PLoS ONE: Ultra-Deep Sequencing paljastaa microRNA Expression Pattern Human Stomach

tiivistelmä

Background

Vaikka MikroRNA (miRNA) tärkeitä rooleja kudosten erilaistumiseen ja ylläpitämisessä pohjapinta fysiologia, vähän tiedetään miRNA ekspressiotasot vatsassa kudoksessa. Muutokset Mirna profiilin voi johtaa solun vapauttamisen, mikä voi aiheuttaa neoplasia.

Menetelmät /Principal Havainnot

Pieni RNA kirjasto mahalaukun kudoksesta sekvensoitiin käyttäen suuren läpimenon vankka sekvensointitekniikan. Saimme 261274 laatu lukee täydellinen ottelut ihmisen miRnome, ja 42% tunnetuista miRNA tunnistettiin. Digitaalinen Gene Expression profilointi (DG) suoritettiin perustuen luku- määrä ja todettiin, että viisitoista miRNA olivat erittäin ilmaistiin mahalaukun kudosta. Tämän jälkeen ilmaisu näiden miRNA on validoitu 10 terveillä henkilöillä RT-PCR osoitti merkittävää korrelaatiota on 83,97% (P < 0,05). Kuusi miRNA osoitti alhaiset muuttuvat kuvion ilmaisun (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451) ja se voidaan katsoa osaksi ekspressiokuviota terveen mahalaukun kudosta.

Johtopäätökset /merkitys

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli vahvistaa normaalia miRNA profiilit ihmisen mahalaukun kudoksesta perustaa vertailuprofiiliin terveille henkilöille. Määritetään sääntelyprosesseja toimii mahassa on tärkeää torjunnassa mahasyövän, joka on toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa.

Citation: Ribeiro-dos-Santos, Khayat AS, Silva , Alencar DO, Lobato J, Luz L, et ai. (2010) Ultra-Deep Sequencing paljastaa microRNA ekspressiokuviota ihmisen mahalaukussa. PLoS ONE 5 (10): e13205. doi: 10,1371 /journal.pone.0013205

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

vastaanotettu: 30 maaliskuu 2010; Hyväksytty: 08 syyskuu 2010; Julkaistu: 08 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Ribeiro-dos-Santos et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat Genoma Paraense de Genomica e Proteomiikka Project (Governo do Para /SEDECT /FAPESPA), PROPESP /UFPA, FADESP ja CAPES (Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Äskettäin, Friedman et ai.
, 2009 osoitettiin, että suurin osa ihmisen geenit ovat valvonnassa miRNA. Olevaa > 45000 miRNA kohdesivustot sisällä ihmisen 3'UTRs säilytetään, ja > 60% ihmisen proteiinia koodaavan geenien ovat olleet valikoivia paineen ylläpitämiseksi parit jotta miRNA [1]. miRNA ovat pieniä, ei-koodaavat sekvenssit 17-25 bp, jotka säätelevät geenien ilmentymistä sitoutumalla 3'-päähän kohde- mRNA: iden, jolloin esto käännös mRNA: iden [2], [3]. Noin 14000 miRNA on tunnistettu eläimiä, kasveja ja sieniä [4], [5], [6].

mekanismit, joissa miRNA negatiivisena sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen ovat samanlaisia ​​eläinten ja kasvien; ne säätelevät perustavanlaatuinen soluprosesseissa [6]. Ihmisillä on noin 3% kaikista geeneistä ennustetaan koodaavan miRNA esiasteita, ja yli > 60%, proteiinia koodaavan geenien voitaisiin säädellä miRNA [1]. MiRNA ovat olennaisia ​​toimintoja monissa solun toiminnoissa, kuten kasvua ja kehitystä, solujen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia. Näin ollen muutokset miRNA ilmentyminen edistää ihmisten sairauksien, kuten syöpien [7], [8].

Muutokset miRNA ilmentymiskuviot on havaittu monissa eri ihmisen syövän, kuten rinta-, paksusuoli-, keuhko-, eturauhasen, leukemia ja mahasyöpä. miRNA ilmaus muutokset johtavat menetykseen tai voitto funktion ja liittyy inhimillisen kasvaimen kautta monipuolinen mekanismien [5].

Täällä esittelemme geneettinen tutkimus miRNA ihmisen mahassa, koska huolimatta tärkeyden elin, pikku geneettiset tiedot ovat saatavilla niiden läsnäolo ja sääntelyä ihmisillä. Tämä työ on ensimmäinen kokonainen miRnome sekvensointi normaalin vatsan kudosta käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi teknologia.

