PLoS ONE: сверхглубокого секвенирование показывает микроРНК паттерн экспрессии человеческого Stomach

Абстрактный

Фон

В то время как микроРНК (микроРНК) играют важную роль в дифференциации тканей и в поддержании базального физиологии, мало известно о уровнях экспрессии микроРНК в тканях желудка. Изменения в профиле микроРНК может привести к клеточной дерегулирования, которая может вызвать неоплазии.

Методология /Основные выводы
<р> Маленькая РНК библиотека ткани желудка секвенировали с использованием высокой пропускной способностью технологии SOLiD секвенирования. Мы получили 261274 качество чтения с совершенными матчей к человеческому miRnome, и были идентифицированы 42% известных микроРНК. Цифровой экспрессии генов профилирование (DGE) была выполнена на основе чтения изобилии и показал, что пятнадцать микроРНК были высоко выражены в желудочном ткани. Впоследствии экспрессия этих микроРНК была подтверждена у 10 здоровых лиц с помощью ОТ-ПЦР показал значительную корреляцию 83.97% (P &ЛТ; 0,05). Шесть микроРНК показали низкий переменный характер экспрессии (MIR-29b, микроРНК-29с, микроРНК-19b, MIR-31, микроРНК-148а, микроРНК-451) и может рассматриваться как часть паттерна экспрессии здорового желудка ткани.

Выводы /Значение
<р> Это исследование с целью проверки нормальные профили микроРНК ткани желудка человека создать эталонный профиль для здоровых людей. Определение регуляторных процессов, действующих в желудке будет иметь важное значение в борьбе с раком желудка, которая является второй ведущей причиной смертности от рака во всем мире
<р> Цитирование:. Ribeiro-дос-Сантос Â, Хаят А.С., Сильва , Alencar DO, Лобату J, L Лус и др. (2010) сверхглубокого секвенирования Раскрыта микроРНК паттерн экспрессии человеческого желудка. PLoS ONE 5 (10): e13205. DOI: 10.1371 /journal.pone.0013205
<р> Редактор: Патрик Тан, Duke-Национальный университет Сингапура Высшей медицинской школы, Сингапур
<р> Поступило: 30 марта 2010; Принято: 8 сентября 2010 года; Опубликовано 8 октября 2010 года
<р> Copyright: © 2010 Ribeiro-дос-Сантос и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Работа была поддержана Genoma Paraense де Genomica е протеомика проекта (Governo сделать Para /SEDECT /FAPESPA), PROPESP /UFPA, FADESP и накидки (Coordenacao де Aperfeicoamento де Pessoal де Nivel Superior). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

в последнее время Фридман и др.
2009 показали, что большинство человеческих генов находятся под контролем микроРНК. > 45000 микроРНК сайты-мишени в пределах человеческих 3'UTRs сохраняются, и > 60% человеческого белок-кодирующих генов оказались под селективным давлением для поддержания сопряжений в микроРНК [1]. микроРНК маленькие, некодирующие последовательности 17-25 пар оснований, которые регулируют экспрессию генов путем связывания с 3'-концом целевых мРНК, что приводит к ингибированию трансляции [2] мРНК [3]. Приблизительно 14 000 микроРНК были выявлены у животных, растений и грибов [4], [5], [6]
<р> Механизмы, которые включают микроРНК, как негативные регуляторы экспрессии генов сходны у животных и растений. они регулируют основные клеточные процессы [6]. У людей, около 3% всех генов прогнозируются для кодирования микроРНК прекурсоров, а также над &GТ; 60% белок-кодирующих генов может регулироваться с помощью микроРНК [1]. МикроРНК имеют существенные функции во многих клеточных процессах, таких как рост и развитие, клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Следовательно, изменения в экспрессии микроРНК способствуют заболеваний человека, таких как рак [7], [8].
<Р> Изменения в структуре экспрессии микроРНК были обнаружены во многих типах рака человека, таких как рак молочной железы, толстой кишки, легких, простаты, лейкемии и желудка рака. экспрессии микроРНК изменения приводят к потере или усиления функции и связаны с развитием человеческого новообразование с помощью различных механизмов [5].
<р> Здесь мы представляем генетическое исследование микроРНК человеческого желудка, потому что, несмотря на значение органа, маленькие генетические данные доступны на их присутствие и регуляции в организме человека. Эта работа является первым полным miRnome секвенирование нормальной ткани желудка с использованием технологии секвенирования следующего поколения.

