PLoS ONE: Ultra-Deep Sekvense Avslører mikroRNA Expression Pattern of Human Stomach

Abstract

Bakgrunn

Mens microRNAs (mirnas) spiller viktige roller i vev differensiering og i å opprettholde basal fysiologi, lite er kjent om miRNA uttrykk nivåer i magen vev. Endringer i miRNA-profil kan føre til celle deregulering, som kan forårsake neoplasi.

metodikk /hovedfunnene

Et lite RNA bibliotek av magen vev ble sekvensert ved hjelp av high-throughput solid sekvenseringsteknologi. Vi har fått 261 274 kvalitet leser med perfekt treff på menneskelig miRnome, og 42% av kjente miRNAs ble identifisert. Digital Gene Expression profilering (DGE) ble utført basert på lese overflod og viste at femten mirnas ble sterkt uttrykt i mage vev. Deretter ble ekspresjonen av disse mirnas validert i 10 friske individer ved RT-PCR viste en signifikant korrelasjon på 83,97% (P 0,05). Seks mirnas viste lav varierende mønster av uttrykket (MIR-29b, MIR-29C, MIR-19b, MIR-31, MIR-148a, MIR-451) og kan anses som en del av uttrykket mønster av sunn mage vev.

Konklusjon /Betydning

Denne studien hadde som mål å validere normale miRNA profiler av menneskelig gastrisk vev for å etablere en referanseprofil for friske individer. Bestemme regulatoriske prosesser som virker i magen vil være viktig i kampen mot magekreft, som er den nest største årsaken til kreftdødelighet i verden

Citation. Ribeiro-dos-Santos, Khayat AS, Silva A , Alencar DO, Lobato J, Luz L, et al. (2010) Ultra-Deep Sekvense Avslører mikroRNA Expression Pattern of Human mage. PLoS ONE 5 (10): e13205. doi: 10,1371 /journal.pone.0013205

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

mottatt: 30 mars 2010; Godkjent: 08.09.2010; Publisert: 08.10.2010

Copyright: © 2010 Ribeiro-dos-Santos et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Arbeidet ble støttet av Genoma Paraense de Genomica e proteomikk Project (Governo do Para /SEDECT /FAPESPA), PROPESP /UFPA, FADESP og CAPES (Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Nylig Friedman et al.
2009 viste at flertallet av menneskelige gener er under kontroll av miRNAs. Det > 45.000 miRNA målwebområder innenfor menneske 3'UTRs er bevart, og > 60% av de menneskelige proteinkodende gener har vært under seleksjonspress for å opprettholde motstandere til mirnas [1]. mirnas er små, ikke-kodende sekvenser av 17-25 bp som regulerer genekspresjon ved å binde seg til 3'-enden av mål-mRNA, noe som resulterer i hemming av translasjon av det mRNA [2], [3]. Omtrent 14 000 mirnas har blitt identifisert i dyr, planter og sopp [4], [5], [6]

Mekanismer som involverer mirnas som negative regulatorer av genuttrykk er lik hos dyr og planter.; de regulerer grunnleggende cellulære prosesser [6]. Hos mennesker er omtrent 3% av alle gener forutsagt å kode for miRNA forløpere, og i løpet av > 60% av protein-kodende gener kan reguleres ved mirnas [1]. Mirnas har viktige funksjoner i mange cellulære prosesser som vekst og utvikling, cellulær proliferasjon, differensiering og apoptose. Følgelig, endringer i miRNA uttrykket bidra til menneskelige sykdommer som kreft [7], [8].

Endringer i miRNA uttrykk mønstre har blitt observert i mange typer kreft hos mennesker, som brystkreft, tykktarm, lunge, prostata, leukemi og magekreft. miRNA uttrykk endringer føre til tap eller gevinst på funksjon og er forbundet med utviklingen av menneskets svulst via ulike mekanismer [5].

