR-26a mir-19b och låt-7b.

realtids PCR

ultra djupa sekvense resultat validerades med hjälp av singleplex Real Time PCR (RT-PCR) metoden på 15 miRNA väljs till bestämma deras uttryck i gastric cardia regionen från 10 friska individer. Av försökspersonerna, 60% var män, medelåldern var 39,1 (± 12,8) år och 50% av de undersökta ämnena testade positivt för H. pylori
, enligt internationella kriterier som fastställts för att identifiera [12], [13] (tabell 2) (ytterligare detaljer ges i tabell S2).

COMPARARISON MED DGE och RT-PCR

Både singleplex (RT-PCR) och multiplex (solid plattform) teknik uppvisade hög expression (uttryck över 1000 läser i DGE och 7-faldigt över den endogena kontrollen i RT-PCR) av de 15 miRNA (figurerna 4 och 5) katalog

samma RNA-proverna analyserats av två olika plattformar: DGE och RT-PCR - Life Technologies.. Resultaten experiment jämfördes och observerades linjär regression mellan två ^{-ΔCt och kvadratroten ur läsa räknetal. Pearson korrelation är hög 83,9% med statistiskt signifikant prov (P < 0,05). Och validerade goda resultat}

Dessutom var DGE resultat jämfört med kvantifiering av uttrycket utbud av miRNA i 10 friska försökspersoner, av Real Time PCR. Regressionen för genomsnittet av RT-PCR-analyser kontra
kvadratroten ur läsa räknetal. Pearson korrelation är hög 68,4% med statistiskt signifikant prov (P < 0,05).

kunde observera miRNAs med hög interindividuell variation, för Exempla MIR-21, och en annan med låg interindividuell variation, t.ex. uttrycksmönster något variabel (MIR-29b, MIR-29c, MIR-19b, MIR-31, MIR-148a, MIR-451).

Diskussion

miRNAs reglera majoriteten av mänskliga gener; har dock endast ett fåtal miRNA hade sina mål och specifika funktioner identifieras [14]. I vår studie var magen prov erhållet från en enda individ utan magen neoplasi eller andra pre-neoplasi tillstånd såsom atrofi, metaplasi eller dysplasi. Precancerösa lesioner såsom gastrit leder till genomiskt hypo-metylering i magen som kan modifiera expressionsmönstret av miRNA [15]. Provet erhölls från normal vävnad från en patient utan några sjukdomar, som hjälpte till att undvika risken för att samla in en till synes normal vävnadsprov med mikro invasioner av tidigt skede tumörogena celler som kan förekomma hos patienter med något av ovanstående patologier.

Denna studie är den första ultrahög genomströmning sekvensering av miRNA i fysiologiskt normal human mage. Endast 5,06% av miRNA identifierats i gastrisk vävnad hade redan upptäckts i andra vävnader och katalogiseras i bioinformatik databaser såsom microRNA.org [10]. Vi förväntar oss att denna grupp av miRNA vara regulatorer av housekeeping-gener, som är rikligt förekommande i mänskliga vävnader. Ytterligare 7,84% av miRNA hade inga matcher i miRNA uttryck databaser och kan representera miRNAs som är specifika för matsmältningssystemet eller mage.

Liknande studier har genomförts med andra normala vävnader, såsom munnen, svalget, matstrupe, anus och tarmen. Vi jämförde dessa data med våra miRNA expressionsdata för att definiera uttrycksmönstret i magen vävnad. Vi hittade höga uttrycksnivåer i 15 miRNA, varav 13 redan har identifierats som mycket uttrycks i andra vävnader.

