PLoS ONE: Ultratiefe Sequenzierung der microRNA Expressionsmuster des menschlichen Stomach

Abstrakt

Hintergrund

Während microRNAs (miRNAs) eine wichtige Rolle bei der Gewebedifferenzierung spielen und in basalen Physiologie Pflege, wenig über die miRNA-Expressionsniveaus in Magengewebe bekannt. Veränderungen in der miRNA-Profil kann zu Zell Deregulierung führen, die Neoplasie induzieren kann.

Methodik /wesentlichen Ergebnisse

Eine kleine RNA-Bibliothek von Magengewebe wurde mit hohem Durchsatz SOLiD-Sequenzierungstechnologie sequenziert. Wir erhalten 261.274 Qualität liest mit perfekten Übereinstimmungen mit dem menschlichen miRnome, und 42% der bekannten miRNAs identifiziert wurden. Digitale Genexpressionsprofilierung (DGE) wurde auf den Lesefluss durchgeführt basiert und zeigte, dass fünfzehn miRNAs waren hoch im Magengewebe exprimiert. Anschließend wurde die Expression dieser miRNAs in 10 gesunden Personen durch RT-PCR bestätigt zeigte eine signifikante Korrelation von 83,97% (P < 0,05). Sechs miRNAs zeigte eine geringe variable Muster der Expression (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451) und könnte ein Teil des Expressionsmusters des gesunden Magen-Gewebe in Betracht gezogen werden.

Schlussfolgerungen /Bedeutung

Diese Studie soll normalen miRNA-Profile von menschlichen Magengewebe zu validieren ein Referenzprofil für gesunde Menschen zu etablieren. die regulatorischen Prozesse Bestimmung im Magen wirken wird im Kampf gegen Magenkrebs wichtig sein, die die zweithäufigste Ursache der Krebssterblichkeit weltweit ist

Citation:. Ribeiro-dos-Santos, Khayat AS, Silva A , Alencar DO, Lobato J, Luz L, et al. (2010) Ultratiefe Sequenzierung enthüllt die microRNA Expressionsmuster des menschlichen Magens. PLoS ONE 5 (10): e13205. doi: 10.1371 /journal.pone.0013205

Editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapur

Empfangen: 30. März 2010; Akzeptiert: 8. September 2010; Veröffentlicht: 8. Oktober 2010

© 2010 Ribeiro-dos-Santos et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Arbeit Genoma Paraense de Genomica e Proteomik Projekt unterstützt (Governo do Para /SEDECT /FAPESPA). PROPESP /UFPA, FADESP und CAPES (Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior) wurde von der Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Vor kurzem Friedman et al.
zeigte 2009, daß die Mehrheit der menschlichen Gene unter der Kontrolle von miRNAs sind. Die > 45.000 miRNA Zielstellen innerhalb der menschlichen 3'UTRs konserviert sind, und > 60% der menschlichen Protein-kodierenden Gene wurden unter Selektionsdruck Paarungen miRNAs aufrechtzuerhalten [1]. miRNAs sind kleine, nicht-kodierenden Sequenzen von 17-25 bp, welche die Genexpression regulieren, indem sie an das 3'-Ende der Ziel-mRNAs bindet, was in der Hemmung der Translation der mRNAs [2], [3]. Etwa 14.000 miRNAs identifiziert worden, in Tieren, Pflanzen und Pilzen [4], [5], [6]

Die Mechanismen, die miRNAs als negative Regulatoren der Genexpression sind ähnlich bei Tieren und Pflanzen beinhalten. sie regulieren grundlegende zelluläre Prozesse [6]. Beim Menschen etwa 3% aller Gene vorhergesagt miRNA Vorläufern zu codieren und über > 60% der Protein-kodierenden Gene durch miRNAs reguliert werden kann [1]. MiRNAs haben wesentliche Funktionen in vielen zellulären Prozessen, wie Wachstum und Entwicklung, die Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Folglich Veränderungen in der Expression miRNA Beitrag zur menschlichen Krankheiten wie Krebs [7], [8].