Tulokset

Tässä tutkimuksessa, profiilit saatiin erittäin syvä sekvensointi käyttäen kiinteän alustan ( Life Technologies, CA, USA). Tämä on ensimmäinen tutkimus, käyttää tätä menettelyä kuvaamaan miRnome normaalin mahalaukun kudosta. miRNA eristettiin normaalista mahalaukun cardia limakalvon yhden terveen potilaan. Profiilit validoitiin käyttäen Real Time PCR määrittää ilmaus 15 korkeimmin ilmaistu miRNA toisessa 10 terveillä potilailla.

ULTRA-DEEP sekvensointi

Ultra-syvän sekvensointi tuotti yhteensä 104 miljoonaa raaka lukee ja 5 miljoonaa lukee että mahalaukun cardia miRNA kirjasto. Lisäanalyysiä, 3,2 miljoonaa lukee valittiin mukaan järjestyksessä laatu (ainakin QV≥10 että 10 ensimmäisen emästä) [8]. Kartoituksen jälkeen nämä ihmisen genomiin (release 19), koko kartoitettuja lukea määrä oli 2.534.490 miljoonaa lukee (75% koko laadun lukee). Noin 38% 2,5 miljoonaa lukee (963460 lukee) on toistuvia DNA-sekvenssejä, tRNA, rRNA tai muita pieniä molekyylejä; 10% (261274) hyväksyttiin lukee, täydellisesti linjassa tunnettujen kypsä miRNA (MirBase versio 15, vapauttamaan 04/2010) [9]; ja loput lukee (52%) on sovitettu geeniperimän (kuva 1).

ilmaus analyysi miRNA, lukee vain tulitikuilla kypsyä miRNA sekvenssit (261274 lukee) otettiin mukaan. Mahalaukun cardia tunnistimme 404 970 tunnetaan kypsä miRNA-sekvenssit (42%). Analysoida ilmentymisen miRNA, määrittelimme viisi vaihtelee: 1 ja 10 luku laskee; 11-100; 101 1000; 1001 ja 5000; ja lukea lasken yli 5000 (kuvio 2) (lisätietoja on esitetty taulukossa S1). Ensimmäinen alue (1-10) kuului 40%: n miRNA havaittu; toinen alue (11-100) käsitti 26%; Kolmannen alue (101 1000) käsitti 20%; ja neljännen ja viidennen alueet (> 1000 luku- määrä) käsitti 14%.

Tämän luokittelun, 347 kypsä miRNA ilmaistiin ensimmäisen ja kolmannen valikoimia ja 57 välillä neljännen ja viidennen vaihtelee. Sillä luonnehdinta miRnome, valitsimme joukon 15 miRNA jotka ilmaistu korkeimmalla tasolla (≥1,000 lukee).

taulukko 1 ja kuva 3 luetellaan 15 kypsä miRNA tunnistettu ihmisen mahalaukun cardia . Heatmap Kuvion 4 on koottu ilmentymistä näiden 15 miRNA mahalaukun cardia ja yli normaalin ihmisen kudoksia, DGE tietoja, saatavilla microRNA.org tietopankkiin [10], [11]. Aikuinen miRNA ilme voitiin jakaa kahteen ryhmään: i) cardia-kudokset: miRNA harvoin ilmaista muissa kudoksissa, mutta ilmaistu mahalaukun cardia, kuten miR-148a, miR-192, miR-200a ja miR-200B; ii) lähes kaikkialla: miRNA ilmaistu monissa kudoksissa ja edellytykset, mukaan lukien miR-29c, miR-21, miR-24, miR-29b, miR-29a, miR-451, miR-31, miR-145, miR-26a , miR-19b ja anna-7b.

reaaliaikaista PCR

erittäin syvä sekvensoinnin tulokset validoitu käyttäen singleplex Real Time PCR (RT-PCR) -menetelmää 15 miRNA valittu määrittää niiden ilmentyminen mahalaukun cardia alue 10 terveitä yksilöitä. Koehenkilöiden, 60% oli miehiä, keski-ikä oli 39,1 (± 12,8) vuotta ja 50% tutkituista aiheista positiivisiksi H. pylori
, että kansainvälisten perusteiden niiden tunnistamiseksi [12], [13] (taulukko 2) (lisätietoja on esitetty taulukossa S2).