Результаты
<р> В настоящем исследовании, профили были получены сверхглубокого секвенирования с использованием Сплошная платформы ( Life Technologies, Калифорния, США). Это первое исследование, чтобы использовать эту процедуру для описания miRnome нормальной желудочной ткани. микроРНК были изолированы от нормальной слизистой оболочки кардиального отдела желудка одного здорового пациента. Профили были проверены с помощью ПЦР в реальном времени для определения экспрессии 15 наиболее высоким уровнем экспрессии микроРНК еще в 10 здоровых пациентов.

сверхглубокого секвенирование
<р> сверхглубокого секвенирования дали в общей сложности 104 млн сырой читает и читает 5 миллионов для кардиального отдела желудка библиотеки микроРНК. Для дальнейшего анализа 3200000 чтений были выбраны в соответствии с качеством последовательности (по крайней мере, QV≥10 в 10 первых оснований) [8]. После того, как отображение их в геноме человека (выпуск 19), общее отображенных чтения граф был 2534490 млн просмотров (75% от общего качества чтения). Приблизительно 38% от 2,5 миллиона просмотров (963460 просмотров) были повторяющиеся последовательности ДНК, тРНК, рРНК или другие малые молекулы; 10% (261274) были приняты читает, идеально выровнены с известными зрелых микроРНК (MirBase версия 15, выпуск 04/2010) [9]; а остальная часть чтений (52%) были сопоставлены геномные последовательности (рисунок 1).
<р> Для анализа экспрессии микроРНК, читает только с матчами, чтобы созреть микроРНК последовательности (261274 просмотров) были включены. В кардии, мы идентифицировали 404 970 известных последовательностей зрелых микроРНК (42%). Для анализа экспрессии микроРНК, мы определили пять диапазонов: от 1 до 10 отсчетов на чтение; От 11 до 100; 101 до 1000; 1,001 до 5,000; и для чтения подсчет более чем 5000 (Рисунок 2) (дополнительные подробности приведены в таблице S1). Первый диапазон (1-10) составили 40% от микроРНК наблюдаемых; второй диапазон (от 11 до 100) составила 26%; третий диапазон (от 101 до 1000 человек) составила 20%; и четвертый и пятый диапазоны (> 1000 подсчета чтения) составляли 14%
<р> С помощью этой классификации, были выражены 347 зрелых микроРНК между первым и третьим диапазонов и 57 между четвертым и пятым диапазонов.. Для определения характеристик miRnome, мы выбрали набор из 15 микроРНК, которые были высказаны на самом высоком уровне (≥1,000 читает).
<Р> Таблица 1 и Рисунок 3 перечисляют 15 зрелых микроРНК, идентифицированные в кардии желудка человека , Heatmap фиг.4 резюмирует экспрессию этих 15 микроРНК в кардии желудка и через нормальных человеческих тканях, данные DGe, доступная в microRNA.org банке данных [10], [11]. Выражение Зрелые миРНК можно было бы разделить на две группы: I) кардии-тканей: редко микроРНК, выраженные в других тканях, но выражается в кардии, в том числе микроРНК-148а, микроРНК-192, микроРНК-200а и микроРНК-200B; б) квази-вездесущи: микроРНК экспрессируется во многих тканях и условиях, в том числе MIR-29с, MIR-21, микроРНК-24, микроРНК-29b, микроРНК-29а, микроРНК-451, микроРНК-31, микроРНК-145, микроРНК-26а , микроРНК-19b и пусть-7b.

ПЦР в реальном времени

сверхглубокого результаты секвенирования были подтверждены с помощью singleplex ПЦР в реальном времени (RT-PCR) метод на 15 микроРНК, выбранных для определить свое выражение в желудочном области кардии у 10 здоровых лиц. Из испытуемых, 60% были мужчины, средний возраст составил 39,1 (± 12,8) лет и 50% исследуемых субъектов дали положительный результат на H. пилори
, в соответствии с международными критериями, установленными для их идентификации [12], [13] (таблица 2) (дополнительные подробности приводятся в таблице S2).