Uttrycket av mir-148a och mir-192 hade identifierats i andra normala och cancer mänskliga vävnader, men var inte överuttryckt. Mir-192 hade redan detekterats i gastrointestinala vävnader såsom kolon, ileum, duodenum, tunntarm, mage, bukspottkörtel och lever [16]. Basala uttryck av mir-148a har observerats i bindväv och endokrin vävnad [17]. Nyligen var mir-148a befunnits undertryckas i navelsträngsblodceller [18] och tystas genom hypermetylering i kolontumörer [19]. Vi observerade hög expression av mir-200 kluster (a och b) i gastric cardia som observerats i de Langerhanska öarna [11]. I en mikromatris experiment mir-200a och mir-200b detekteras vid låga nivåer i gastrointestinala vävnader, men vid höga nivåer i kolon, mage och pankreas [16]. En nyligen publicerade mikroRNA uttryck atlas visade att miRNA är kännetecknande för endokrin vävnad [17]. Senaste resultaten visar att den låga expressionen av mir-200 kluster är korrelerad med äggstockscancer [19], [20]. Därför kan mir-200 kluster vara viktig för att upprätthålla integriteten i mag vävnader såsom gastric cardia, eftersom en sådan hög expression uppreglerad uttrycket av e-cadherin, proteinet som ansvarar för organisationen av arkitekturen i epitelvävnad. Dessutom är resultaten antydde starkt en viktig roll Mir-200 familj i förtrycket av epitel-mesenkymala övergång (EMT) och utvecklingen av cancer [21].

Tabell 1 och 2 visar antalet möjliga mål för varje höggradigt uttryckt mogen miRNA. Tabell 2 visar några mål för miRNA förutsagda av TargetScan mot familjer bevarade miRNA. Med undantag för MIR-451, alla delade åtminstone två andra gen mål. Generna ANKD52 Mössor och UBN2
, är mål för tio av de fjorton miRNA analyserade, medan genen TNRC6B
är nio miRNA, och generna EPS15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6
och PTPRD DD6
, är mål för åtta miRNA. Detta resultat tyder på att dessa miRNA är starka kandidater som ska tystas i cardia region. Den experimentella validering av dessa gener, följt av en analys av funktionen hos var och en kan avslöja den fysiologiska rollen av dessa miRNA i normal gastrisk vävnad.

Många miRNA kan reglera översättningen av proteiner som fungerar i vävnads spridning och vävnad mönstring som mir-200a (som kan rikta integrin) och mir-145 (som kan interagera med ErbB4
mRNA). Många förväntade mRNA-mål visade sig vara gemensam för flera högt uttryckta miRNA. Till exempel HTR4
(5-hydroxitryptamin [serotonin] receptor) och AFF2
mRNA ( AF4 /FMR2
familj, medlem 2) förutsågs att vara mål för 13 av de 15 mest uttryckta miRNA. Ytterligare fem mRNA, inklusive IGF-1
(insulinliknande tillväxtfaktor 1 [somatomedin C]), var vanliga förväntade målen i 12 miRNA. Åtta miRNAs hade 222 förväntade mål gemensamt; till exempel, mir-29b förutspått att rikta 196 av dessa. Fem miRNA (19b, 29a, 29b, 29c och 148a) delade 70 förutspådde mål, varav en del ( CDK6
, PTEN
, IGF1
, FRS2
, PDGFRA
, PIK3R1 Köpa och MXD1
) reglerar celldelning och tumörundertryckning.

Flera observationer länkar miRNAs till cancer. Först är många miRNA involverade i cellulär proliferation och apoptos. För det andra, många miRNA loci belägna i känsliga områden av det mänskliga genomet, regioner som ofta förstärks eller borttagna i mänskliga neoplasier och orsaka stora skillnader i miRNA uttryck jämfört med normala vävnader [21], [22], [23], [24 ].

Real Time PCR-tekniken (som använder relativ kvantifiering) bekräftade 15 miRNA som har utvisat det högsta uttrycket av solid plattform (som bygger på absoluta tal) (figurerna 4 och 5). Därför kan dessa miRNA anses vara överuttryckt [25], [26], [27], [28]. Korrelationen mellan DGE och RT-PCR-analyser var klart och statistik signifikant. Och DGE experiment kunde anses vara representativa för vävnader gastric prover isolerade från 10 hälsoämnen och definierar en del av uttrycksmönstret för en sund mag-vävnad.