Änderungen in miRNA-Expressionsmuster in vielen Arten von Krebs beim Menschen, wie Brust-, Dickdarm-, Lungen- wurden beobachtet, Prostata, Leukämie und Magenkrebs. miRNA-Expression Veränderungen führen zu einem Verlust oder Gewinn von Funktion und sind mit der Entwicklung der menschlichen Tumors durch verschiedene Mechanismen verbunden sind [5].

Hier präsentieren wir eine genetische Untersuchung der miRNA des menschlichen Magens, denn trotz die Bedeutung des Organs, sind wenig genetische Daten über ihre Anwesenheit und Regulierung beim Menschen vor. Diese Arbeit ist die erste vollständige Sequenzierung miRnome der normalen Magengewebe der nächsten Generation Sequenzierung Technologie.

Ergebnisse |

In der vorliegenden Studie, Profile von ultratiefe Sequenzierung mit dem SOLiD-Plattform erhalten ( Life Technologies, CA, USA). Dies ist die erste Studie, die diese Verfahren verwenden, um die miRnome der normalen Magen-Gewebe zu beschreiben. miRNAs wurden aus normalen Kardia Schleimhaut eines einzigen gesunden Patienten isoliert. Die Profile wurden unter Verwendung von Real Time PCR validiert die Expression der 15 am stärksten zum Ausdruck miRNAs in weiteren 10 gesunden Patienten zu bestimmen.

ULTRA-deep sequencing

Ultratiefe Sequenzierung ergab insgesamt 104 Millionen roh liest und 5 Millionen liest für die Kardia miRNA-Bibliothek. Zur weiteren Analyse wurden 3,2 Mio. liest nach Sequenzqualität (mindestens QV≥10 in den ersten 10 Basen) ausgewählt [8]. Nach Kartierung diese mit dem menschlichen Genom (Release 19), kartiert die Gesamt gelesen Zahl betrug 2.534.490 Millionen liest (75% der Gesamtqualität liest). Ungefähr 38% von 2,5 Mio. liest (963.460 liest) wurden repetitiven DNA-Sequenzen, tRNA, rRNA oder andere kleine Moleküle; 10% (261.274) wurden angenommen liest, perfekt ausgerichtet mit bekannten reifen miRNAs (miRBase Version 15, Release 04/2010) [9]; und der Rest der liest (52%) wurden angepasst Sequenzen des Genoms (Abbildung 1).

Für die Expressionsanalyse von miRNAs, liest nur mit Streichhölzern miRNAs Sequenzen zu reifen (261.274 liest) enthalten waren. In Kardia identifizierten wir 404 von 970 bekannten reifen miRNA-Sequenzen (42%). Um die Expression von miRNAs analysieren, definierten wir fünf Bereiche: 1 bis 10 Lesezählungen; 11-100; 101 bis 1.000; 1.001 bis 5.000; und eine Lesezählung von mehr als 5000 (Bild 2) (weitere Einzelheiten sind in Tabelle S1 zur Verfügung gestellt). Der erste Bereich (1-10) umfasste 40% der miRNAs beobachtet; der zweite Bereich (11 bis 100) umfasste 26%; der dritte Bereich (101 bis 1000) umfasste 20%; und die vierten und fünften Bereichen (> 1000 Lesezählung) umfasste 14%

Mit dieser Klassifizierung 347 mature miRNAs wurden zwischen den ersten und dritten Bereichen und 57 zwischen den vierten und fünften Bereichen ausgedrückt.. Zur Charakterisierung des miRnome, wählten wir einen Satz der 15 miRNAs, die auf den höchsten Ebenen zum Ausdruck gebracht wurden (≥1,000 liest).