Her presenterer vi en genetisk studie av miRNA av den menneskelige mage, fordi til tross betydningen av orgelet, små genetiske data er tilgjengelige på deres tilstedeværelse og regulering hos mennesker. Dette arbeidet er det første hele miRnome sekvensering av normal mage vev ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsteknologi.

Resultater

I denne studien ble profiler innhentet av ultra-dypt sekvensering ved hjelp av solid plattform ( livet Technologies, CA, USA). Dette er den første studien som bruker denne fremgangsmåten for å beskrive miRnome av normal mage vev. mirnas ble isolert fra normal gastrisk mucosa cardia av en enkelt frisk pasient. Profilene ble validert ved hjelp av Real Time PCR for å bestemme uttrykket av de 15 mest uttrykt mirnas i ytterligere 10 friske pasienter.

ultradypt sekvense

Ultra-dyp-sekvensering ga totalt 104 millioner rå leser og 5.000.000 leser for mage Cardia miRNA bibliotek. For ytterligere analyse, leser 3,2 millioner ble valgt i henhold til sekvensen kvalitet (minst QV≥10 i de første 10 baser) [8]. Etter kartlegging disse til det menneskelige genom (slipp 19), kartlagt det totale lese telling var 2.534.490 millioner leser (75% av total kvalitet leser). Omtrent 38% av 2,5 millioner leser (963460 lesninger) ble repeterende DNA-sekvenser, tRNA, rRNA eller andre små molekyler; 10% (261 274) ble akseptert leser, helt i tråd med kjente modne mirnas (MirBase versjon 15, slipp 04/2010) [9]; og resten av leser (52%) ble matchet til genomsekvenser (figur 1).

For uttrykket analyse av miRNAs, bare leser med kamper for å modne mirnas sekvenser (261274 lesninger) ble inkludert. I mage Cardia, identifiserte vi 404 av 970 kjente moden miRNA sekvenser (42%). Å analysere uttrykk for miRNAs, vi definert fem områder: 1 til 10 lese teller; 11-100; 101 til 1000; 1001 til 5000; og en lese telling på over 5000 (figur 2) (ytterligere detaljer er gitt i tabell S1). Den første serien (1-10) omfattet 40% av de observerte miRNAs; det andre område (11 til 100) omfattet 26%; den tredje serien (101 til 1000) omfattet 20%; og den fjerde og femte områder (> 1000 lese count) utgjorde 14%

Med denne klassifiseringen, 347 modne miRNAs ble uttrykt mellom første og tredje kjeder og 57 mellom fjerde og femte serier.. For karakterisering av miRnome, valgte vi et sett av de 15 mirnas som ble uttrykt på høyeste nivå (≥1,000 leser).

Tabell 1 og Figur 3 liste de 15 modne mirnas identifisert i den menneskelige mage Cardia . Heatmap av Figur 4 oppsummerer uttrykket av disse 15 miRNAs i mage Cardia og på tvers av normale menneskelige vev, DGE data, tilgjengelig i microRNA.org databank [10], [11]. Moden miRNA uttrykket kan deles inn i to grupper: i) Cardia-vev: mirnas sjelden til uttrykk i andre vev, men uttrykt i mage Cardia, inkludert MIR-148a, MIR-192, MIR-200A og MIR-200b; ii) kvasi-allestedsnærværende: mirnas uttrykt i mange vev og betingelser, inkludert MIR-29C, MIR-21, MIR-24, MIR-29b, MIR-29a, MIR-451, MIR-31, MIR-145, MIR-26a , MIR-19b og la-7b.

real Time PCR

de ultra-dypt sekvense resultater ble validert ved hjelp av singleplex real Time PCR (RT-PCR) metoden på de 15 mirnas valgt å bestemme deres uttrykk i mage Cardia regionen fra 10 friske individer. Av forsøkspersonene, 60% var menn, gjennomsnittsalderen var 39,1 (± 12,8) år og 50% av de undersøkte fagene testet positivt for H. pylori
, i henhold til internasjonale kriterier fastsatt for deres identifikasjon [12], [13] (tabell 2) (ytterligere detaljer er gitt i tabell S2).

