PLOS ONE: Secuenciación ultraprofundas revela el patrón de expresión de microARN del estómago humano

Extracto

Antecedentes

Mientras que los microRNAs (miRNAs) juegan un papel importante en la diferenciación de tejidos y en el mantenimiento de la fisiología básica, poco se sabe acerca de los niveles de expresión de los genes miARN en el tejido del estómago. Las alteraciones en el perfil miARN pueden conducir a una desregulación de células, lo que puede inducir a la neoplasia.

Metodología /Principales conclusiones

Una pequeña biblioteca de ARN de tejido del estómago fue secuenciado usando de alto rendimiento de la tecnología de secuenciación sólido. Se obtuvieron 261.274 calidad lee con coincidencias perfectas a la miRnome humana, y se identificaron 42% de miRNAs conocidos. Gen Digital perfiles de expresión (DGE) se realizó sobre la base de la abundancia de lectura y demostró que quince miRNAs fueron altamente expresado en el tejido gástrico. Posteriormente, la expresión de estos miRNAs se validó en 10 individuos sanos por RT-PCR mostró una correlación significativa de 83,97% (P < 0,05). Seis miRNAs mostraron un patrón variable de expresión (miR-29b, MIR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451) y podrían considerarse parte del patrón de expresión del tejido gástrico sano.

Conclusiones /Importancia

Este estudio tuvo como objetivo validar los perfiles normales miARN de tejido gástrico humano para establecer un perfil de referencia para las personas sanas. La determinación de los procesos reguladores que actúan en el estómago será importante en la lucha contra el cáncer gástrico, que es la segunda causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo

Visto:. Ribeiro-dos-Santos A, AS Khayat, Silva Un , Alencar DO, J Lobato, Luz L, et al. (2010) La secuenciación ultra profundas revela el patrón de expresión de microARN del estómago humano. PLoS ONE 5 (10): e13205. doi: 10.1371 /journal.pone.0013205

Editor: Patrick Tan, Duke-Universidad Nacional de Singapur Escuela de Medicina de Graduados, Singapur

Recibido: 30 Marzo, 2010; Aceptado: September 8, 2010; Publicado: 8 Octubre 2010

Derechos de Autor © 2010 Ribeiro-dos-Santos et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. El trabajo fue apoyado por el proyecto Genoma Paraense de Genómica e Proteómica (Governo do Pará /SEDECT /FAPESPA), PROPESP /UFPA, FADESP y CAPES (Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Recientemente, Friedman et al.
de 2009 demostró que la mayoría de los genes humanos están bajo el control de miRNAs. El > se conservan 45.000 genes miARN sitios objetivo dentro 3'UTRs humanos, y > 60% de los genes codificantes de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener a los emparejamientos miRNAs [1]. miRNAs son secuencias, no codificantes pequeña de 17 a 25 pares de bases que regulan la expresión de genes mediante la unión con el extremo 3 'de ARNm diana, dando como resultado la inhibición de la traducción de los ARNm [2], [3]. Aproximadamente 14.000 miRNAs se han identificado en animales, plantas y hongos [4], [5], [6]

Los mecanismos que involucran miRNAs como reguladores negativos de la expresión génica son similares en animales y plantas.; que regulan los procesos celulares fundamentales [6]. En los seres humanos, aproximadamente el 3% de todos los genes se prevé que codifican los genes miARN precursores, y más de > 60% de los genes codificantes de proteínas podría ser regulada por miRNAs [1]. MiRNAs tienen funciones esenciales en muchos procesos celulares tales como el crecimiento y el desarrollo, la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis. En consecuencia, las alteraciones en la expresión de los genes miARN contribuyen a enfermedades humanas como el cáncer [7], [8].

Las alteraciones en los patrones de expresión de genes miARN se han observado en muchos tipos de cáncer humano, como el de mama, colon, pulmón, próstata, leucemia y cánceres de estómago. alteraciones de expresión de miRNA conducen a una pérdida o ganancia de función y se asocian con el desarrollo de la neoplasia humana a través de diversos mecanismos [5].