Tabelle 1 und Abbildung 3 Liste der 15 reifen in den menschlichen Magen-Cardia identifiziert miRNAs . Die Heatmap der 4 fasst die Expression dieser 15 miRNAs in der Kardia und in normalen menschlichen Geweben, DGE-Daten in der Datenbank microRNA.org [10], [11]. Ältere miRNA-Expression konnte in zwei Gruppen eingeteilt werden: i) Cardia-Gewebe: miRNAs selten in anderen Geweben exprimiert, jedoch ausgedrückt in Kardia, einschließlich miR-148a, miR-192, miR-200a und miR-200b; ii) quasi allgegenwärtig: miRNAs in vielen Geweben und Bedingungen exprimiert, einschließlich miR-29c, miR-21, miR-24, miR-29b, miR-29a, miR-451, miR-31, miR-145, miR-26a miR-19b und let-7b.

Real-Time PCR

die ultratiefe Sequenzierung Ergebnisse validiert wurden unter Verwendung der Singleplex Real Time PCR (RT-PCR) -Methode auf den 15 miRNAs ausgewählt deren Expression in der Kardia Region von 10 gesunden Personen bestimmen. Von den Probanden, 60% Männer waren, war das mittlere Alter 39,1 (± 12,8) Jahre und 50% der untersuchten Probanden getestet positiv für H. pylori
nach internationalen Kriterien für die Identifizierung etabliert [12], [13] (Tabelle 2) (weitere Einzelheiten sind in Tabelle S2 zur Verfügung gestellt).

COMPARARISON MIT DGE und RT-PCR

Sowohl Singleplex (RT-PCR) und Multiplex (SOLiD-Plattform) Technologien zeigte eine hohe Expression (Ausdruck über 1.000 liest in der DGE und 7-fach über dem endogenen Kontrolle in der RT-PCR) der 15 miRNAs (4 und 5)

Die gleichen RNA-Proben waren von zwei verschiedenen Plattformen analysiert: DGE und RT-PCR - Life Technologies.. Die Ergebnisse wurden Experimente verglichen und wurden lineare Regression zwischen 2 ^{-ΔCt und Quadratwurzel lesen Zählerzahl beobachtet. Pearson-Korrelation ist hoch 83,9% mit statistisch signifikanten Test (P < 0,05). Und solide Ergebnisse validiert}

Zusätzlich wurden DGE Ergebnisse im Vergleich zur Quantifizierung des Expressionsbereich der miRNAs in 10 gesunden Probanden, von Echtzeit PCR. Die Regression für durchschnittlich RT-PCR-Assays im Vergleich zu
Quadratwurzel lesen Zählernummer. Pearson-Korrelation ist hoch 68,4% mit statistisch signifikanten Test (P < 0,05).

Könnte miRNAs mit hoher interindividuelle Unterschiede beobachten, für Exempla miR-21, und eine andere mit niedrigen interindividuelle Unterschiede, z.B. Expressionsmuster leicht variabel (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451).

Diskussion

miRNAs regulieren die Mehrheit der menschlichen Gene; jedoch nur wenige miRNAs haben ihre Ziele hatten und spezifische Funktionen identifiziert [14]. In unserer Studie wurde der Magen Proben von einer einzelnen Person ohne Magen Neoplasie oder andere Pre-Neoplasie Bedingungen wie Atrophie, Metaplasie oder Dysplasie erhalten. Präkanzerösen Läsionen wie Gastritis führen zu genomischen Hypomethylierung im Magen, die die Expressionsmuster von miRNAs [15] zu ändern könnte. Die Probe wurde aus dem normalen Gewebe von einem Patienten ohne Krankheitsbilder erhalten, die eine scheinbar normalen Gewebeprobe mit Mikro Invasionen von Frühphasen-tumorigenen Zellen, des Sammelns in der Vermeidung des Risikos half als bei Patienten mit einer der oben genannten Pathologien auftreten könnte.