COMPARARISON WITH DGE JA RT-PCR

sekä singleplex (RT-PCR) ja multiplex (Solid platform) teknologiat osoittivat korkeaa lauseke (lauseke yli 1000 lukee DGE ja 7-kertaisesti yli endogeenisen säädin RT-PCR) 15 miRNA (kuviot 4 ja 5).

sama RNA-näytteet oli analysoitu kahdella eri alustoilla: DGE ja RT-PCR - Life Technologies. Tuloksia kokeista verrattiin ja havaittiin välisen regressioanalyysin 2 ^{-ΔCt ja neliöjuuren lukea count numero. Pearsonin korrelaatio on korkea 83,9% tilastollisin merkittävä testi (P ​​< 0,05) ja validoitu pysyviä tuloksia.}

Lisäksi DGE tuloksia verrattiin kvantifiointia ilmaisun eri miRNA 10 terveillä koehenkilöillä, Real Time PCR. Regression keskimääräisen RT-PCR määritykset versus
neliöjuuren lukea count numero. Pearsonin korrelaatio on korkea 68,4% tilastollisin merkittävä testi (P ​​< 0,05).

Voisi tarkkailla miRNA korkea yksilöiden välinen vaihtelu, sillä Exempla miR-21, ja toinen pieni yksilöiden välinen vaihtelu, esim. ilmentymiskuvio hieman muuttuja (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451).

Keskustelu

miRNA säädellä useimmissa ihmisen geenien; Kuitenkin vain muutama miRNA ollut tavoitteensa ja erityiset toiminnot tunnistettu [14]. Tutkimuksessamme mahan näyte saatiin yhdestä yksilöstä ilman mahan neoplasia tai muu preneoplasian olosuhteet kuten atrofiaa, metaplasiaa tai dysplasia. Syövän esiasteista kuten gastriitti lukemiin genomista hypo-metylaatio vatsassa jotka voivat muuttaa ekspressiokuviota miRNA [15]. Näyte saatiin normaalista kudoksesta peräisin potilaasta ilman patologioiden, mikä auttoi välttämään riskin kerätä näennäisesti normaalin kudoksen näyte mikro-valloitusten varhaisen vaiheen tuumorigeenisiä soluja voi esiintyä potilailla, joilla on jokin edellä sairauksista.

Tämä tutkimus on ensimmäinen ultra-high-throughput sekvensointi miRNA fysiologisesti normaalin ihmisen mahassa. Vain 5,06%: miRNA tunnistettu mahan kudoksessa oli jo havaittu muissa kudoksissa ja luetteloitu bioinformatiikan tietopankeissa kuten microRNA.org [10]. Odotamme tämän ryhmän miRNA olevan sääntelyviranomaiset taloudenhoito geenejä, jotka ovat runsaasti ihmisen kudoksissa. Toinen 7,84% of miRNA ollut otteluiden miRNA ilmaisun tietokantojen ja voisivat edustaa miRNA jotka ovat ominaisia ​​ruoansulatuskanavan tai vatsan.

Samanlaisia ​​tutkimuksia ei ole tehty muita normaaleissa kudoksissa, kuten suun, nielun, ruokatorvi, peräaukon ja suolistossa. Vertasimme tuloksia yhdessä miRNA ilmaisu tietoja määritellä ekspressiokuviota mahalaukun kudosta. Löysimme korkeat ekspressiotasot 15 miRNA, joista 13 oli jo todettu erittäin ilmaista muissa kudoksissa.

ilmentyminen mir-148a ja mir-192 oli havaittu muissa normaaleissa ja syöpä- ihmisen kudoksia, mutta ei yli-ilmentynyt. Mir-192 oli jo havaittu maha-suolikanavan kudokset, kuten paksusuolen, sykkyräsuoli, pohjukaissuoli, ohutsuoli, mahan, haiman ja maksan [16]. Perusilmennystä mir-148a on havaittu sidekudoksen ja hormonaaliset kudosten [17]. Äskettäin mir-148a havaittiin tukahdutettu napanuoran verisolujen [18] ja vaiennetaan hypermetylaation paksusuolen kasvaimissa [19]. Havaitsimme korkea ilmentymisen mir-200 klusteri (a ja b) mahalaukun cardia kuin havaittu Langerhansin saarekkeiden [11]. Vuonna microarray kokeilu, mir-200a ja mir-200B todettiin vähäisinä määrinä ruoansulatuskanavan kudoksissa, mutta korkealla tasolla paksusuolessa, vatsa ja haima [16]. Hiljattain julkaistu microRNA ilmaisu atlas osoitti, että tämä miRNA on ominaista hormonitoimintaa kudokseen [17]. Viimeaikaiset havainnot osoittavat, että alhainen ilmentyminen mir-200 klusterin korreloi munasarjasyöpä [19], [20]. Siksi mir-200 klusteri voi olla tärkeää säilyttää eheys ruoansulatuskanavan kudoksissa, kuten mahalaukun cardia koska tällaisten korkean ilmentymisen sääteli ilmaisua E-kadheriinin proteiini vastuussa järjestämisestä arkkitehtuurin epiteelikudoksen. Lisäksi tulokset viittaavat vahvasti siihen, tärkeä rooli miR-200 perheen tukahduttamisen epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja etenemisen syövän [21].