A continuación, presentamos un estudio genético de los genes miARN del estómago humano, porque a pesar de la importancia del órgano, están disponibles en su presencia y regulación en los seres humanos pocos datos genéticos. Este trabajo es la primera secuenciación completa miRnome de tejido del estómago normal utilizando la tecnología de secuenciación de próxima generación.

Resultados

En el presente estudio, los perfiles se obtuvieron mediante secuenciación ultra profundas utilizando la plataforma sólido ( Life Technologies, CA, US). Este es el primer estudio que utiliza este procedimiento para describir el miRnome de tejido gástrico normal. miRNAs fueron aisladas de mucosa normal de cardias gástrico de un solo paciente sano. Los perfiles se validaron utilizando PCR en tiempo real para determinar la expresión de los 15 miRNAs más altamente expresado en otros 10 pacientes sanos.
Secuenciación

secuenciación ultra profunda

ultraprofundas arrojó un total de 104 millones en bruto lee y lee 5 millones para la biblioteca miARN cardias gástrico. Para un análisis más detallado, 3.200.000 lecturas fueron seleccionados de acuerdo con la secuencia de calidad (al menos QV≥10 en las primeras 10 bases) [8]. Después de recuento de la cartografía de éstos con el genoma humano (versión 19), el total mapeado leyó fue 2.534.490 millones de lecturas (75% de la calidad total lee). Aproximadamente el 38% de los 2,5 millones lee (963.460 lecturas) fueron secuencias de ADN repetitivas, tRNA, rRNA o otras moléculas pequeñas; fueron aceptadas 10% (261.274) lee, perfectamente alineada con la madurez miRNAs conocidos (versión miRBase 15, suelte 04/2010) [9]; y el resto de la lee (52%) fueron emparejados con secuencias del genoma (Figura 1).

Para el análisis de la expresión de miRNAs, sólo lee con fósforos para madurar secuencias miRNAs (261.274 lecturas) fueron incluidos. En cardias gástrico, se identificaron 404 de 970 secuencias conocidas madura miARN (42%). Para analizar la expresión de miRNAs, se definieron cinco rangos: de 1 a 10 conteos de lectura; 11-100; 101 a 1000; 1.001 a 5.000; y un recuento de lectura de más de 5,000 (Figura 2) (Mayores detalles se proporcionan en la Tabla S1). La primera gama (1-10) comprendía 40% de los miRNAs observados; la segunda gama (11 a 100) compuesto por 26%; la tercera gama (101 a 1000) comprendía 20%; y los intervalos de cuarta y quinta (> 1.000 recuento de lecturas) había 14%

Con esta clasificación, 347 maduras miRNAs se expresaron entre el primer y tercer rangos y 57 entre los rangos de cuarto y quinto.. Para la caracterización de la miRnome, se seleccionó un conjunto de los 15 miRNAs que se expresaron en los niveles más altos (≥1,000 lecturas).

La Tabla 1 y la Figura 3 lista de los 15 miRNAs maduros identificados en el cardias gástrico humano . El mapa de calor de la Figura 4 se resume la expresión de estos 15 miRNAs en el cardias gástrico y en todos los tejidos humanos normales, los datos de la DGE, disponible en el banco de datos microRNA.org [10], [11]. la expresión de los genes miARN maduro podría clasificarse en dos grupos: i) cardias-tejidos: miRNAs rara vez se expresan en otros tejidos, pero expresada en cardias gástrico, incluyendo el miR-148a, miR-192, miR-200a y miR-200b; ii) casi en todas partes: miRNAs expresa en muchos tejidos y condiciones, incluyendo el miR-29c, miR-21, miR-24, miR-29b, miR-29a, miR-451, miR-31, miR-145, miR-26a , miR-19b y let-7b.

