LIM homeodomänen transkriptionsfaktor Isl1 styr normal pyloric utveckling genom att rikta Gata3

LIM homeodomänen transkriptionsfaktor Isl1 dirigerar normal pyloric utveckling genom att rikta Gata3 Bild Sammanfattning
Bakgrund
Abnormalities i pyloric utveckling eller i kontraktil funktion av pylorus orsaken återflöde av duodenala innehåll in i magsäcken och ökar risken för gastrisk metaplasi och cancer. Avvikelser i pyloric regionen är också kopplade till medfödda defekter såsom relativt vanlig neonatal hypertrofisk pylorusstenos, och primära duodenogastric reflux. Därför att förstå pyloric utveckling är av stor klinisk betydelse. Här undersökte vi roll LIM homeodomänen transkriptionsfaktorn Isl1 i pyloric utveckling.
Resultat
Undersökning av Isl1 uttryck i att utveckla mus mage genom immunhistokemi, hela montera in situ
hybridisering och realtid kvantitativ PCR demonstreras att Isl1 uttrycks kraftigt i att utveckla mus mage, huvudsakligen i den glatta muskelskiktet av pylorus. Isl1 uttryck undersöktes också genom immunofluorescens i human hypertrofisk pylorusstenos där majoriteten av glatta muskelceller befanns uttrycka Isl1. Isl1
funktion i embryonal magen utveckling undersöktes med användning av en tamoxifen-inducerbar Isl1
knockout musmodell. Isl1
brist ledde till nästan fullständig frånvaro av pyloric yttre längsgående muskelskiktet på embryonala dag 18,5, vilket är förenligt med Gata3
null mus fenotyp. Kromatin immunoprecipitation, luciferasanalyser, och elektroforetiska mobilitetsförskjutningsanalyser avslöjade att Isl1 säkerställer normala pyloric utveckling genom att direkt rikta Gata3
.
Slutsatser
Denna studie visar att den Isl1-Gata3
transkriptionsreglerande axel är avgörande för normal pyloric utveckling. Dessa resultat är mycket kliniskt relevant och kan bidra till att bättre förstå vägar som leder till pyloric sjukdom.
Nyckelord
α-glatt muskulatur aktin Gata3 Isl1 Pylorus Bakgrund
ryggradsdjur tarmen är en anmärkningsvärd struktur som intar och smälter maten, absorberar näringsämnen och avlägsnar slaggprodukter. Tarmen kommer från en enkel rörformig struktur med tre germinallager inklusive en underliggande endoderm, ett omgivande splanchnicus mesoderm och en ektoderm [1-3]. I musembryon, blir tarmen mönstrade längs den främre-bakre, dorsal-ventral, vänster-höger, och radiella axlar. Tarmen röret består av foregut, midgut och hindgut längs dess främre-bakre axeln [4, 5]. Som utvecklingen fortskrider, ger foregut upphov till matstrupen, magen, levern, lungorna och pankreas. Midgut bildar tunntarmen och hindgut utvecklas till tjocktarmen [1, 5-8].
Magsäcken är härledd från den bakre foregut. Magen skiljer morfologiskt från foregut röret runt embryonala dag 9,5 (E9.5) och utbyggnaden av pre-gastrisk mesenkym tillåter domänen i magen för att vara synlig början på E10.5 [9]. Mesenkymala celler i magen differentierar till fyra distinkta koncentriska lager, inklusive lamina propria, muscularis slemhinnor och cirkulära och longitudinella glatta muskulaturen i olika stadier av embryonal utveckling [10]. Genom E11.5, är magen tydligt förstorade. Magen glatt muskulatur skiljer på E13, med en distinkt skikt av α-glatt muskulatur aktin (α-SMA) -positiva celler som förekommer och en cirkulär muskelskiktet bildar hela magen [11]. Den glatta muskulaturen skiktet blir tjockare i den förträngda blivande pyloric sphincter regionen vid omkring E14.5 [2, 9]. Vid E18.5, börjar pyloric sphincter att fungera till att förhindra återflöde av duodenala innehållet i magsäcken [9].