Diese Studie ist die erste Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierung von miRNAs in der physiologisch normalen menschlichen Magen. Nur 5,06% der miRNAs im Magengewebe identifiziert wurde bereits in anderen Geweben nachgewiesen und in der Bioinformatik Datenbanken wie microRNA.org katalogisiert [10]. Wir erwarten, dass diese Gruppe von miRNAs Regulatoren der Housekeeping-Gene zu sein, die in menschlichen Geweben reichlich vorhanden sind. Eine weitere 7,84% der miRNAs hatte keine Spiele in den miRNA-Expressionsdatenbanken und könnte miRNAs, die spezifisch auf das Verdauungssystem oder Magen.

Ähnliche Studien wurden mit anderen normalen Geweben durchgeführt, wie der Mund, Rachen darstellen, Speiseröhre, des Anus und Darm. Wir verglichen diese Daten mit unseren miRNA Expressionsdaten der Expressionsmuster des Magengewebes zu definieren. Wir fanden hohe Expressionsniveaus in 15 miRNAs, von denen 13 bereits identifiziert worden waren, wie hoch in anderen Geweben exprimiert.

Die Expression von miR-148a und miR-192 war in anderen normalen und kanzerösen menschlichen Geweben identifiziert worden ist, aber nicht überexprimiert. MiR-192 war bereits in gastrointestinalen Geweben wie den Dickdarm, Ileum, Duodenum, Dünndarm, Magen, Bauchspeicheldrüse und der Leber [16] festgestellt. Basale Expression von miR-148a wurde in Bindegewebe und endokrine Gewebe [17] beobachtet. Vor kurzem wurde mir-148a gefunden in Nabelschnurblutzellen unterdrückt werden [18] und durch Hypermethylierung in Kolontumore zum Schweigen gebracht [19]. Wir beobachteten eine hohe Expression des Mir-200-Cluster (a und b) in Kardia wie in den Langerhans'schen Inseln beobachtet [11]. In einem Mikroarray-Experiment, miR-200a und miR-200b wurden in niedrigen Konzentrationen in gastrointestinalen Geweben nachgewiesen, sondern auf einem hohen Niveau in den Dickdarm, Magen und Pankreas [16]. Eine kürzlich veröffentlichte microRNA Ausdruck Atlas zeigte, dass diese miRNA zu endokrinen Gewebe charakteristisch ist [17]. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die geringe Expression des Mir-200-Cluster mit Ovarialkarzinom korreliert ist [19], [20]. Daher kann das miR-200-Cluster in der Aufrechterhaltung der Integrität von Verdauungs Geweben wie Kardia wichtig sein, da eine solche hohe Expression die Expression von E-Cadherin hochreguliert, das Protein für die Organisation der Architektur des Epithelgewebes. Darüber hinaus sind die Ergebnisse stark eine wichtige Rolle der miR-200-Familie in der Unterdrückung der epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und die Progression von Krebs vorgeschlagen [21].

Tabelle 1 und 2 zeigen die Anzahl der mögliche Ziele für jeden stark exprimiert reifen miRNA. Tabelle 2 zeigt einige Ziele von miRNAs durch die TargetScan gegen Familien von konservierten miRNAs vorhergesagt. Mit Ausnahme von miR-451, die alle mindestens zwei anderen Genziele geteilt. Die Gene ANKD52
und UBN2
, sind Ziele von zehn der vierzehn miRNAs analysiert, während das Gen TNRC6B
von neun miRNAs ist, und die Gene EPS15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6
und PTPRD DD6
, sind Ziele von acht miRNA. Dieses Ergebnis legt nahe, dass diese miRNAs sind starke Kandidaten in Cardia Region zum Schweigen gebracht werden. Die experimentelle Validierung dieser Gene, durch eine Analyse der Funktion eines jeden folgte die physiologische Rolle dieser miRNAs in normalem Magengewebe offenbaren.