PCR en tiempo real

los resultados de la secuenciación ultra profundas se validaron utilizando el método de los 15 miRNAs seleccionados para singleplex PCR en tiempo real (RT-PCR) determinar su expresión en la región del cardias gástrico a partir de 10 individuos sanos. De los sujetos de prueba, el 60% eran varones, la edad media fue de 39,1 (± 12,8) años y el 50% de los sujetos estudiados dio positivo por H. pylori
, de acuerdo con los criterios internacionales establecidos para su identificación [12], [13] (Tabla 2) (Mayores detalles se proporcionan en la Tabla S2).

COMPARARISON CON DGE y RT-PCR

Tanto tecnologías singleplex (RT-PCR) y multiplex (plataforma sólida) mostraron alta expresión (expresión sobre 1000 lee en el DGE y 7 veces por encima del control endógeno en la RT-PCR) de los 15 miRNAs (Figuras 4 y 5)

Las mismas muestras de ARN fueron analizadas por dos plataformas diferentes: DGE y RT-PCR - Life Technologies.. Los resultados de los experimentos se compararon y se observaron regresión lineal entre 2 ^{-ΔCt y raíz cuadrada del número de recuento de leer. correlación de Pearson es elevado 83,9% con la prueba estadística significativa (P < 0,05). y validó resultados sólidos}

Además, los resultados DGE se compararon con la cuantificación de la gama de expresión de los miRNAs en 10 sujetos sanos, por Real Time PCR. La regresión de la media de los ensayos de RT-PCR frente
raíz cuadrada del número de recuento de leer. correlación de Pearson es elevado 68,4% con la prueba estadística significativa (P < 0,05).

se pudo observar miRNAs con alta variación interindividual, por exempla miR-21, y otro con baja variación interindividual, por ejemplo, patrón de expresión ligeramente variable (miR-29b, MIR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451).

Discusión

miRNAs regulan la mayoría de los genes humanos; Sin embargo, sólo unos pocos miRNAs han tenido sus objetivos y funciones específicas identificadas [14]. En nuestro estudio, la muestra de estómago se obtuvo de un solo individuo, sin neoplasia del estómago u otras condiciones pre-neoplásicas tales como la atrofia, metaplasia o displasia. lesiones precancerosas como la gastritis ventaja a genómico hipo-metilación en el estómago que podrían modificar el patrón de expresión de miRNAs [15]. La muestra se obtiene a partir del tejido normal de un paciente sin ninguna patología, que ayudó a evitar el riesgo de la recogida de una muestra de tejido aparentemente normal con micro-invasiones de células tumorigénicas en fase inicial como podría ocurrir en pacientes con cualquiera de las patologías anteriores.

Este estudio es la primera secuenciación ultra-alto rendimiento de miRNAs en el estómago humano fisiológicamente normal. Sólo 5,06% de miRNAs identificados en tejido gástrico ya se había detectado en otros tejidos y catalogado en bancos de datos de bioinformática como microRNA.org [10]. Esperamos que este grupo de miRNAs a ser los reguladores de los genes de limpieza, que son abundantes en los tejidos humanos. Otro 7,84% de miRNAs no tenía coincidencias en las bases de datos de expresión de genes miARN y podría representar miRNAs que son específicos para el sistema digestivo o el estómago.

Estudios similares se han realizado con otros tejidos normales, tales como la boca, la faringe, esófago, el ano y el intestino. Se compararon estos datos con los datos de expresión de los genes miARN para definir el patrón de expresión del tejido del estómago. Se encontraron niveles elevados de expresión de miRNAs 15, 13 de las cuales ya habían sido identificados como altamente expresado en otros tejidos.