Bakre eller pylorus del av magsäcken är den anatomiska förbindelsen mellan magsäcken och tolvfingertarmen. Vid terminalen av pylorus, kan de distinkta klaff flikar pyloric sphincter ses [2]. Under normala fysiologiska betingelser, magsäcken beror på dess peristaltisk kontraktion att mala och stack den delvis smält mat, och pylorus förlitar sig på sin förtjockade pyloric sphincter för att styra flödet av mat in i tunntarmen. Avvikelser i pyloric utveckling eller i den kontraktila funktion av pylorus orsaka återflöde av duodenala innehåll in i magsäcken och ökar risken för gastrisk metaplasi och cancer [12, 13]. Avvikelser i pylorus är relaterade till medfödda defekter [14-16]. Därför har mycket uppmärksamhet ägnats åt reglerelement och vägar magen utveckling, särskilt pylorus och pyloric sphincter utveckling.
Tidigare uppgifter i chick föreslog att benmorfogenetiskt protein (BMP) signalering reglerar mesenkymala uttryck för Nkx2.5
och Sox9
, som påverkar karaktären av pyloric epitel men har ingen effekt på pyloric glatt muskulatur [5, 17], vilket tyder på att mesenkymala signalering av okända faktorer påverkar pyloric epitel fenotypen. I mus är molekylära mekanismer för pyloric formation lite förstås, med relativt få av de faktorer som krävs för normal pyloric utveckling har identifierats. De som har varit inkluderar Sox9
[17], Six2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], och Gata3
[19, 20]. Ablation av homeodomänen transkriptionsfaktorn, Six2
, uttryckt i bakre mage, stör förtjockning av pyloric glatt muskulatur lagret och dämpar sammandragning av pylorus sfinktern. Dessutom, förlust av Six2
eliminerar Sox9
uttryck, och minskar Nkx2.5 Mössor och Gremlin
uttryck i pylorus, även om detta uttryck återhämtar senare [9], vilket tyder på att Six2
, Sox9
, Nkx2.5
och Gremlin
krävs för pyloric utveckling. Dessutom Nkx2.5
, Sox9
och Gata3
samuttrycks i den dorsala pyloric yttre längsgående muskel (OLM) skikt som förfaller mellan E14.5 och E16.5. Efter strykningen av Nkx2.5
eller Gata3
är nästan frånvarande rygg pyloric OLM och sammandragning av pylorus sfinktern dämpas [20].
LIM homeodomänen (LIM-HD) transkriptionsfaktor Isl1 var ursprungligen fann att fungera som en insulingenen enhancer bindande protein [21]. Isl1 består av två tandem LIM-domäner och en homeodomän. Homeodomänen, med sin helix-sväng-helix struktur, binder till reglerande DNA-sekvenser av målgener, medan LIM-domäner är huvudsakligen involverade i protein-proteininteraktioner som reglerar aktiviteten av LIM-HD [22]. Isl1 spelar kritiska roller i cellbestämning, proliferation och differentiering i nervsystemet [23, 24], hjärta [25], och hypofysen [26]. Dessutom har Isl1 expression detekterats i gastrisk mesenkym [27, 28] och gastrointestinal epitel i både embryonala och vuxna möss [29]. Men roll Isl1 i magen utveckling har ännu inte utforskas. I föreliggande studie undersökte vi Isl1 uttryck i magen. Isl1 var mycket uttryck i den bakre magen i ett tidigt utvecklingsskede och främst begränsad till glatta muskelceller i pylorus. För att undersöka Isl1
funktion i magen utveckling, vi utnyttjade en tamoxifen-inducerbar knockout musmodell. En inducerbar modell behövdes eftersom Isl1 - /- Paket mutanter dö ungefär E10.5 på grund av defekter i hjärtbildning. Våra resultat visar att Isl1 är avgörande för bildandet av pyloric OLM skiktet under magen organogenes.