COMPARARISON MED DGE OG RT-PCR

Både singleplex (RT-PCR) og multiplex (solid plattform) teknologi viste høy uttrykk (uttrykk over 1000 leser i DGE og syv ganger over den endogene kontroll i RT-PCR) av de 15 mirnas (figur 4 og 5)

De samme RNA prøver hadde blitt analysert ved to forskjellige plattformer: DGE og RT-PCR - Life Technologies.. Resultatene eksperimenter ble sammenlignet og ble observert lineær regresjon mellom to ^{-ΔCt og kvadratroten av lese teller antall. Pearson korrelasjon er høy 83,9% med statistisk signifikant test (P < 0,05). Og validert solide resultater}

I tillegg ble DGE resultater sammenlignet med kvantifisering av uttrykket utvalg av miRNAs i 10 friske personer, av Real Time PCR. Den regresjon for gjennomsnittet av RT-PCR-analyser versus
kvadratroten av lese teller antall. Pearson korrelasjon er høy 68,4% med statistisk signifikant test (P < 0,05).

Kan observere mirnas med høy interindividuell variasjon, for exempla MIR-21, og en annen med lav interindividuell variasjon, f.eks uttrykk mønster litt variabel (MIR-29b, MIR-29C, MIR-19b, MIR-31, MIR-148a, MIR-451).

Diskusjoner

mirnas regulere de fleste menneskelige gener; imidlertid, er bare noen få mirnas hadde sine mål og spesifikke funksjoner identifisert [14]. I vår studie, ble magen prøven hentet fra en enkeltperson uten mage neoplasi eller andre pre-neoplasi forhold som atrofi, metaplasi eller dysplasi. Forstadier til kreft som gastritt føre til genomisk hypo-metylering i magen som kan endre uttrykk mønster av miRNAs [15]. Prøven ble hentet fra normalt vev fra en pasient uten patologi, som bidro til å unngå risikoen for å samle en tilsynelatende normal vevsprøve med mikro invasjoner av tidlig stadium tumorigene celler som kan forekomme hos pasienter med noen av de ovennevnte sykdommer.

Denne studien er den første ultra-high-throughput sekvensering av miRNAs i fysiologisk normal menneskelig magen. Bare 5,06% av mirnas identifisert i gastrisk vev hadde allerede blitt påvist i andre vev og katalogisert i bioinformatikkdataene databanker, for eksempel microRNA.org [10]. Vi forventer at denne gruppen av miRNAs å være regulatorer av husholdningsgener, som er rik på menneskelig vev. En annen 7,84% av miRNAs hadde ingen kamper i miRNA uttrykket databaser og kunne representere mirnas som er spesifikke for fordøyelsessystemet eller mage.

Tilsvarende undersøkelser er blitt utført med andre normale vev, for eksempel munn og svelg, spiserør, anus og tarmen. Vi sammenlignet disse dataene med miRNA ekspresjonsdata for å definere uttrykket mønster av magen vev. Vi fant høy uttrykk nivåer på 15 mirnas, 13 av dem hadde allerede blitt identifisert som sterkt uttrykt i andre vev.

uttrykk for mir-148a og mir-192 hadde blitt identifisert i andre normale og kreft menneskelig vev, men var ikke over-uttrykk. Mir-192 allerede hadde blitt detektert i gastrointestinale vev slik som kolon, ileum, tolvfingertarm, tynntarm, mage, bukspyttkjertel og lever [16]. Basal ekspresjon av mir-148a er blitt observert i bindevev og endokrine vev [17]. Nylig ble mir-148a funnet å bli undertrykt i navlestreng blod celler [18] og brakt til taushet av hypermethylation i colontumorer [19]. Vi har observert høy ekspresjon av det mir-200 klynge (a og b) i mage cardia som observert i de Langerhanske øyer [11]. I en microarray eksperiment ble mir-200A og 200B mir-detekteres ved lave nivåer i mage-tarmvevet, men ved høye nivåer i tykktarm, mage og bukspyttkjertel [16]. En nylig publisert mikroRNA uttrykk atlas viste at dette miRNA er karakteristisk for endokrine vev [17]. Nyere funn viser at den lave ekspresjon av mir-200 klynge er korrelert med ovariekreft [19], [20]. Derfor kan mir-200 klynge være viktig for å opprettholde integriteten av fordøyelses vev slik som gastrisk cardia fordi en slik høy ekspresjon opp-regulert ekspresjon av E-cadherin, proteinet er ansvarlig for organiseringen av arkitekturen i epitelvev. I tillegg er resultatene sterkt antydet en viktig rolle Mir-200 familie i undertrykkelse av epitel-mesenchymale overgang (EMT) og progresjon av kreft [21].