La expresión de miR-148a y miR-192 había sido identificado en otros tejidos humanos normales y cancerosas, pero no fue expresado sobre. Mir-192 ya se había detectado en los tejidos gastrointestinales, tales como el colon, el íleon, duodeno, intestino delgado, estómago, páncreas y el hígado [16]. La expresión basal de miR-148a se ha observado en el tejido conectivo y tejido endocrino [17]. Recientemente, se descubrió que el miR-148a a ser reprimidos en las células sanguíneas del cordón umbilical [18] y silenciados por hipermetilación en los tumores de colon [19]. Se observó alta expresión de la agrupación mir-200 (A y B) en cardias gástrico como se observa en los islotes de Langerhans [11]. En un experimento de microarrays, se detectaron miR-200a y miR-200b en niveles bajos en los tejidos gastrointestinales, pero en niveles altos en el colon, estómago y páncreas [16]. Un microARN recientemente publicados de expresión atlas mostraron que este miARN es característica para el tejido endocrino [17]. Recientes hallazgos muestran que la baja expresión de la agrupación mir-200 se correlaciona con el cáncer de ovario [19], [20]. Por lo tanto, el clúster mir-200 puede ser importante en el mantenimiento de la integridad de los tejidos digestivos tales como cardias gástrico porque tal alta expresión regulado hasta la expresión de E-cadherina, la proteína responsable de la organización de la arquitectura del tejido epitelial. Además, los resultados sugieren fuertemente un papel importante de la familia de miR-200 en la represión de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la progresión del cáncer [21].

Tablas 1 y 2 muestran el número de posibles objetivos para cada uno madura miARN altamente expresado. La Tabla 2 muestra algunos de los objetivos de miRNAs predicho por el TargetScan contra las familias de miRNAs conservadas. Con la excepción de miR-451, todos compartían al menos otros dos genes blancos. Los genes ANKD52
y UBN2
, son blanco de diez de los catorce miRNAs analizados, mientras que el gen TNRC6B
es de nueve miRNAs, y los genes EPS15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6
y PTPRD DD6
, son objetivos de los ocho miARN. Este resultado sugiere que estos miRNAs son fuertes candidatos a ser silenciados en la región del cardias. La validación experimental de estos genes, seguida de un análisis de la función de cada uno puede revelar el papel fisiológico de estos miRNAs en el tejido gástrico normal.

Muchos miRNAs pueden regular la traducción de proteínas que actúan en la proliferación de tejidos y patrón de tejido tal como miR-200a (que puede dirigirse a la integrina) y miR-145 (que puede interactuar con ERBB4
ARNm). Se encontraron muchos mRNA objetivos previstos para ser común a varios miRNAs altamente expresados. Por ejemplo, el HTR4 gratis (5-hidroxitriptamina [serotonina] receptor) y AFF2
ARNm ( AF4 /FMR2
familia, elemento 2) se prevé que ser objetivos de 13 de los 15 miRNAs más altamente expresados. Otros cinco mRNAs, incluyendo IGF-1
(factor de crecimiento similar a la insulina 1 [somatomedina C]), fueron objetivos previsto comunes de 12 miRNAs. Ocho tenían miRNAs 222 objetivos previsto en común; por ejemplo, mir-29b se predijo para apuntar 196 de éstos. Cinco miRNAs (19b, 29a, 29b, 29c y 148a) compartieron 70 predijeron objetivos, algunos de los cuales ( CDK6
, PTEN
, IGF1
, FRS2
, PDGFRA
, PIK3R1
y mxd1
) regular la proliferación celular y la supresión de tumores.

Varias observaciones vinculan miRNAs con el cáncer. En primer lugar, muchos miRNAs están involucrados en la proliferación celular y la apoptosis. En segundo lugar, muchos loci de genes miARN se encuentran en sitios frágiles del genoma humano, regiones que se amplifican con frecuencia o se eliminan en las neoplasias humanas y causan grandes diferencias en la expresión de los genes miARN en comparación con los tejidos normales [21], [22], [23], [24 ].

la técnica de PCR en tiempo real (que utiliza cuantificación relativa) confirmó 15 miRNAs identificados como que muestra la expresión más alta por la plataforma sólido (que se basa en números absolutos) (figuras 4 y 5). Por lo tanto, estos miRNAs pueden ser considerados como siendo sobre-expresado [25], [26], [27], [28]. La correlación entre DGE y los ensayos de RT-PCR fue clara y estadística significativa. Y el experimento DGE podía considerarse representativa de los tejidos muestras gástricas aisladas de 10 temas de salud y definen parte del patrón de expresión del tejido gástrico sano.