Resultat
Isl1 uttrycks i embryonala mus magen
Vi undersökte Isl1
mRNA-nivåer i embryonala mus magen av real- tid kvantitativ PCR (RT-qPCR) och hela montera in situ
hybridisering (WISH). Isl1
mRNA ursprungligen upptäcktes vid E11.5 med RT-qPCR. Isl1
nådde den högsta nivån på E13.5, följt av en kraftig nedgång på E14.5 och hade inga signifikanta förändringar i vuxen ålder (Ytterligare fil 1: Figur S1A). Detta resultat var liknande en tidigare rapport [29]. Lokaliseringen av Isl1
mRNA-uttryck undersöktes med användning av WISH. Vi utförde Isl1
WISH i embryonala magen vid E11.5, E13.5 och E14.5. Vid E11.5, var Isl1
lokaliserad till den bakre halvan av magsäcken (Ytterligare fil 1: Figur S1B). Men var Isl1
WISH signal mycket starkare och kondenseras i pylorus av E13.5 (Figur 1A). Som magen utveckling fortskred, pylorus fortsatte att uttrycka Isl1 Mössor och uttryck av Isl1
utvidgas till blivande pyloric sphincter vid E14.5 (Ytterligare fil 1: Figur S1B). Men försvagade Isl1
WISH signal avsevärt från E13.5 till E14.5. Dessa Isl1
WISH resultat instämde med Isl1
RT-qPCR resultat. Figur 1 Isl1 uttrycks i att utveckla mus mage. (A) Embryonala magen WISH-analys visade att Isl1
expression var begränsad till pylorus vid E13.5 (pil). (B) Immunhistokemisk färgning för Isl1 i magen. Sektioner från embryon arrangerades i rostralt stjärtfenan sekvens vid E11.5 och E13.5 och Isl1 uttryck huvudsakligen lokaliserad till mesenkym av den bakre magen. Vid E14.5 och E18.5 ades Isl1 högt uttryckt i glatta muskelceller i pylorus, även om det fanns vissa Isl1-positiva celler i lamina propria (pilhuvuden). Förstorade bilder i boxed regioner visas nedan originalbilderna. D, tolvfingertarmen; Liv, lever; Pa, pankreas; St, mage. Skala barer av ursprungliga bilder 100 pm; skala stänger av förstorade bilder. 50 pm
Vi bedömde då Isl1 proteinuttryck genom immunhistokemi. Resultat visade att Isl1 huvudsakligen var lokaliserad till den bakre magen mesenkymet från E11.5 till E13.5, då Isl1 uttrycktes i glatta muskelceller i pylorus (Figur 1B och Ytterligare fil 1: Figur S1C), och var också detekterbar i lamina propria (Figur 1B, pilspetsar). I vuxen mus mage, var bara ett fåtal Isl1-positiva celler observerades i den glatta muskelskiktet. (Ytterligare fil 1: Figur S1C) Review Isl1-positiva celler samuttrycks med α-glatt muskulatur aktin i embryonala mus mage
för att se om Isl1 uttryck var relaterad till glatt muskulatur utvecklingen av pylorus undersökte vi uttrycket av Isl1 och tidigaste glatt muskulatur markör α-SMA med hjälp av immunofluorescens. Resultaten visade att proportionen av Isl1-positiva celler som uttrycker α-SMA gradvis ökade (Figur 2). Vid E11.5 har inga α-SMA-positiva celler detekteras även Isl1 var mycket uttryck i mesenkym av den bakre magen. Vid E14.5, en delmängd av Isl1-positiva celler, främst de i det inre cirkulära muskel (ICM) i pylorus, var α-SMA positiv. Genom E16.5 har pyloric OLM redan genomgått differentiering [20]. Vid E18.5, majoriteten av Isl1-positiva celler i pylorus var α-SMA positiva. Isl1 uttryck kvarstod i mogen pyloric ICM och OLM, och lamina propria-celler uttryckte också Isl1 (Ytterligare fil 1: Figur S2). Dessutom var Isl1 uttryck undersöktes i humana prover av hypertrofisk pylorusstenos genom immunofluorescens, och resultaten visade att Isl1 också uttrycktes i humana glatta muskelceller från pylorus (Ytterligare fil 1: Figur S3). Därför antyder dessa resultat att Isl1 får delta i bildandet av pyloric sphincter. Figur 2 Dubbelimmunfärgning för Isl1 och α-glattmuskelaktin i mus glatta muskelceller av den dorsala pylorus. Isl1 och α-SMA co-uttryck i glatta muskelceller vid E11.5, E14.5 och E18.5. Gula streckade linjer markerar det epiteliska basalmembranet, vita tjocka streckade linjerna indikerar ICM och OLM gräns, och vita streckade linjerna indikerar OLM och bukspottkörteln gräns. Rödfärgning är Isl1, grön färgning a-SMA, och DAPI nukleära motfärgning (DNA) är blå. α-SMA, α-glatt muskulatur aktin; ICM, inre cirkulär muskel; OLM, yttre längsgående muskel; Pa, pankreas; St, mage. Skala barer. 50 pm