Viele miRNAs kann die Translation von Proteinen regulieren, die in Gewebeproliferation wirken und Gewebemuster wie mir-200a (die Integrin-Ziel kann) und mir-145 (die mit ErbB4
mRNA interagieren kann). Viele vorhergesagten mRNA Ziele wurden gefunden, um mehrere hoch exprimiert miRNAs üblich zu sein. Zum Beispiel kann die HTR4
(5-Hydroxytryptamin [Serotonin] Rezeptor) und AFF2
mRNAs ( AF4 /FMR2
Familie, member 2) vorhergesagt wurden Ziele zu sein 13 der 15 am höchsten exprimierten miRNAs. Weitere fünf mRNAs, einschließlich IGF-1 | (Insulin-like growth factor 1 [Somatomedin C]), wurden gemeinsame prognostizierten Ziele von 12 miRNAs. Acht miRNAs hatte 222 vorhergesagt Ziele gemeinsam; So wurde beispielsweise miR-29b vorhergesagt 196 davon zu zielen. Fünf miRNAs (19b, 29a, 29b, 29c und 148a) geteilt 70 Ziele vorhergesagt, von denen einige ( CDK6
, PTEN
, IGF1
, FRS2
, PDGFRA
, PIK3R1
und MXD1
) regulieren die zelluläre Proliferation und Tumorunterdrückung.

Mehrere Beobachtungen miRNAs zu Krebs verknüpfen. Zuerst werden viele miRNAs in zellulärer Proliferation und Apoptose beteiligt sind. Zweitens sind viele miRNA-Loci in fragilen Stellen des menschlichen Genoms, die Regionen, die in der menschlichen Neoplasien häufig verstärkt oder gelöscht werden und verursachen große Unterschiede in der miRNA-Expression im Vergleich zu normalen Geweben [21], [22], [23], [24 ].

das Real Time PCR-Technik als zeigt den höchsten Ausdruck der SOLiD-Plattform identifiziert 15 miRNAs bestätigt (die relative Quantifizierung verwendet) (4 und 5) (die auf absolute Zahlen basiert). Daher können diese miRNAs betrachtet werden als überexprimiert [25], [26], [27], [28]. Die Korrelation zwischen DGE und RT-PCR-Assays war klar und statistisch signifikant. Und könnte DGE Experiment repräsentativ für Gewebe aus 10 Gesundheitsthemen Magenproben isoliert betrachtet werden und ein Teil der Expressionsmuster des gesunden Magen-Gewebe definieren.

Die Ergebnisse beider Methoden zeigen, dass miRNA-21 der am stärksten zum Ausdruck gebracht wurde in Kardia Gewebe. Diese miRNA wird auch in anderen menschlichen Geweben (zB dendritische Zellen, T-Zellen, Bauchspeicheldrüse) verteilt und könnte bei der Regulierung der Expression von Housekeeping-Genen ( ATPAF1
, KIF3A
, CYBRD1
).

Die SOLiD-Plattform zeigte, dass miR-192 und 148a zu Magen-Gewebe spezifisch sind. Darüber hinaus bestätigte Real Time PCR, dass diese miRNAs überexprimiert. Somit Insgesamt sind diese miRNAs wahrscheinlich die Expression von Genen im Zusammenhang mit Magen-Gewebe-Homöostase regulieren. Daher könnte die niedrigen Expressionsniveaus dieser miRNA zur Entwicklung eines Magens Neoplasie in Beziehung gesetzt werden. Die mögliche Verwendung von miRNA-192 und miRNA-148a als Risikomarker bei Magenkrebs könnte am besten durch die Analyse der miRnomes von verschiedenen histologischen Arten von Magenkrebs untersucht werden.

die regulatorischen Prozesse zu verstehen, die im menschlichen Handeln Magen wird im Kampf gegen Magenkrebs wichtig sein, die weltweit die zweithäufigste Ursache der Krebssterblichkeit ist.