Los resultados de ambas metodologías indican que los genes miARN-21 era el más altamente expresado en el tejido cardias gástrico. Este miARN se distribuye también en otros tejidos humanos (por ejemplo, las células dendríticas, células T, páncreas) y podría estar implicada en la regulación de la expresión de los genes de limpieza ( ATPAF1
, KIF3A
, CYBRD1
).

La plataforma sólida mostraron que el miR-192 y 148a son específicos de tejido gástrico. Además, PCR en tiempo real confirmó que estos miRNAs se expresan sobre-. Por lo tanto, en general, estos miRNAs es probable que regulan la expresión de genes relacionados con la homeostasis del tejido gástrico. Por lo tanto, los niveles de expresión bajos de estos miRNAs podrían estar relacionadas con el desarrollo de una neoplasia del estómago. El uso potencial de los genes miARN-192 y miRNA-148a como marcadores de riesgo en el cáncer gástrico podría ser mejor investigadas a través del análisis de los miRnomes de diferentes tipos histológicos de cáncer gástrico.

La comprensión de los procesos reguladores que actúan en el ser humano estómago será importante en la lucha contra el cáncer gástrico, que es la segunda causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo.

Materiales y Métodos

MATERIAL BIOLÓGICO

el cardias gástrico es una zona microscópica que se encuentra normalmente en la porción más proximal del estómago, cerca de la abertura esofágica (orificio cardiaco o cardias) y contiene las glándulas cardíacas. Nuestra muestra de tejido fresco para la secuenciación ultra profundo se obtuvo a partir de una biopsia de gastroscopia (~ 4 mm ^{3). El paciente tenía 33 años de edad, sin evidencia de cáncer y una unión gastroesofágica normal. observación macroscópica del tejido no mostró evidencia de lesiones, y el examen histológico confirmó condiciones normales y saludables.}

Para confirmar los resultados de la secuenciación ultra profundas, las muestras cardias, orificio cardiaco cerca del 10 Además, los individuos sanos fueron también obtienen mediante biopsias endoscópicas (~ 4 mm ^{3) y, después de un examen histológico excluyendo anomalías, se analizaron mediante PCR en tiempo real. H. pylori
infección se diagnostica basándose en el aspecto típico de la bacteria a lo largo de la capa de moco que cubre la membrana mucosa gástrica se tomaron biopsias antrales, para evaluación histología debido a la mayor densidad de las bacterias en el antro gástrico y a la excelente sensibilidad de este método de diagnóstico , de acuerdo con los criterios internacionales establecidos para su identificación [12], [13] (Mayores detalles se proporcionan en la Tabla S2).}

ÉTICA DECLARACIÓN

escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes, y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética em Pesquisa (CEP) del hospital Universitario João Barros Barreto (HUJBB) -. Universidad Federal de Pará (UFPA) (Protocolo número 14052004 /HUJBB)

miARN BIBLIOTECA

el ARN pequeño total se obtiene a partir de la muestra de tejido utilizando el kit de aislamiento de mirVana (Ambion Inc., US). La concentración y la calidad se determinaron usando un espectrofotómetro Nanodrop 1000, y la purificación y la selección de tamaño se realizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 6%. Utilizando el sólido Small RNA Kit Expresión (Ambion Inc., US), 200 ng de ARN pequeño de 150 a 200 pb se utilizó como plantilla para obtener la biblioteca miRNA. Todos los miRNAs de la biblioteca fueron marcados con cebadores de amplificación únicas y específicas, conocidas como el sistema de código de barras (Life Technologies, CA, US). Entonces, 50 pg de la biblioteca se agruparon con otros siete bibliotecas miARN a la misma concentración. Una fracción de la piscina de la biblioteca (0,1 pg) se amplificó y se fija en perlas magnéticas utilizando PCR en emulsión. El producto ePCR fue depositado en una sola diapositiva y se somete a la reacción de secuenciación SóLIdAS múltiplex.