Isl1 uttryck effektivt ablation i Isl1
MCM /F
-inducerbara knockoutmöss
att undersöka effekterna av Isl1
ablation på magen utveckling, utnyttjade vi Isl1
MCM /F
-inducerbara Cre (Isl1
MCM /Del
) möss (Figur 3A) och Isl1
F /+ m
is var användes som kontroller [30, 31]. Embryon genotypades genom PCR vid E18.5 (Ytterligare fil 1: Figur S4) och intakt eller mutant Isl1
mRNA särskiljas genom semikvantitativ PCR (figur 3B). Figur 3 Effektivitet av Isl1 ablation i magar Isl1 MCM /Del mutant mus magar vid E18.5. (A) Tamoxifen-inducerbara Cre rekombinas utskurna DNA-sekvenser flankeras av två loxP
platser. (B) Isl1
RNA-nivåer var borttagen i Isl1
MCM /Del
muterade magar som ses av semi-kvantitativ PCR. Isl1
F /+ m
is visade en 592 baspar produkt medan Isl1
MCM /Del
möss genererade en 303 baspar produkt. (C) Isl1 var betydligt nedregleras på proteinnivåer i Isl1
MCM /Del
muterade magar som visas genom Western blöt. Expression av embryon vid E11.5 användes som positiv kontroll. (D) Isl1 proteinuttryck i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
embryonala pylorus. Isl1 uttryck reducerades signifikant i Isl1
MCM /Del
embryonala magar, som ses av immunofluorescens. Bilder i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
bearbetades på samma glas och fotograferades på samma exponering. Förstorade bilder av de inramade områdena visas på den högra sidan av de sammanslagna bilderna. Gula pilspetsar visar representativa Isl1-positiva celler, och vita pilspetsar visar representativa Isl1-negativa celler. Gula streckade linjer markerar det epiteliska basalmembranet. Skala barer. 50 pm
Western blot analyser visade att Isl1 proteinnivåer i embryonala mage Isl1
MCM /Del
möss var betydligt lägre än i Isl1
F /+ m
is (figur 3C). Immun resultat visade signifikant minskade Isl1 färgning i pylorus av Isl1
MCM /Del
möss jämfört med kontroller (Figur 3D). Dessa data visar att Isl1
uttryck var effektivt nedregleras i Isl1
MCM /Del
muterade magar
pyloric avvikelser i Isl1
MCM /F
mutanter <. Br> för att undersöka effekterna av Isl1
ablation på magen utveckling, jämförde vi morfologiska och histologiska skillnader mellan Isl1
MCM /Del Mössor och Isl1
F /+ s
tomachs vid E18.5. Vid E18.5 var gul vätska observerades i Isl1
MCM /Del
magar men inte i magen på Isl1
F /+ l
ittermates (Figur 4A, asterisk) . Histologisk undersökning visade att rygg pyloric glatt muskulatur lagret var mycket tunnare i pylorus av Isl1
MCM /Del
möss jämfört med kontroller (Figur 4B). Vi undersökte uttryck och distribution av α-SMA i både Isl1
MCM /Del
mutanter och Isl1
F /+ p
ylorus. Immun resultat visade att Isl1 brist ledde till nästan total avsaknad av pyloric OLM skiktet vid E18.5 och kvarvarande celler löst organiserade (figur 5A, asterisker). Dessutom har sammandragning av pyloric sphincter dämpas i Isl1
MCM /Del
muterade magar jämfört med förträngning i Isl1
F /+ s
tomachs (Figur 5B) . Dessutom analyserade vi uttryck av den glatta muskulaturen specifikt protein Calponin-1 vid E18.5 och immunfluorescens Resultaten visade att förlust av Isl1 resulterade också i nära frånvaro av Calponin-1 uttryck i rygg pyloric OLM skikt, liknande resultat med α- SMA (Ytterligare fil 1: Figur S5). Sox9 uttrycks i både epitel och mesenkym [9] och krävs för utveckling av OLM och bildandet av pyloric sphincter sammandragning [20]. Våra immunofluorescens Resultaten visade att Sox9 kvar på normala nivåer i magen epitelet i Isl1
MCM /Del
möss vid E14.5 och E18.5 (Figur 6, pilspetsar), men området av pylorus glatta muskulaturen uttrycker Sox9 reducerades signifikant i Isl1
MCM /Del
mutanter vid E14.5 (Figur 6A, asterisker) och frånvarande vid E18.5 (Figur 6B, asterisker). Således var Isl1
krävs för Sox9