Taulukko 1 ja 2 esittävät määrä mahdolliset tavoitteet kullekin erittäin ilmaisi kypsä miRNA. Taulukossa 2 on esitetty joitakin tavoitteita miRNA ennusti TargetScan vastaan ​​perheiden konservoituneiden miRNA. Lukuun ottamatta miR-451, kaikki jaetut ainakin kaksi muuta geenikohteet. Geenit ANKD52
ja UBN2
, ovat kohteita kymmenen neljästätoista miRNA analysoidaan, kun taas geeni TNRC6B
on yhdeksän miRNA, ja geenit EPS15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6
, ja PTPRD DD6
, ovat kohteita kahdeksan miRNA. Tämä tulos viittaa siihen, että nämä miRNA ovat vahvoja ehdokkaita vaiennetaan sisään cardia alueella. Kokeellinen validointi näiden geenien, jota seuraa analyysi funktion jokainen voi paljastaa fysiologinen rooli näiden miRNA normaalilta mahan kudoksessa.

Monet miRNA voi säädellä käännöksen proteiineja, jotka toimivat kudoksen proliferaation ja kudos kuviointi kuten mir-200a (joka voi kohdistaa integriini) ja mir-145 (jotka voivat olla vuorovaikutuksessa erbB4
mRNA). Monet ennustettu mRNA tavoitteita havaittiin olevan yhteisiä useille hyvin ilmaisi miRNA. Esimerkiksi HTR4
(5-hydroksitryptamiinin [serotoniini] reseptori) ja AFF2
mRNA: t ( AF4 /FMR2
perhe, osa 2) ennustettiin olevan tavoitteita 13 15 eniten ilmaistaan ​​miRNA. Toinen viisi mRNA: t, mukaan lukien IGF-1
(insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 [somatomediini C]), olivat yleisiä ennusti saavuttivat 12 miRNA. Kahdeksan miRNA oli 222 ennustettu tavoitteet yhteisiä; Esimerkiksi mir-29b ennustettiin kohdistaa 196 näistä. Viisi miRNA (19b, 29a, 29b, 29c ja 148a) yhteinen 70 ennusti tavoitteita, joista osa ( CDK6
, PTEN
, IGF1-
, FRS2
, PDGFRA
, PIK3R1
ja MXD1
) säätelevät solujen lisääntymistä ja tuumorisuppressiogeeneksi.

Useat havainnot viittaavat miRNA syöpään. Ensinnäkin monet miRNA ovat mukana soluproliferaatioon ja apoptoosiin. Toiseksi monet miRNA lokuksen sijaitsevat hauras sivustoja ihmisen genomin, alueita, jotka ovat usein monistetaan tai poistetaan ihmisen neoplasioista ja aiheuttaa suuria eroja miRNA ilmaisu verrattuna normaaleissa kudoksissa [21], [22], [23], [24 ].

Real Time PCR-tekniikkaa (joka käyttää suhteellisen kvantifioinnin) vahvisti 15 miRNA, joissa on havaittu korkeimmalla ilmentymisen kiinteän alustan (joka perustuu absoluuttiset luvut) (kuvat 4 ja 5). Näin ollen, nämä miRNA voidaan katsoa olevan yli-ilmentynyt [25], [26], [27], [28]. Korrelaatio DGE ja RT-PCR-määrityksissä oli selkeä ja tilastotieto merkittävä. Ja DGE koe voitiin pitää edustavana kudosten mahalaukun näytteistä eristettiin 10 terveyden aiheita ja määrittää osa ekspressiokuviota terveen mahalaukun kudosta.

tulokset molemmista menetelmistä mukaan miRNA-21 oli pisimmälle ilmaisivat mahalaukun cardia kudoksessa. Tämä miRNA jaetaan myös muissa ihmisen kudoksissa (esim dendriittisoluja, T-solut, haima) ja voisi olla mukana ekspressiota sääteleviä taloudenhoito geenien ( ATPAF1
, KIF3A
, CYBRD1
).

