PLOS ONE: Sequencing Ultra-Profundo revela o padrão de microRNA expressão do Estômago humano

Abstract

Fundo

Enquanto microRNAs (miRNAs) desempenham papéis importantes na diferenciação dos tecidos e na manutenção da fisiologia basal, pouco se sabe sobre os níveis de expressão de miRNA no tecido do estômago. Alterações no perfil de miRNA pode dar origem a desregulamentação das células, o que pode induzir neoplasia.

Metodologia /Principais Achados

Uma pequena biblioteca RNA de tecido do estômago foi sequenciado usando high-throughput seqüenciamento tecnologia sólida. Obtivemos 261,274 qualidade lê com partidas perfeitas ao miRnome humana, e foram identificados 42% dos miRNAs conhecidos. Gene Digital perfil de expressão (DGE) foi realizada com base na abundância de leitura e mostrou que quinze miRNAs foram altamente expresso no tecido gástrico. Subsequentemente, a expressão destes miARNs foi validada em 10 indivíduos saudáveis ​​por meio de RT-PCR mostrou uma correlação significativa de 83,97% (P < 0,05). Seis miRNAs mostrou um padrão variável baixo de expressão (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451) e poderia ser considerado parte do padrão do tecido gástrico saudável expressão.

Conclusões /Significado

Este estudo teve por objetivo validar perfis normais de miRNA de tecido gástrico humano para estabelecer um perfil de referência para indivíduos saudáveis. Determinar os processos de regulação que actuam no estômago será importante na luta contra o câncer gástrico, que é a segunda principal causa de mortalidade por câncer no mundo

Citation:. Ribeiro-dos-Santos Â, Khayat AS, Silva A , Alencar DO, Lobato J, Luz L, et al. (2010) Sequencing Ultra-Profundo revela o padrão de microRNA expressão do estômago humano. PLoS ONE 5 (10): e13205. doi: 10.1371 /journal.pone.0013205

editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapura

Recebido: 30 de março de 2010; Aceito: 08 de setembro de 2010; Publicação: 08 de outubro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Ribeiro-dos-Santos et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado pelo Paraense de Genomica e proteómica Projeto Genoma (Governo do Pará /SEDECT /FAPESPA), PROPESP /UFPA, FADESP e CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentemente, Friedman et ai.
, 2009 demonstraram que a maioria dos genes humanos estão sob o controlo de miARN. O > 45.000 sítios miARN alvo dentro 3'UTRs humanos são conservados, e > 60% dos genes humanos codificadores de proteínas têm estado sob pressão selectiva para manter a emparelhamentos miARNs [1]. miARNs são sequências pequena, não codificantes de 17-25 pb que regulam a expressão do gene através da ligação à extremidade 3 'do ARNm-alvo, resultando na inibição da tradução do ARNm [2], [3]. Aproximadamente 14000 miARNs foram identificados em animais, plantas e fungos [4], [5], [6]

mecanismos que envolvem miARNs como reguladores negativos da expressão do gene são semelhantes em animais e plantas.; eles regulam processos celulares fundamentais [6]. Em seres humanos, cerca de 3% de todos os genes estão previstos para codificar miARN precursores, e mais de > 60% de genes codificadores de proteínas pode ser regulada por miARNs [1]. MiRNAs têm funções essenciais em muitos processos celulares, tais como crescimento e desenvolvimento, a proliferação celular, a diferenciação e a apoptose. Por conseguinte, as alterações na expressão de miARN contribuir para doenças humanas, tais como cancros [7], [8].

Alterações no padrão de expressão de miARN têm sido observados em muitos tipos de cancro humano, tais como cancro da mama, cólon, pulmão, próstata, leucemia e do estômago. Alterações de expressão miRNA levar a uma perda ou ganho de função e estão associados com o desenvolvimento de neoplasia humana através de diversos mecanismos [5].

Aqui, apresentamos um estudo genético do miRNA do estômago humano, porque, apesar de a importância do órgão, poucos dados genéticos estão disponíveis em sua presença e regulação em humanos. Este trabalho é o primeiro sequenciamento completo miRnome de tecido do estômago normal, utilizando tecnologia de sequenciamento de próxima geração.