Tabell 1 og 2 viser antall mulige mål for hvert sterkt uttrykt moden miRNA. Tabell 2 viser noen mål for mirnas spådd av TargetScan mot familier av konserverte miRNAs. Med unntak av MIR-451, alle delt i det minste to andre genet mål. Genene ANKD52 Hotell og UBN2
, er mål for ti av de fjorten mirnas analysert, mens genet TNRC6B
er ni miRNAs, og genene EPS15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6
og PTPRD DD6
, er mål for åtte miRNA. Dette resultatet tyder på at disse mirnas er sterke kandidater til å bli brakt til taushet i Cardia regionen. Den eksperimentelle validering av disse genene, etterfulgt av en analyse av funksjonen til hver og en kan avdekke den fysiologiske rollen til disse mirnas i normal gastrisk vev.

Mange mirnas kan regulere translasjonen av proteiner som opptrer i vevsproliferasjonsaktivitet og vevet mønster som mir-200a (som kan målrette inte) og mir-145 (som kan samhandle med ErbB4
mRNA). Mange spådde mRNA målene ble funnet å være felles for flere høyt uttrykte miRNAs. For eksempel HTR4 plakater (5-hydroxytryptamine [serotonin] reseptor) og AFF2
mRNA ( AF4 /FMR2
familie, medlem 2) ble spådd til å bli mål for 13 av de 15 mest uttrykt miRNAs. Ytterligere fem mRNA, inkludert IGF-1 product: (insulin-like growth factor 1 [somatomedin C]), var vanlige spådd mål på 12 miRNAs. Åtte mirnas hadde 222 spådd mål i felles; for eksempel ble mir-29b forutsagt å målrette 196 av disse. Fem mirnas (19b, 29a, 29b, 29c og 148a) delte 70 spådd mål, hvorav noen ( CDK6
, PTEN
, IGF1
, FRS2
, PDGFRA
, PIK3R1 Hotell og MXD1
) regulerer celleproliferasjon og svulst undertrykkelse.

Flere observasjoner lenker mirnas til kreft. For det første er mange mirnas involvert i cellulær proliferasjon og apoptose. For det andre er mange miRNA loci ligger i sårbare områder av det menneskelige genom, regioner som ofte forsterket eller slettet i menneskelige neoplasier og forårsake store forskjeller i miRNA uttrykk sammenliknet med normalt vev [21], [22], [23], [24 ].

The real Time PCR-teknikk (som bruker relativ kvantifisering) bekreftet 15 mirnas identifisert som viser det høyeste uttrykk av solid plattform (som er basert på absolutte tall) (figur 4 og 5). Derfor kan disse mirnas betraktes som å være over-uttrykt [25], [26], [27], [28]. Korrelasjonen mellom DGE og RT-PCR-analyser var klar og statistisk signifikant. Og DGE eksperiment kan anses som representative for vev mage prøver isolert fra 10 helsefag og definere en del av uttrykket mønster av sunn mage vev.