Materialien und Methoden

BIOLOGISCHE MATERIAL

die Kardia ist eine mikroskopische Zone, die normalerweise in dem proximalsten Teil des Magens nahe dem Speiseröhrenöffnung (Cardia oder Cardia) und enthält die kardialen Drüsen gefunden wird. Unsere frischen Gewebeprobe für die ultratiefe Sequenzierung wurde aus einer Gastroskopie Biopsie gewonnen (~ 4 mm ^{3). Der Patient war 33 Jahre alt, ohne Anzeichen von Krebs und einer normalen gastro-Kreuzung. Die makroskopische Beobachtung des Gewebes keine Hinweise auf Läsionen zeigten, und eine histologische Untersuchung bestätigt normalen und gesunden Bedingungen.}

Um die Ergebnisse der ultratiefe Sequenzierung, Cardia Proben, in der Nähe von Cardia, 10 hinaus gesunden Personen bestätigen waren auch durch endoskopische Biopsien erhalten (~ 4 mm ^{3) und nach histologischer Untersuchung ohne Auffälligkeiten wurden analysiert durch Real Time PCR. H. pylori
wurde Infektion basierend auf dem typischen Aussehen des Bakteriums entlang der Schleimschicht diagnostiziert die Magenschleimhaut abdeckt Antrum Biopsien für die Histologie-Bewertung wurden aufgrund der höheren Dichte der Bakterien in Magenantrum und der ausgezeichneten Empfindlichkeit dieser Diagnosemethode nach internationalen Kriterien für die Identifizierung etabliert [12], [13] (weitere Einzelheiten sind in Tabelle S2 zur Verfügung gestellt).}

ETHIK STATEMENT

Eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Patienten erhalten wurde, und die Studie wurde von dem Comité de Ética em Pesquisa (CEP) von Hospital Universitario João Barros Barreto (HUJBB) genehmigt -. Bundesuniversität von Pará (UFPA) (Protokollnummer 14052004 /HUJBB)

miRNA BIBLIOTHEK

die Gesamt kleine RNA wurde aus dem Probengewebe erhalten die Mirvana Isolation Kit (Ambion Inc., USA) verwendet wird. Die Konzentration und Qualität wurden mit einem Nanodrop 1000 Spektrophotometer bestimmt, und die Reinigung und Größenauswahl wurden unter Verwendung von 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Verwendung des Fest Small RNA Expression Kit (Ambion Inc., US), 200 ng von kleinen RNA von 150-200 bp wurden als Templat verwendet, um die miRNA-Bibliothek zu erhalten. Alle miRNAs der Bibliothek wurden mit einzigartigen und spezifischen Amplifikationsprimer markiert, als Barcode-System bekannt (Life Technologies, CA, US). Dann wurden 50 pg der Bibliothek wurde in der gleichen Konzentration mit sieben anderen miRNA Bibliotheken gepoolt. unter Verwendung von PCR-Emulsion Eine Fraktion der Bibliothek Becken (0,1 pg) wurde an magnetische Kügelchen verstärkt und fixiert. Das ePCR Produkt wurde auf einem einzigen Objektträger aufgebracht und auf dem Multiplex-SOLiD-Sequenzierungsreaktion unterzogen.

SOLiD ULTRA-deep sequencing und Datenanalyse

Das SOLiD (Version 2.0) Sequenzierungssystem (Life Technologies) wurde verwendet, um generieren liest, dass 35 bp lang waren. Der zweite Schritt war die Barcode zu dekodieren, wobei jeder Wulst-Sequenz mit der Identität der Probe entsprechen. Alle kleinen RNA-Sequenzen von Kardia sind in der NCBI-Sequenzen Archiv lesen (SRA012099) zur Verfügung. Die Sequenzanalyse wurde mit der SOLiD-System Small RNA-Analyse-Tool (Life Technologies) und MiRanalyzer durchgeführt [8]. Zuerst gefiltert wir alle Sequenzen aus, die RNA-Verunreinigungen abgestimmt wie tRNA, rRNA, DNA-Wiederholungen und Adaptermoleküle. Nach Ausschluss der Verunreinigung liest, ausgerichtet wir alle Sequenzen gegen miRNA Vorläufer-Sequenzen (miRBase ver. 12) und dann enthalten nur das liest, dass abgestimmte reifen miRNA-Sequenzen [9]. Zum Vergleich wurden diese Expressionsdaten mit denen von anderen menschlichen Geweben, miRNA-Expressionsdaten aus der microRNA.org Datenbank importiert, und die Expression von jeder reifen miRNA durch die Gesamtlesezählung normalisiert wurde [10]. Grafische Analyse wurde mit Genepattern ausgeführt ^{10. Die miRNA-biologischen Prozess Beziehungen wurden unter Verwendung von miRNApath (http://lgmb.fmrp.usp.br/mirnapath/tools.php) vorhergesagt.}

miRNA Real Time PCR (Validation)