SóLIdAS SECUENCIA ultraprofundas Y ANÁLISIS DE DATOS

El (versión 2.0) sistema de secuenciación sólido (Life Technologies) se utilizó para generar lee que eran 35 pb de longitud. El segundo paso fue para decodificar el código de barras, coincidiendo con cada secuencia de talón con la identidad de la muestra. Todas las pequeñas secuencias de ARN de cardias gástrico están disponibles en el NCBI secuencias Lee Archive (SRA012099). El análisis de secuencia se realizó usando el Sistema SóLIdAS herramienta pequeña ARN Análisis (Life Technologies) y MiRanalyzer [8]. En primer lugar, filtrados todas las secuencias de ARN que coincidían con los contaminantes tales como ARNt, ARNr, repeticiones de ADN y moléculas adaptadoras. Después de excluir contaminante lee, que se suman todas las secuencias en contra de las secuencias de precursores miARN (miRBase ver. 12) y, a continuación sólo se incluyeron las lecturas que las secuencias de genes miARN maduro emparejados [9]. Para comparar estos datos de expresión con los de otros tejidos humanos, los datos de expresión de genes miARN fueron importados de la base de datos microRNA.org, y la expresión de cada uno de los genes miARN maduro se normalizó por recuento de lecturas totales [10]. Análisis gráfico se ha realizado mediante GenePattern ^{10. Las relaciones de proceso miARN-biológica se prevé utilizar miRNApath (http://lgmb.fmrp.usp.br/mirnapath/tools.php).}

miARN PCR en tiempo real (validación)

Biopsia muestras de tejidos cardias gástrico se obtuvieron de 10 pacientes sanos. Después de la recogida, las muestras fueron procesadas inmediatamente y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de ARN. El ARN total se extrajo por homogeneización de 40 miligramos de tejido congelado, seguido de aislamiento de ARN por el reactivo TRIzol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La concentración y la calidad de miRNAs se determinaron usando un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (ND-1000; NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). El ARN total se sometió a transcripción inversa utilizando un TaqMan @ kit MicroARN transcripción inversa (Life Technologies).

El análisis de los niveles de miRNAs se realizó en un sistema de PCR en tiempo real 7500 (Life Technologies) con ensayos TaqMan miARN de acuerdo con la instrucciones del fabricante (Life Technologies) utilizando cebadores diseñados con Primer Express (Life Technologies). La media del nivel de expresión de los tres controles humanos endógenos (Z30, RNU19 y RNU6B - calibradores). Se utilizó como control interno en todos los experimentos miARN para permitir la comparación de los resultados de la expresión

Los altos niveles de expresión de miRNAs identificados por secuenciación ultra profundas (en orden descendente: MIR-29c, miR-21, miR-148a, miR-29a, miR-24, miR-29b, miR-192, miR-451, miR-145, miR-31, miR-200a, miR-19b, miR-200b, let-7b y miR-26a) se validaron con los ensayos TaqMan miARN (Life Technologies). Estos análisis se utilizan para medir los niveles de expresión de miRNAs maduros y la variación interindividual en las 10 muestras de tejido sano cardias. Los datos de expresión de cada uno de los genes miARN maduros se normalizaron a la media del nivel de expresión de los tres controles endógenos humanos (Z30, RNU19 y RNU6B). Los niveles relativos de expresión de los genes miARN Luego se calcularon por el método comparativa ciclo umbral (Ct) (2 ^{-ΔCt). prueba de correlación se realizó mediante el método de Pearson (SPSS v.12).}

Apoyo a la Información sobre Table S1. Identidad y datos de abundancia para todos los miRNAs conocidos en Solid secuencia de datos en el estómago humano y la base de datos de miRamda
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013205.s001 gratis (0.44 MB PDF) sobre Table S2.
Descripción y resultados de RT-PCR de 10 muestras de personas sanas obtenidas por biopsias endoscópicas. el tamaño de las muestras es de unos ~ 4 mm3. Para todas las muestras se llevaron a cabo un examen histológico y la detección de H. pylori
doi:. 10.1371 /journal.pone.0013205.s002 gratis (0.03 MB XLS)

Reconocimientos

La D. autores gracias Calcagno y S. Demaschki por sus comentarios, ideas y ayuda.

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