Kiinteä alusta osoitti, että miR-192 ja 148a ovat ominaisia ​​mahalaukun kudosta. Lisäksi, Real Time PCR vahvisti, että nämä miRNA on yli-ilmentynyt. Näin ollen, yleisesti, nämä miRNA todennäköisesti säädellä geenien ilmentymistä, jotka liittyvät mahan kudoksessa homeostaasin. Näin ollen alhainen ekspressiotasot näissä miRNA voisi liittyä kehittämiseen vatsa neoplasia. Mahdollinen käyttö miRNA-192 ja miRNA-148a riskin markkereita mahasyövän voitaisiin parhaiten tutkittu kautta analyysin miRnomes eri histologisia tyyppejä mahasyövän.

Ymmärtäminen sääntelyprosesseja jotka toimivat ihmisen vatsa on tärkeää torjunnassa mahasyövän, joka on toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa.

Materiaalit ja menetelmät

biologista materiaalia

mahalaukun cardia on mikroskooppisen vyöhyke, joka löytyy yleensä läheisin osa vatsan lähellä ruokatorven aukon (sydämen aukon tai cardia) ja sisältää sydämen rauhaset. Meidän tuore kudosnäytteestä ultra syvää sekvensointi saatu gastroskopisten koepala (~ 4 mm ^{3). Potilas oli 33-vuotias, ei ollut näyttöä syövän ja normaali gastroesofageaalinen risteykseen. Makroskooppinen havainto kudoksen ei esiintynyt vaurioita, ja histologinen tutkimus vahvisti normaalia ja tervettä olosuhteissa.}

Vahvista tulokset ultra-syvä sekvensointi, cardia näytteitä, lähellä sydämen aukko, 10 lisäksi terveet yksilöt olivat myös saatu endoskooppinen koepaloja (~ 4 mm ^{3) ja, sen jälkeen kun histologiseen tutkimukseen ilman poikkeavuuksia, analysoitiin Real Time PCR. H. pylori
infektion toteamisen perusteella tyypillinen ulkonäkö bakteerin pitkin limaa peittävä mahan limakalvojen Antral koepaloja otettiin histologiaa varten arviointia, koska suurempi tiheys bakteerien mahalaukkua ja erinomainen herkkyys tämän diagnostisen menetelmän , mukaan kansainväliset perusteisiin niiden tunnistamiseksi [12], [13] (lisätietoja on esitetty taulukossa S2).}

ETHICS SELVITYS

Kirjallinen suostumus saatiin kaikista potilaista, ja tutkimuksen hyväksyi Comité de etica em Pesquisa (CEP) sairaalan Universitário João Barros Barreto (HUJBB) - Federal University of Pará (UFPA) (Protocol numero 14052004 /HUJBB).

miRNA LIBRARY

koko pieni RNA saatiin näytteestä kudoksesta käyttäen Mirvana Isolation Kit (Ambion Inc., USA). Pitoisuus ja laatu määritettiin käyttämällä Nanodrop 1000 spektrofotometrillä, ja puhdistus ja koon valinta suoritettiin käyttäen 6% polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Käyttämällä kiinteillä pienillä RNA Expression Kit (Ambion Inc., USA), 200 ng pieniä RNA: 150-200 bp käytettiin templaattina saamiseksi miRNA-kirjasto. Kaikki miRNA kirjaston merkittiin ainutlaatuisia ja erityisiä monistusalukkeita, joka tunnetaan nimellä viivakoodin järjestelmän (Life Technologies, CA, USA). Sitten, 50 s kirjaston yhdistettiin seitsemän muun miRNA kirjastoja samana pitoisuutena. Pieni osa kirjaston allas (0,1 s) monistettiin ja vahvistettu magneettisten helmien avulla emulsio PCR. EPCR: n tuote sijoitettiin yhteen dian ja alistettiin multiplex Solid sekvenssointireaktiota.