Biopsy Proben von Kardia Gewebe wurden von 10 gesunden Patienten gesammelt. Nach der Entnahme wurden die Proben sofort verarbeitet und bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion gelagert. Gesamt-RNA wurde durch Homogenisieren von 40 mg gefrorenem Gewebe extrahiert, gefolgt von der RNA-Isolierung von TRIzol-Reagenz (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Konzentration und die Qualität der miRNAs wurden mit einem Nanodrop 1000 Spektrophotometer (; Nanodrop Technologies, Wilmington, DE ND-1000) bestimmt. Die Gesamt-RNA wurde revers transkribiert eine TaqMan MicroRNA @ Reverse Transkription-Kit (Life Technologies).

Die Analyse von miRNAs Ebenen wurde auf einem 7500 durchgeführt Real-Time PCR-System (Life Technologies) mit TaqMan miRNA-Assays gemäß der Anweisungen des Herstellers (Life Technologies) unter Verwendung der Primer mit Primer Express (Life Technologies) entwickelt. Die mittlere Expressionsniveau von drei humanen endogenen Kontrollen (Z30, RNU19 und RNU6B - Kalibratoren). Wurde als interne Kontrolle in allen miRNA Experimenten verwendet für den Vergleich der Expression Ergebnisse zu ermöglichen

Die hohe Expression von miRNAs identifiziert durch ultratiefe Sequenzierung (in absteigender Reihenfolge: miR-29c, miR-21, miR-148a, miR-29a, miR-24, miR-29b, miR-192, miR-451, miR-145, miR-31, miR-200a, miR-19b, miR-200b, let-7b und miR-26a) wurden mit den TaqMan miRNA-Assays (Life Technologies) validiert. Diese Analysen wurden verwendet, um die Expression von reifen miRNAs zu messen und die interindividuelle Unterschiede in den 10 Proben von gesunden Cardia Gewebe. Die Expressionsdaten jeder reifen miRNA wurden dem Expressionsniveau der drei humanen endogenen Kontrollen bedeuten normalisiert (Z30, RNU19 und RNU6B). Die relativen miRNA Expressionsniveaus wurden dann durch den Vergleichsschwellenzyklus (Ct) Verfahren (2 ^{-ΔCt) berechnet. Die Korrelation Test wurde unter Verwendung von Pearson-Methode (SPSS v.12) durchgeführt.}

Hintergrundinformationen
Tabelle S1.
Identität und Fülle Daten für alle bekannten miRNAs in SOLiD-Sequenz-Datensatz in menschlichen Magen und miRamda Datenbank
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013205.s001
(0,44 MB PDF)
Tabelle S2.
Beschreibung und RT-PCR-Ergebnisse von 10 Proben von gesunden Personen durch endoskopische Biopsien erhalten. Die Proben Größe ist etwa ~ 4 mm3. Für alle Proben wurden eine histologische Untersuchung und H. pylori-Nachweis durchgeführt
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013205.s002
(0,03 MB XLS)

Acknowledgments

Die Autoren durch D. Calcagno und S. Demaschki für ihre Kommentare, Ideen und hilft.

• PLoS ONE: Der Weg zu einem Mans Liebe geht durch den Magen: Was Pferde
• PLoS ONE: Auswirkungen eines Energy Drink auf der Struktur des Magens und des Pankreas von Albino-Ratte: Kann Omega-3 Geben Sie einen Schutz