Resultatene fra begge metoder indikerer at miRNA-21 var den mest uttrykt i mage Cardia vev. Dette miRNA er også distribuert i andre menneskelige vev (f.eks, dendrittiske celler, T-celler, bukspyttkjertel) og kan være med på å regulere uttrykket av husholdningsgener ( ATPAF1
, KIF3A
, CYBRD1
).

solid plattform viste at MIR-192 og 148a er spesifikke for gastrisk vev. I tillegg bekreftet Real Time PCR at disse mirnas er over-uttrykt. Dermed samlet, disse mirnas er sannsynlig å regulere uttrykket av gener relatert til mage vev homeostase. Derfor kan den lave nivåer av disse mirnas være relatert til utviklingen av en mage neoplasi. Potensiell bruk av miRNA-192 og miRNA-148a som risikomarkører i magekreft kan best undersøkt gjennom analyse av de miRnomes av ulike histologiske typer magekreft.

Forstå de regulatoriske prosesser som virker i menneske mage vil være viktig i kampen mot magekreft, som er den nest største årsaken til kreftdødelighet i verden.

Materialer og Metoder

biologisk materiale

mage Cardia er en mikroskopisk sone som normalt finnes i den proksimale del av magesekken, nær den øsofageale åpning (cardiac åpning eller cardia) og inneholder de kardiale kjertler. Vår ferske vevsprøve for ultra dypt sekvensering ble hentet fra en gastroscopic biopsi (~4 mm ^{3). Pasienten var 33 år gammel, med ingen bevis for kreft og en normal gastroøsofageal krysset. Makroskopisk observasjon av vevet viste ingen tegn på skader, og histologisk undersøkelse bekreftet normale og sunne forhold.}

For å bekrefte resultatene av ultra-dypt sekvensering, Cardia prøver, nær hjertestans åpningen, fra 10 tillegg friske individer var også oppnås ved endoskopiske biopsier (~4 mm ^{3), og etter histologisk undersøkelse unntatt abnormiteter, ble analysert av real Time PCR. H. pylori-infeksjon
ble diagnostisert basert på det typiske utseende av bakterien langs slimlaget som dekker den mukøse membranen gastrisk antrum biopsier ble tatt for histologisk evaluering på grunn av høyere densitet av bakteriene i gastrisk antrum og til utmerket følsomhet av denne diagnostisk metode , i henhold til internasjonale kriterier fastsatt for deres identifikasjon [12], [13] (ytterligere detaljer er gitt i tabell S2).}

ETIKK ERKLÆRING

Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter, og studien ble godkjent av Comité de Etica em Pesquisa (CEP) Hospital Universitário João Barros Barreto (HUJBB.) - Federal University of Pará (UFPA) (protokoll nummer 14052004 /HUJBB)

miRNA LIBRARY

den totale små RNA ble hentet fra prøven vev ved hjelp av Mirvana Isolation Kit (Ambion Inc., USA). Konsentrasjonen og kvaliteten ble bestemt under anvendelse av et Nanodrop spektrofotometer 1000, og rensing og størrelse utvalg ble utført ved å bruke 6% polyakrylamid-gel-elektroforese. Bruke SOLID små RNA Expression Kit (Ambion Inc., USA), ble 200 ng av små RNA på 150-200 bp brukes som en mal for å oppnå miRNA biblioteket. Alle mirnas av biblioteket ble merket med unike og spesielle amplifiseirngsprimere, kjent som strekkodesystem (Life Technologies, CA, USA). Deretter ble 50 pg av biblioteket sammenslått med syv andre miRNA biblioteker ved samme konsentrasjon. En fraksjon av biblioteket bassenget (0,1 pg) ble amplifisert og festet på magnetiske kuler ved hjelp av PCR-emulsjon. Den ePCR Produktet ble avsatt på et enkelt lysbilde og utsatt for multipleks solid sekvenseringsreaksjon.