Resultados

No presente estudo, os perfis foram obtidos por sequenciação ultra-profundas usando a plataforma sólida ( Life Technologies, CA, EUA). Este é o primeiro estudo a usar este procedimento para descrever o miRnome de tecido gástrico normal. miARNs foram isolados a partir de mucosa normal cárdia de um único paciente saudável. Os perfis foram validados utilizando PCR em tempo real para determinar a expressão dos miRNAs 15 mais bem expressos em outros 10 pacientes saudáveis.

ultra-profundas SEQÜENCIAMENTO

ultra-profundas seqüenciamento rendeu um total de 104 milhões de cru lê e 5 milhões lê para a biblioteca miRNA cárdia gástrica. Para uma análise mais aprofundada, de 3,2 milhões de leituras foram selecionados de acordo com a qualidade sequência de (pelo menos QV≥10 nas 10 primeiras bases) [8]. contagem Após o mapeamento destes para o genoma humano (versão 19), o total mapeada li foi 2.534.490 milhões lê (75% do total qualidade lê). Cerca de 38% dos 2,5 milhões de lê (963.460 leituras) foram sequências de DNA repetitivas, tRNA, rRNA ou outras moléculas pequenas; 10% (261.274) foram aceites lê, perfeitamente alinhado com miRNAs maduros conhecidos (miRBase versão 15, solte 04/2010) [9]; eo resto das leituras (52%) foram pareados com genoma sequências (Figura 1).

Para a análise dos miRNAs expressão, só lê com fósforos para amadurecer sequências miRNAs (261.274 leituras) foram incluídos. No cárdia, identificamos 404 de 970 sequências madura miRNA conhecidos (42%). Para analisar a expressão dos miRNAs, definimos cinco faixas: 1 a 10 contagens de leitura; 11-100; 101 a 1000; 1001 a 5000; e uma contagem de ler ao longo 5000 (Figura 2) (pormenores adicionais são fornecidos na Tabela S1). O primeiro intervalo (1-10) composta de 40% das observadas miARNs; o segundo intervalo (11 a 100) composta de 26%; a terceira faixa (101 a 1.000) composta de 20%; e os quarto e quinto faixas (> 1000 Quantidade leitura) composta de 14%

Com esta classificação, 347 miRNAs maduros foram expressos entre as primeira e terceira faixas e 57 entre as quarta e quinta intervalos.. Para a caracterização do miRnome, selecionamos um conjunto de 15 miRNAs que foram expressas nos níveis mais altos (≥1,000 lê).

Tabela 1 e Figura 3 lista as 15 miRNAs maduros identificados nos cárdia gástrico humano . O mapa de calor da Figura 4 resume a expressão destes 15 miARNs na cárdia e em tecidos humanos normais, os dados de DGE, disponível na base de dados microRNA.org [10], [11]. expressão miARN maduro podia ser classificada em dois grupos: I) cárdia-tecidos: miARNs raramente expressa em outros tecidos, mas expresso em cárdia, incluindo o miR-148a, de miR-192, miR-200a e miR-200B; ii) quase onipresente: miRNAs expressos em muitos tecidos e condições, incluindo miR-29c, miR-21, miR-24, miR-29b, miR-29a, miR-451, miR-31, miR-145, miR-26a , miR-19b e deixe-7b.

PCR em tempo real

os resultados de sequenciamento ultra-profundas foram validados utilizando o método nos 15 miRNAs selecionados para singleplex PCR em tempo real (RT-PCR) determinar a sua expressão na região cárdia gástrica a partir de 10 indivíduos saudáveis. Dos sujeitos de teste, 60% eram do sexo masculino, com idade média de 39,1 (± 12,8) anos e 50% dos indivíduos estudados testou positivo para H. pylori
, de acordo com critérios internacionais estabelecidos para a sua identificação [12], [13] (Tabela 2) (mais detalhes são fornecidos na Tabela S2).

COMPARARISON COM DGE e RT-PCR

ambas as tecnologias simplex (RT-PCR) e multiplex (plataforma sólida) apresentaram expressão elevada (expressão sobre 1000 lê no GDE e 7 vezes acima do controlo endógena na RT-PCR) de 15 miARNs (Figuras 4 e 5)

As mesmas amostras de RNA foram analisados ​​por duas plataformas diferentes: DGE e RT-PCR - Life Technologies.. Os experimentos resultados foram comparados e não foram observadas regressão linear entre 2 ^{-ΔCt e raiz quadrada do número de contagem de ler. de correlação de Pearson é elevado 83,9% com o teste estatisticamente significativa (P < 0,05). e validado resultados sólidos}

Além disso, os resultados de GDE foram comparados com a quantificação da gama dos miARNs em 10 indivíduos saudáveis ​​expressão, por Real Time PCR. A regressão para média de ensaios de RT-PCR contra
raiz quadrada do número de contagem de ler. correlação de Pearson é de alta de 68,4% com o teste de significância estatística (P < 0,05).

Pode observar miRNAs com alta variação interindividual, por exempla miR-21, e outro com baixa variação interindividual, por exemplo, padrão de expressão ligeiramente variável (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451).