Resultaten från de båda metoder visar att miRNA-21 var den mest uttryckt i gastric cardia vävnad. Denna miRNA distribueras också i andra humana vävnader (t.ex., dendritiska celler, T-celler, pankreas) och skulle kunna vara inblandade i regleringen av uttrycket av housekeeping-gener ( ATPAF1
, KIF3A
CYBRD1
).

solid plattform visade att mIR-192 och 148a är specifika för gastric vävnad. Dessutom bekräftade Real Time PCR att dessa miRNA är överuttryckt. Således, totalt sett, är dessa miRNA kommer sannolikt att reglera expressionen av gener relaterade till gastrisk vävnad homeostas. Därför kunde de låga uttrycksnivåer av dessa miRNA relateras till utvecklingen av en mage neoplasi. Den potentiella användningen av miRNA-192 och miRNA-148a som riskmarkörer i ventrikelcancer bäst kan undersökas genom analys av miRnomes av olika histologiska typer av magcancer.

Att förstå de regulatoriska processer som verkar i den mänskliga mage kommer att vara viktigt i kampen mot magcancer, som är den näst vanligaste orsaken till cancerdödlighet i världen.

Material och metoder

biologiskt material

gastric cardia är en mikroskopisk zon som normalt återfinnes i den mest proximala delen av magen, nära den esophageal öppning (cardiac mynning eller den övre magmunnen) och innehåller de hjärt körtlar. Vår färska vävnadsprov för ultra djup sekvensering erhölls från en gastroskopi biopsi (~ 4 mm ^{3). Patienten var 33 år gammal, med inga tecken på cancer och en normal matstrupsövergången. Makroskopisk observation av vävnaden visade inga tecken på skador, och histologisk undersökning bekräftade normala och god arbetsmiljö.}

För att bekräfta resultaten av ultra-djup sekvensering, Cardias prover, nära hjärt öppning, från 10 dessutom friska individer var också erhållas genom endoskopiska biopsier (~ 4 mm ^{3) och, efter histologisk undersökning exklusive abnormaliteter, analyserades av Real Time PCR. H. pylori
infektion diagnostiserades baserat på det typiska utseendet av bakterien längs slemlagret som täcker magslemhinnan antral biopsier togs för histologi utvärdering till följd av högre täthet av bakterierna i gastrisk antrum och den utmärkta känsligheten hos denna diagnosmetod enligt internationella kriterier som fastställts för att identifiera [12], [13] (ytterligare detaljer ges i tabell S2).}

ETIK ANALYS

skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter, och studien godkändes av Comité de Etica em pesquisa (CEP) sjukhus Universitário João Barros Barreto (HUJBB) -. Federal University of Pará (UFPA) (Protokollnummer nummer~~POS=HEADCOMP 14.052.004 /HUJBB) katalog

miRNA BIBLIOTEK

den totala små RNA erhölls från vävnadsprovet med hjälp av Mirvana Isolation Kit (Ambion Inc., USA). Koncentrationen och kvaliteten bestämdes med användning av en Nanodrop 1000 spektrofotometer, och rening och storleksselektion utfördes med användning av 6% polyakrylamidgelelektrofores. Med användning av den fasta substansen Small RNA Expression Kit (Ambion Inc., USA), var 200 ng av små RNA av 150-200 bp användes som ett templat för att erhålla den miRNA biblioteket. Alla miRNA i biblioteket märktes med unika och specifika amplifieringsprimers, känd som streckkodssystemet (Life Technologies, CA, USA). Sedan tillsattes 50 pg av biblioteket poolades med sju andra miRNA bibliotek vid samma koncentration. En fraktion av biblioteket pool (0,1 pg) amplifierades och fixerades på magnetiska pärlor med användning av emulsion PCR. Den ePCR produkten avsattes på en enda bild och utsattes för multiplex SOLiD sekvenseringsreaktion.