expression i dorsala pyloric OLM celler. Dessa resultat indikerar att Isl1 är kritisk för att reglera utveckling av mus pyloric glatt muskulatur. Figur 4 morfologiska och histologiska förändringar i utvecklings mage Isl1 MCM /Del mutanter. (A) Gross och mikroskopiska bevis för magen defekter i Isl1
MCM /Del
möss. Hela montera synpunkter på E18.5 i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
mus magar. Isl1
MCM /Del
muterade magar saknade en funktionell pyloric sphincter (pilspets), varigenom återflöde av vätska som observerats i muterade embryon. Gul vätska betecknas med asterisk. (B) Hematoxylin och eosin färgning av Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
mus pylorus vid E18.5. Rygg pyloric glatt muskulatur (svart inramade region) var framträdande i Isl1
F /+ e
mbryos, men var mycket tunnare i Isl1
MCM /Del
embryon. Resten av pylorus histologiskt normalt. Gröna streckade linjer markerar det epiteliska basalmembranet. Förstorade bilder i boxed regioner visas nedan originalbilderna. Skala barer i originalfoton: 200 pm; skala stänger av förstorade bilder: 50 um. H &. E, hematoxylin och eosin
Figur 5 Förlust av Isl1 stör bildandet av rygg pyloric yttre längsgående muskel. (A) Immunofluorescens av Isl1 och α-SMA i Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
embryonala pylorus vid E18.5. Förlust av Isl1 resulterade i nästan fullständig förlust av a-SMA-positiva celler i rygg pyloric OLM (asterisker). Gula streckade linjer markerar det epiteliska basalmembranet och vita streckade linjerna indikerar ICM och OLM gräns. Rödfärgning är Isl1, grön färgning a-SMA, och DAPI nukleära motfärgning (DNA) är blå. Skalstrecken: 50 ^ M. (B) α-SMA immunofluorescens av Isl1
F /+ en
nd Isl1
MCM /Del
embryonala pylorus vid E18.5. Jämfört med Isl1
F /+ e
mbryos, pyloric sphincter sammandragning var bredare i Isl1
MCM /Del
djur. Sphincter sammandragning mätningar visas. Gula barer avgränsa pylorus och markera den tydliga skillnaden i bredd mellan Isl1
F /+ A
nd Isl1
MCM /Del
prover. Data är medelvärde ± SEM (n
= 6 möss per grupp), * P
< 0,05 (Students t
-test). Skalstrecken: 50 ^ M. α-SMA, α-glatt muskulatur aktin; ICM, inre cirkulär muskel; OLM, yttre längsgående muskel.
Figur 6 Förlust av Isl1 eliminerar dorsala pyloric yttre längsgående muskel Sox9 uttryck. (A) Double immunfärgning för Isl1 och Sox9 i rygg pylorus vid E14.5. I avsaknad av Isl1 var domänen för mesodermala celler (asterisker) som uttrycker Sox9 mindre. (B) Double immunfärgning för Isl1 och Sox9 i rygg pylorus vid E18.5. Inducerbara Isl1 knockout elimineras effektivt Isl1 uttryck, med åtföljande förlust av Sox9 uttryck i rygg OLM-celler (asterisker). Sox9 uttryck var normal i magen epitel vid båda stegen (pilspetsar). Gula streckade linjerna markerar det epiteliska basalmembranet och vita streckade linjer separat ICM och OLM. Rödfärgning är Isl1, är grön färgning Sox9, och DAPI nukleära motfärgning (DNA) är blå. Skalstrecken: 50 ^ M. ICM, inre cirkulär muskel; OLM, yttre längsgående muskel.
Expression och distribution av protein genprodukten 9,5 (PGP9.5), ett enteriska nervsystemet markör [32], var intakt vid E18.5 i Isl1
MCM /Del
muterade magar (Ytterligare fil 1: Figur S6). Pankreatisk och duodenal homeobox-gen 1 (Pdx1) uttrycks i epitelceller i antral-pyloric segmentet och den rostrala duodenum [33]. Våra immunofluorescens Resultaten visade att Pdx1 uttryck var likartad i Isl1
MCM /Del
möss jämfört med kontroller vid E18.5 (Ytterligare fil 1: Figur S7). Dessutom har musen magen och duodenal epitel gräns etableras mellan E14.5 och E16.5 [34], denna period sammanfaller med utvecklingen av OLM skiktet [20]. Vi testade integritet i magen-tunntarmen epitelial pyloric gränsen vid E18.5 genom att undersöka uttrycket av en tarm specifik epitelial markör Cdx2 [19]. Våra immunohistokemi resultat visade att placeringen av epitel pyloric gränsen i Isl1
MCM /Del
möss var liknande den för kontroller (Ytterligare fil 1: Figur S8). Dessa resultat indikerar att förlust av Isl1 inte påverkar innervation eller epitelial utveckling av pylorus.