SOLID ULTRA-DEEP sekvensering og dataanalyse

Den faste (versjon 2.0) sekvenseringssystem (Life Technologies) ble brukt til å generere lesninger som var 35 bp langt. Det andre trinnet var å dekode strekkoden, som samsvarer hver perle sekvens med identiteten av prøven. Alle små RNA sekvenser av mage Cardia er tilgjengelig i NCBI Sekvenser Les Archive (SRA012099). Sekvensanalyse ble utført ved hjelp av solid system Small RNA Analysis Tool (Life Technologies) og MiRanalyzer [8]. Først må vi filtrert ut alle sekvenser som passet RNA forurensninger som tRNA, rRNA, DNA gjentar og adaptermolekylene. Etter eksklusjon av forurensning leser, justert vi alle sekvenser mot miRNA forløper sekvenser (MirBase ver. 12) og da bare inkluderte leser som passet moden miRNA sekvenser [9]. Å sammenligne disse uttrykk data med andre menneskelige vev, ble miRNA uttrykk data importert fra microRNA.org database, og uttrykk for hvert modne miRNA ble normalisert ved total lese count [10]. Grafisk analyse ble utført ved hjelp av Genepattern ^{10. De miRNA-biologisk prosess relasjoner ble beregnet med miRNApath (http://lgmb.fmrp.usp.br/mirnapath/tools.php).}

miRNA Real Time PCR (validering)

Biopsi prøver av mage Cardia vev ble samlet inn fra 10 friske pasienter. Etter samlingen, ble prøvene straks bearbeidet og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Total RNA ble ekstrahert ved homogenisering av 40 milligram av frosset vev, etterfulgt av RNA isolering av TRIzol-reagens (Life Technologies) ifølge produsentens instruksjoner. Konsentrasjonen og kvaliteten av mirnas ble bestemt ved bruk av et Nanodrop spektrofotometer 1000 (ND-1000; Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). Total RNA ble revers transkribert ved hjelp av en TaqMan @ mikroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies).

Analysen av mirnas nivåer ble utført på en 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies) med TaqMan miRNA analyser i henhold til produsentens instruksjoner (Life Technologies) ved hjelp av primere designet med Primer Express (Life Technologies). Det betyr uttrykket nivået av tre menneskelige endogene kontroller (Z30, RNU19 og RNU6B - kalibratorer). Ble brukt som en intern kontroll i alle miRNA eksperimenter for å tillate sammenligning av uttrykket resultater

De høye uttrykk nivåer av miRNAs identifisert av ultra-dypt sekvensering (i synkende rekkefølge: MIR-29C, MIR-21, MIR-148a, MIR-29a, MIR-24, MIR-29b, MIR-192, MIR-451, MIR-145, MIR-31, MIR-200A, MIR-19b, MIR-200b, la-7b og MIR-26a) ble validert med TaqMan miRNA analyser (Life Technologies). Disse analysene ble brukt til å måle uttrykket nivåer av modne mirnas og inter-individuell variasjon i de 10 prøvene av sunn Cardia vev. Ekspresjonsproduktene data for hver modne miRNA ble normalisert til gjennomsnitts ekspresjonsnivået av de tre humane endogene kontroller (Z30, RNU19 og RNU6B). De relative miRNA ekspresjonsnivåer ble deretter beregnet ved den komparative terskelsyklusen (Ct) -metoden (2 ^{-ΔCt). Korrelasjon testen ble utført ved bruk av Pearson-metoden (SPSS v.12).}

Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Identitet og overflod data for alle kjente mirnas i fast rekkefølge datasett i menneskets mage og miRamda database
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013205.s001 plakater (0,44 MB PDF)
Tabell S2.
Beskrivelse og RT-PCR resultatene av 10 prøver fra friske individer innhentet av endoskopiske biopsier. Prøver størrelse er ca ~4 mm3. For alle prøver ble utført en histologisk undersøkelse og H. pylori deteksjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013205.s002 plakater (0,03 MB XLS)

Takk

forfattere takket D. Calcagno og S. Demaschki for sine kommentarer, ideer og hjelper.

• PLoS ONE: Veien til et Mans hjerte er gjennom magen hans: Hva om Horses
• PLoS ONE: Impact of Energy Drink på strukturen i magen og Pancreas av Albino Rat: Kan Omega-3 Gi en beskyttelse