Discussão

miRNAs regulam a maioria dos genes humanos; no entanto, apenas alguns miRNAs têm tido os seus objectivos e funções específicas identificadas [14]. Em nosso estudo, a amostra do estômago foi obtida a partir de um único indivíduo, sem neoplasia de estômago ou outras condições pré-neoplásicas, tais como atrofia, metaplasia ou displasia. lesões pré-cancerosas, tais como a gastrite chumbo para genómico hipo-metilação no estômago que pode modificar o padrão de miARNs [15] expressão. A amostra foi obtida a partir do tecido normal a partir de um paciente, sem quaisquer patologias, o que ajudou a evitar o risco de recolha de uma amostra aparentemente normal tecido com micro-invasões de células tumorigénicas-fase inicial, como pode ocorrer em doentes com qualquer uma das patologias acima referidas.

Este estudo é o primeiro sequenciamento de ultra-alto rendimento de miRNAs no estômago humano fisiologicamente normal. Apenas 5,06% do miARNs identificados no tecido gástrico já tinha sido detectada em outros tecidos e catalogado em bancos de dados de bioinformática, tais como microRNA.org [10]. Esperamos que este grupo de miRNAs ser reguladores dos genes de limpeza, que são abundantes em tecidos humanos. Outro 7.84% dos miRNAs não tinha partidas nos bancos de dados de expressão de miRNA e poderia representar miRNAs que são específicos para o sistema digestivo ou no estômago.

Estudos semelhantes foram realizados com outros tecidos normais, tais como a boca, faringe, esôfago, ânus e intestino. Nós comparamos estes dados com os dados de expressão de miARN para definir o padrão de expressão do tecido do estômago. Encontrámos níveis elevados de expressão em 15 miARNs, 13 dos quais já tinham sido identificadas como altamente expresso em outros tecidos.

A expressão de miR-148a e miR-192 foram identificadas em outros tecidos humanos normais e cancerosos, mas não foi sobre-expresso. MiR-192 já tinha sido detectada em tecidos gastrointestinais, tais como o cólon, íleo, duodeno, intestino delgado, estômago, pâncreas e fígado [16]. expressão basal de miR-148a tem sido observada em tecido conjuntivo e do tecido endócrino [17]. Recentemente, mir-148a foi encontrado para ser reprimida nas células do sangue do cordão umbilical [18] e silenciado por hipermetilação em tumores de cólon [19]. Observou-se uma expressão elevada do cluster miR-200 (a e b) no cárdia como observado nos ilhéus de Langerhans [11]. Numa experiência de microarray, miR-200a e miR-200b foram detectados em níveis baixos em tecidos gastrointestinais mas em níveis elevados no cólon, estômago e pâncreas [16]. A recentemente publicados Atlas expressão microRNA mostrou que este miARN é característica do tecido endócrino [17]. Dados recentes revelam que a baixa expressão do cluster do miR-200 está correlacionada com o cancro do ovário [19], [20]. Portanto, o agrupamento de miR-200 pode ser importante na manutenção da integridade dos tecidos digestivos, tais como cárdia porque tal expressão elevada sobre-regulada a expressão de E-caderina, a proteína responsável pela organização da arquitectura do tecido epitelial. Além disso, os resultados sugerem fortemente um papel importante da família de miR-200 na repressão do epitelial-mesenquimal transição (EMT) e a progressão do cancro [21].

Tabela 1 e 2 mostram o número de possíveis alvos para cada altamente expresso madura miRNA. A Tabela 2 mostra alguns alvos de miRNAs preditos pela TargetScan contra famílias de miRNAs conservados. Com a excepção de miR-451, todos partilhada, pelo menos, dois outros genes alvos. Os genes ANKD52
e UBN2
, são alvos de dez dos quatorze miRNAs analisados, enquanto o gene TNRC6B
é de nove miRNAs, e os genes EPS15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6
e PTPRD DD6
, são alvos de oito miRNA. Este resultado sugere que estes miARNs são fortes candidatos a ser silenciados na região cárdia. A validação experimental destes genes, seguido por uma análise da função de cada um pode revelar o papel fisiológico destas miARNs em tecido gástrico normal.

Muitos miARNs podem regular a tradução de proteínas que actuam em tecidos e proliferação padronização de tecidos tais como mir-200a (que pode ter como alvo integrina) e mir-145 (que podem interagir com o ErbB4
mRNA). Muitos alvos de mRNA previstos foram encontrados para ser comum a vários miRNAs altamente expressos. Por exemplo, o (receptor 5-hidroxitriptamina [serotonina]) HTR4
e AFF2
mRNAs ( AF4 /FMR2
família, membro 2) foram previstos para ser alvos de 13 dos 15 miRNAs mais altamente expressos. Outros cinco ARNm, incluindo IGF-1

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