COMPARARISON С DGE И RT-PCR
<р> Оба singleplex (RT-PCR) и мультиплекс (твёрдое платформа) технологии показали высокую экспрессию (выражение более 1000 читает в DGE и в 7 раз выше эндогенного контроля в RT-PCR) из 15 микроРНК (Рисунки 4 и 5)
<р> Те же образцы РНК были проанализированы двумя различными платформами: DGE и RT-PCR - Life Technologies.. Эксперименты Результаты были сопоставлены и наблюдались линейной регрессии между 2 ^{-ΔCt и квадратный корень из числа читать счета. Корреляции Пирсона высокая 83,9% со статистически значимым тестом (P < 0,05). И подтверждено Заметные результаты}

Кроме того, результаты DGE сравнивали с количественной оценки диапазона экспрессии микроРНК в 10 здоровых субъектов, путем реального времени ПЦР. Регрессии для среднего анализов RT-PCR в сравнении
квадратный корень из числа читать счета. Корреляции Пирсона высокая 68,4% со статистически значимым тестом (P < 0,05).
<Р> Не могли бы наблюдать микроРНК с высокой межиндивидуальной вариации, для Exempla MIR-21, а другой с низким межиндивидуальной вариации, например, паттерн экспрессии слегка переменной (MIR-29b, микроРНК-29c, микроРНК-19b, микроРНК-31, микроРНК-148а, микроРНК-451).