SOLiD mycket djupa sekvensering och DATAANALYS

De fasta (version 2.0) sekvenseringssystemet (Life Technologies) användes för att generera läser som var 35 bp lång. Det andra steget var att avkoda streckkoden, som matchar varje kula sekvens med identiteten av provet. Alla små RNA-sekvenser av gastric cardia finns i NCBI sekvenser Läs Archive (SRA012099). Sekvensanalys utfördes med hjälp av den fasta system Small RNA Analysis Tool (Life Technologies) och MiRanalyzer [8]. Först, vi filtrerat ut alla sekvenser som matchade RNA föroreningar såsom tRNA, rRNA, DNA upprepningar och adaptermolekyler. Efter exklusive förorening läser vi i linje alla sekvenser mot miRNA föregångare sekvenser (MirBase ver. 12) och sedan bara inkluderade läser som matchade mogna miRNA sekvenser [9]. Att jämföra dessa expressionsdata med andra humana vävnader, var miRNA expressionsdata importeras från microRNA.org databasen och ett uttryck för varje mogna miRNA normaliserades genom total läs räkna [10]. Grafisk analys utfördes med hjälp av Genepattern ^{10. Mirna-biologisk processförhållanden förutsågs användning av miRNApath (http://lgmb.fmrp.usp.br/mirnapath/tools.php).}

miRNA realtids PCR (VALIDERING) Review

biopsi prover av gastriska Cardias vävnader samlades från 10 friska patienter. Efter uppsamling proverna omedelbart bearbetas och lagras vid -80 ° C tills RNA-extraktion. Totalt RNA extraherades genom homogenisering 40 milligram fryst vävnad, följt av RNA-isolering genom TRIzol-reagens (Life Technologies) enligt tillverkarens instruktioner. Koncentrationen och kvaliteten på miRNA bestämdes med användning av en Nanodrop 1000 spektrofotometer (ND-1000; Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). Totalt RNA transkriberades omvänt med användning av en TaqMan @ MicroRNA omvänd transkription kit (Life Technologies).

Analysen av miRNA nivåer utfördes på en 7500 realtids-PCR System (Life Technologies) med TaqMan miRNA analyser i enlighet med den tillverkarens instruktioner (Life Technologies) med hjälp av primers utformade med Primer Express (Life Technologies). Medelvärdet expressionsnivån av tre humana endogena kontroller (Z30, RNU19 och RNU6B - kalibratorer). Användes som en intern kontroll i alla miRNA experiment för att göra det möjligt för jämförelse av uttryck resulterar

De höga expressionsnivåer av miRNA identifieras genom ultra djup sekvensering (i fallande ordning: mIR-29c, mIR-21, mIR-148a, mIR-29a, mIR-24, mIR-29b, mIR-192, mIR-451, mIR-145, mIR-31, mIR-200a, mIR-19b, mIR-200b, låt-7b och mIR-26a) validerades med TaqMan miRNA analyser (Life Technologies). Dessa analyser användes för att mäta uttrycksnivåer av mogna miRNA och interindividuella variationer i de 10 prover av frisk magmunnen vävnad. Expressionsdata för vardera mogna miRNA normaliserades till den nivå betyda uttrycket av de tre humana endogena kontroller (Z30, RNU19 och RNU6B). De relativa miRNA expressionsnivåerna beräknades sedan genom jämförande tröskelcykeln (Ct) metoden (2 ^{-ΔCt). Korrelationstest utfördes med användning av Pearson-metoden (SPSS V.12).}

Bakgrundsinformation
tabell S1.
Identitet och förekomst data för alla kända miRNA i fast sekvens dataset i människans mage och miRamda databas
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013205.s001
(0,44 MB PDF) Review tabell S2.
Beskrivning och RT-PCR-resultat av 10 prover från friska individer som erhållits genom endoskopiska biopsier. Prover storlek är ca ~ 4 mm3. För alla prover utfördes en histologisk undersökning och H. pylori upptäckt
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013205.s002
(0,03 MB XLS) katalog

Tack till

författare tack D. Calcagno och S. Demaschki för sina kommentarer, idéer och hjälper.

• PLOS ONE: Vägen till en mans hjärta går genom magen: Hur hästar
• PLOS ONE: Effekterna av en Energy Drink på struktur magen och bukspottkörteln hos Albino Rat: Kan Omega-3 Ge en Protection