Kiinteä ULTRA-DEEP sekvensointi ja Data Analysis

Kiinteä (versio 2.0) sekvensointijärjestelmällä (Life Technologies) käytettiin synnyttämään lukee, jotka olivat 35 emäsparia pitkiä. Toinen vaihe oli dekoodaamaan viivakoodi, vastaavista helmi sekvenssin identiteetin näytteen. Kaikki pienet RNA-sekvenssit mahalaukun cardia ovat saatavilla NCBI Jaksot Lue Archive (SRA012099). Sekvenssianalyysi suoritettiin käyttäen Solid System Small RNA Analysis Tool (Life Technologies) ja MiRanalyzer [8]. Ensin suodatettu pois kaikki sekvenssit, jotka täsmäsi RNA epäpuhtauksia, kuten tRNA, rRNA, DNA toistot ja sovitin molekyylejä. Kun jätetään epäpuhtauksien lukee, me kohdistettu kaikki sekvenssit vastaan ​​miRNA prekursorisekvenssejä (MirBase ver. 12) ja sitten vain sisältyi lukee jotka täsmäsi kypsä miRNA sekvenssit [9]. Vertailua ilmentymisen tietoja muiden ihmiskudosten miRNA ekspressiotietojen tuotiin microRNA.org tietokannasta, ja jokaisen näistä kypsä miRNA normalisoitiin yhteensä luku- määrä [10]. Graafinen analyysi suoritettiin käyttäen Genepattern ^{10. Mirna-biologisen prosessin suhteita ennustettiin käyttämällä miRNApath (http://lgmb.fmrp.usp.br/mirnapath/tools.php).}

miRNA reaaliaikaista PCR (VALIDATION) B

Biopsia näytteitä mahalaukun cardia kudokset kerättiin 10 potilaisiin. Keräämisen jälkeen, näytteet prosessoitiin välittömästi ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Kokonais-RNA uutettiin homogenisoimalla 40 mg jäädytettyä kudosta, jonka jälkeen RNA: n eristämistä TRIzol-reagenssia (Life Technologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pitoisuus ja laatu miRNA määritettiin käyttäen Nanodrop 1000 spektrofotometriä (ND-1000, Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). Kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttäen TaqMan @ MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies).

analyysi miRNA tasojen suoritettiin 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies) ja TaqMan miRNA määrityksissä mukaan valmistajan ohjeiden (Life Technologies) käyttämällä alukkeita suunniteltu Primer Express (Life Technologies). Keskimääräinen ekspressiotaso kolmen ihmisen endogeenisen valvonta (Z30, RNU19 ja RNU6B - kalibraattorit) käytettiin sisäisenä kontrollina kaikissa miRNA kokeiden mahdollistamiseksi vertailun ilmaisun tuloksia.

korkeat ekspressiotasot miRNA tunnistettu ultra-syvä sekvensointi (alenevassa järjestyksessä: miR-29c, miR-21, miR-148a, miR-29a, miR-24, miR-29b, miR-192, miR-451, miR-145, miR-31, miR-200a miR-19b, miR-200b, anna-7b ja miR-26a) on validoitu kanssa TaqMan miRNA määritykset (Life Technologies). Nämä analyysit käytettiin mittaamaan ekspressiotasoja kypsä miRNA ja yksilöiden välisiä vaihtelua 10 näytettä terveen cardia kudosta. Ilmaisua tiedot kunkin kypsä miRNA normalisoitiin keskimääräiseen ilmentymisen tasoa kolmen ihmisen endogeenisen kontrolleihin (Z30, RNU19 ja RNU6B). Suhteellinen miRNA ekspressiotasoja Sitten laskettiin vertaileva kynnyksen (Ct) menetelmä (2 ^{-ΔCt). Korrelaatio testi suoritettiin käyttäen Pearsonin menetelmää (SPSS V.12).}

tukeminen Information
Taulukko S1.
Identiteetti ja runsautta tiedot kaikista tunnettujen miRNA kiinteässä järjestyksessä aineisto ihmisen vatsassa ja miRamda tietokantaan.
doi: 10,1371 /journal.pone.0013205.s001
(0,44 MB PDF) B Taulukko S2.
Kuvaus ja RT-PCR-tuloksiin 10 näytettä terveiltä yksilöiltä saatua endoskooppinen koepaloja. Näytteitä koko on noin ~ 4 mm3. Kaikkien näytteiden tehtiin histologinen tutkimus ja helikobakteeri havaitsemiseen.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0013205.s002
(0,03 MB XLS) B

Kiitokset

kirjoittajat kiitos D. Calcagno ja S. Demaschki heidän kommenteistaan, ideoita ja auttaa.

• PLoS ONE: Tapa miehen sydän on vatsan kautta: Entä hevoset?
• PLoS ONE: Impact of Energy Drink rakenteesta Vatsa ja haima Albino Rat: Can Omega-3 Antaa Protection?