Обсуждение
<р> микроРНК регулируют большинство человеческих генов; Тем не менее, лишь немногие микроРНК имели свои цели и конкретные функции определены [14]. В нашем исследовании образец желудок был получен от одного индивидуума без неоплазии желудка или других предварительно неоплазии условий, таких как атрофия, метаплазия или дисплазией. Предраковых поражений, таких как гастрит приводят к геномного гипо-метилирования в желудке, что может изменить характер экспрессии микроРНК [15]. Образец был получен из нормальных тканей у пациента без каких-либо патологий, что помогло избежать риска сбора, казалось бы, нормальный образец ткани с микро- нашествиями на ранней стадии онкогенных клеток, может возникнуть у пациентов с любым из вышеуказанных патологий.
<р> Это исследование является первым ультра-высокой пропускной последовательности микроРНК в физиологически нормального человеческого желудка. Только 5,06% микроРНК, идентифицированных в желудочной ткани уже были обнаружены в других тканях и каталогизированы в биоинформатическими банков данных, таких как microRNA.org [10]. Мы ожидаем, что эта группа микроРНК быть регуляторами генов домашнего хозяйства, которые в изобилии в тканях человека. Еще 7,84% микроРНК не было никаких соответствий в базах данных экспрессии микроРНК и могут представлять микроРНК, которые являются специфическими для пищеварительной системы или желудка.
<Р> Аналогичные исследования были проведены с другими нормальными тканями, такими как ротовой полости, глотки, пищевода, ануса и кишечника. Мы сравнили эти данные с нашими данными экспрессии микроРНК, чтобы определить характер экспрессии в ткани желудка. Мы нашли высокие уровни экспрессии в 15 микроРНК, 13 из которых уже были определены как высокий уровень экспрессии в других тканях.
<Р> Выражение MIR-148а и MIR-192 были идентифицированы в других нормальных и раковых тканей человека, но не слишком выражены. Мир-192 уже были обнаружены в желудочно-кишечных тканей, таких как толстой кишки, подвздошной кишки, двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника, желудка, поджелудочной железы и печени [16]. Базальная экспрессия микроРНК-148а наблюдается в соединительной ткани и эндокринной ткани [17]. В последнее время Mir-148a было установлено, что репрессиям в пупочной клеток пуповинной крови [18] и подавляются гиперметилированием в опухолях толстой кишки [19]. Мы наблюдали высокий уровень экспрессии кластера Mir-200 (а и б) в кардии, как наблюдалось в островках Лангерганса [11]. В эксперименте микрочипов, Mir-200a и Mir-200b были обнаружены при низких уровнях в желудочно-кишечной ткани, но на высоком уровне в толстой кишке, желудка и поджелудочной железы [16]. Недавно были опубликованы результаты экспрессии микроРНК атласе показал, что эта микроРНК характерно для эндокринной ткани [17]. Недавние исследования показали, что низкая экспрессия кластера Mir-200 коррелирует с раком яичников [19], [20]. Таким образом, кластер Mir-200 может иметь важное значение в поддержании целостности пищеварительных тканей, таких как кардии, потому что такое высокая экспрессия повышающей регуляции экспрессии Е-кадгерин, белка, ответственного за организацию архитектуры эпителиальной ткани. Кроме того, результаты сильно предложил важную роль семьи микроРНК-200 в подавлении эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) и прогрессирование рака [21].
<Р> Таблица 1 и 2 показывают количество возможные цели для каждого высоко выраженной зрелой микроРНК. В таблице 2 приведены некоторые цели микроРНК, предсказываемых TargetScan против семейств законсервированных микроРНК. За исключением MIR-451, все разделяли по крайней мере, два других целевых генов. Гены ANKD52
и UBN2
, являются объектами десяти из четырнадцати микроРНК проанализированные, в то время как ген TNRC6B
имеет девять микроРНК, а гены EPS15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6 <бр> и PTPRD DD6
, являются объектами восьми микроРНК. Этот результат позволяет предположить, что эти микроРНК являются сильными кандидатами на бесшумное в кардии регионе. Экспериментальная проверка этих генов, с последующим анализом функции каждого из них можно выявить физиологическую роль этих микроРНК в нормальной ткани желудка.
<Р> Многие микроРНК могут регулировать перевод белков, которые действуют в пролиферации тканей и ткани формирования рисунка, такие как MIR-200а (которые могут быть направлены на интегрин) и Mir-145 (который может взаимодействовать с ERBB4
мРНК). Установлено, что многие предсказанные мРНК мишеней, являются общими для нескольких с высоким уровнем экспрессии микроРНК. Например, HTR4
(5-гидрокситриптамина [серотонин] рецепторов) и AFF2
МРНК ( Af4 /FMR2
семьи, член 2), согласно прогнозам, быть объектами 13 из 15 наиболее выраженных микроРНК. Еще пять МРНК, в том числе ИФР-1
(инсулиноподобный фактор роста 1 [соматомедин С]), были общими предсказанные объектами 12 микроРНК. Восемь микроРНК имела 222 предсказанные цели в общем; например, Mir-29b было предсказано цель 196 из них. Пять микроРНК (19b, 29a, 29b, 29c и 148а) совместно 70 предсказывал цели, некоторые из которых ( CDK6
, PTEN
, IGF1
, FRS2
, PDGFRA
, PIK3R1
и MXD1
) регулируют клеточную пролиферацию и подавление опухоли.

Несколько наблюдений связывают микроРНК с раком. Во-первых, многие микроРНК участвуют в клеточной пролиферации и апоптоза. Во-вторых, многие локусы микроРНК расположены в хрупких участках генома человека, областей, которые часто Усиленные или удалены в человеческих неоплазий и вызывают большие различия в экспрессии микроРНК по сравнению с нормальными тканями [21], [22], [23], [24 ].
<р> метод ПЦР в реальном времени (который использует относительную количественную) подтвердили 15 микроРНК, идентифицированные как показывает самое высокое выражение сплошными платформы (которая основана на абсолютных цифрах) (4 и 5). Таким образом, эти микроРНК можно рассматривать как сверхвыражен [25], [26], [27], [28]. Корреляция между DGE и RT-PCR анализов было ясно и статистики значительна. И DGE эксперимент можно считать репрезентативной тканей желудка образцов, выделенных из 10 субъектов здравоохранения и определяют часть паттерна экспрессии здорового желудка ткани.
<Р> Результаты обоих методик показывают, что микроРНК-21 был самым высоким уровнем экспрессии в кардии ткани. Это микроРНК также распространяется в других тканях человека (например, дендритные клетки, Т-клетки, поджелудочная железа) и могут быть вовлечены в регуляции экспрессии генов домашнего хозяйства ( ATPAF1
, Kif3a
, CYBRD1
).
<р> Сплошная платформы показали, что микроРНК-192 и 148а являются специфическими для желудка ткани. Кроме того, ПЦР в реальном времени подтвердили, что эти микроРНК чрезмерно выражены. Таким образом, в целом, эти микроРНК, вероятно, регулируют экспрессию генов, связанных с гомеостазом желудочной ткани. Таким образом, низкие уровни экспрессии этих микроРНК может быть связано с развитием желудка неоплазии. Возможное использование микроРНК-192 и микроРНК-148а в качестве маркеров риска при раке желудка может быть наилучшим образом исследовано с помощью анализа miRnomes различных гистологических типов рака желудка.
<Р> Понимание регуляторных процессов, которые действуют в человеке желудок будет играть важную роль в борьбе с раком желудка, которая является второй ведущей причиной смертности от рака во всем мире.

Материалы и методы

Биологический материал
<р> кардия желудка микроскопическая зона, которая обычно находится в наиболее проксимальной части желудка, близко к пищеводу отверстие (кардиального отверстия или кардии) и содержит кардиальные железы. Наш образец свежей ткани для сверхглубокого секвенирования была получена из гастроскопической биопсии (~4 мм ^{3). Пациент 33 лет, без признаков рака и нормального желудочно-пищеводного соединения. Макроскопические наблюдения ткани не показали никаких признаков повреждений, а также гистологическое исследование подтвердило нормальные и здоровые условия.
<Р> Для подтверждения результатов сверхглубокого секвенирования, образцы кардии, вблизи кардиального отверстия, из 10 Кроме того, здоровые люди были также получены эндоскопических биопсий (~4 мм 3) и, после гистологического исследования, за исключением отклонений, анализировали с помощью ПЦР в реальном времени. H. пилори
инфекция была диагностирована на основании характерному внешнему виду бактерии вдоль слизистого слоя, покрывающего слизистую желудка антральном биопсии были взяты для оценки гистологических из-за более высокой плотности бактерий в желудочном антральном и отличной чувствительности этого метода диагностики , в соответствии с международными критериями, установленными для их идентификации [12], [13] (дополнительные подробности приводятся в таблице S2).}

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ
<р> Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, и исследование было одобрено Comite де ETICA эм Pesquisa (КЭП) из больницы Университарио João Barros Баррето (HUJBB) -. Федеральный университет (UFPA Pará) (Номер протокола 14052004 /HUJBB)

микроРНК БИБЛИОТЕКА
<р> общая малая РНК получали из ткани образца, используя Isolation Kit Mirvana (Амбион Inc., США). Концентрация и качество определяли с использованием NanoDrop 1000 спектрофотометра, а очистка и выбор размера были выполнены с использованием 6% электрофореза в полиакриламидном геле. Использование Сплошная Малый набор РНК Expression (Амбион Inc., США), 200 нг малых РНК из 150-200 пар оснований использовали в качестве матрицы для получения библиотеки микроРНК. Все микроРНК библиотеки были помечены уникальными и специфическими праймеров для амплификации, известных как системы штрих-кодов (Life Technologies, CA, США). Затем, 50 пг библиотеки объединяли с семью другими библиотеками микроРНК в той же концентрации. Фракцию библиотеки пула (0,1 пг) амплифицировали и фиксируется на магнитных гранул с использованием эмульсионной ПЦР. EPCR продукт осаждали на одном слайде и подвергали мультиплексной твердофазной реакции секвенирования.

SOLiD сверхглубокого секвенирование и анализ данных
<р> Твердую (версия 2.0) системы секвенирования (Life Technologies) был использован для генерации говорится, что были 35 пар оснований. Второй шаг был декодировать штрих-код, соответствующий каждой последовательности шарик с идентичностью образца. Все малые РНК последовательности кардиального отдела желудка доступны в NCBI последовательностях Read Archive (SRA012099). Анализ последовательностей проводили с использованием надежной системы малых РНК Analysis Tool (Life Technologies) и MiRanalyzer [8]. Во-первых, мы отфильтровываются все последовательности РНК, которые соответствовали загрязнители, такие как тРНК, рРНК, повторы ДНК и молекул адаптера. После исключения загрязнителем читает, мы выровнены все последовательности против последовательностей предшественников микроРНК (MirBase вер. 12), а затем включается только чтений, которые соответствовали последовательности зрелых микроРНК [9]. Для того, чтобы сравнить эти данные выражения с другими тканями человека, данные экспрессии микроРНК были импортированы из базы данных microRNA.org, и выражение каждой зрелой микроРНК была нормирована общего количества чтения [10]. Графический анализ проводился с использованием Genepattern 10. МиРНК-биологические отношения процесса были предсказаны с использованием miRNApath (http://lgmb.fmrp.usp.br/mirnapath/tools.php~~HEAD=dobj).

микроРНК ПЦР в реальном времени (ВАЛИДАЦИЯ)

биопсию образцы тканей желудка кардии были собраны из 10 здоровых пациентов. После сбора пробы были сразу обработаны и хранили при -80 ° С до экстракции РНК. Суммарную РНК экстрагировали гомогенизацией 40 миллиграммов замороженной ткани с последующим выделением РНК TRIzol реагента (Life Technologies) в соответствии с инструкциями изготовителя. Концентрация и качество микроРНК определяли с использованием NanoDrop 1000 спектрофотометра (ND-1000; NanoDrop технологии, Уилмингтон, Делавэр). Общую РНК обратно транскрибируют с использованием TaqMan @ микроРНК обратной транскрипции комплект (Life Technologies).
<Р> Анализ уровней микроРНК проводился на 7500 системе ПЦР в реальном времени (Life Technologies) с TaqMan микроРНК анализы в соответствии с инструкции производителя (Life Technologies) с использованием праймеров, сконструированных с Primer Express (Life Technologies). Средний уровень экспрессии трех человеческих эндогенных управления (Z30, RNU19 и RNU6B - калибраторов). Был использован в качестве внутреннего контроля во всех экспериментах микроРНК чтобы дать возможность сравнения результатов экспрессии
<р> Высокие уровни экспрессии микроРНК идентифицированы путем сверхглубокого секвенирования (в порядке убывания: MIR-29с, микроРНК-21, микроРНК-148а, микроРНК-29а, микроРНК-24, микроРНК-29b, микроРНК-192, микроРНК-451, микроРНК-145, микроРНК-31, микроРНК-200а, микроРНК-19b, микроРНК-200b, пусть-7b и микроРНК-26а) были подтверждены с анализов TaqMan микроРНК (Life Technologies). Эти анализы были использованы для измерения уровней экспрессии зрелых микроРНК и межиндивидуальную изменения в 10 образцах здоровой ткани кардии. Выражение данных каждого зрелых микроРНК были нормированы на средней уровень экспрессии трех человеческих эндогенных контроля (Z30, RNU19 и RNU6B). Относительные уровни экспрессии микроРНК были затем вычислены методом сравнительного порогового цикла (Ct) (2 ^{-ΔCt). Испытание корреляции проводилось с использованием метода Пирсона (SPSS v.12).}

Поддержка Информация
таблице S1.
Идентичность и данных о численности для всех известных микроРНК в SOLiD последовательности набора данных в желудке человека и базы данных miRamda
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0013205.s001
(0,44 МБ PDF)
Таблица S2.
Описание и результаты ОТ-ПЦР из 10 образцов от здоровых людей, полученных эндоскопических биопсий. Размер образцов составляет около ~ 4 мм3. Для всех образцов были проведены гистологического исследования и обнаружения H. Pylori
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0013205.s002
(0.03 MB XLS)

Выражение признательности
<р> Авторы выражают благодарность Д. Calcagno и С. Demaschki за свои комментарии, идеи и помогает.

• PLoS ONE: Путь к Mans сердце через его желудок: А как насчет лошадей
• PLoS ONE: Влияние энергетического напитка на структуру желудка и поджелудочной железы Альбино Крыса: Может Омега…