Förlust av Isl1 påverkar inte proliferation eller apoptos hos pyloric inre cirkulära muskler och yttre längsgående muskelceller
att se huruvida Isl1 expression var relaterad till cellförökning av pylorus undersökte vi samlokalisering av Isl1 och proliferativ markör bromodeoxiuridin (BrdU) med hjälp av immunfluorescens i Isl1
F /+ m
is. Våra resultat visade att BrdU-positiva celler var tät vid E11.5 och utspridda i ICM och OLM regioner på E14.5 och E18.5 (Ytterligare fil 1: Figur S9A). Dessutom var andelen prolifererande ICM och OLM celler inte signifikant mellan Isl1
MCM /Del Mössor och Isl1
F /+ m
is vid E18.5 ( ytterligare fil 1: fig. S9b) Review för att bedöma en potentiell effekt på apoptos, undersökte vi klyvs caspase 3 uttryck på E18.5 och våra immunofluorescens resultaten visade att det inte fanns några kaspas 3-positiva celler i pyloric ICM eller OLM skiktet av Isl1
MCM /Del Mössor och Isl1
F /+ m
is (Ytterligare fil 1: Figur S10). Dessa data indikerar att Isl1 ablation inte påverkar proliferation eller apoptos hos pyloric ICM och OLM celler.
Förlust av Isl1 resulterar i minskad expression av Gata3
, Gremlin
och Nkx2.5
sedan ett antal faktorer, bland annat Bapx1
[18], Barx1
[35], Gata3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] och Six2
[9], har rapporterats vara inblandade i regleringen av pyloric utveckling, undersökte vi effekterna av förlust av Isl1 på uttrycket av dessa gener på E14.5 och E18.5. RT-qPCR Resultaten visade att förlust av Isl1
inte påverkar uttrycket av Bapx1
eller Barx1
antingen E14.5 eller E18.5 (Figur 7A, B). Vid E18.5, α-SMA Mössor och Six2
mRNA-nivåer var signifikant lägre i Isl1
MCM /Del
möss jämfört med kontroller (Figur 7B). Vid både E14.5 och E18.5, Nkx2.5
, Gata3
och Gremlin
mRNA-nivåer i magen hos Isl1
MCM /Del
möss var lägre än kontroller (figur 7A, B). Gata3
mRNA-nivåer var ungefär 70% minskade vid båda undersökta stadier (figur 7A, B). Baserat på dessa resultat, vi undersökte Isl1
, Gata3
, Gremlin
och Nkx2.5
uttryck i Isl1
MCM /F
mutant och Isl1
F /+ s
tomachs använder önskan. Resultaten visade att uttryck av var och en av dessa gener var i huvudsak begränsad till pyloric regionen, som väntat; Gata3
uttryck mer reduceras muterade magar; och Gremlin Mössor och Nkx2.5
bara hade subtila förändringar (Figur 7E, F). Isl1 Mössor och Gata3
uttryck var starkast påverkas (figur 7C, D). Dessa resultat överensstämde med RT-qPCR uppgifter och föreslår att Isl1 reglerar uttrycket av Gata3
, Gremlin
och Nkx2.5
. Figur 7 Aberrant genuttryck i hindstomach i Isl1 MCM /Del mutanter. (A) RT-qPCR analys av mRNA-nivåer av hindstomach berikad transkriptionsfaktorer vid E14.5 indikerar signifikant minskning av α-SMA
, Six2 Nkx2.5
, Gata3
och Gremlin
mRNA i Isl1
MCM /Del
muterade magar (n
= 4). Alla resultat normaliserades till nivåer av GAPDH
mRNA. (B) RT-qPCR-analys av mRNA-nivåer av hindstomach berikad transkriptionsfaktorer vid E18.5 indikerar en betydande minskning av Nkx2.5
, Gata3
och Gremlin
mRNA i Isl1
MCM /Del
muterade magar (n
= 4). Alla resultat normaliserades till nivåer av GAPDH
mRNA. Data är medelvärde ± SEM (n = 6
möss per grupp). * P Hotel < 0,05 kontra Isl1
F /+
; ** P Hotel < 0,01 kontra Isl1
F /+
(Students t
-test). (CF) WISH mRNA-analys bekräftade förlust av Isl1
, Gata3
, Gremlin
och Nkx2.5
mRNA-uttryck vid E14.5 i Isl1
MCM /Del
mutant magar. Gata3
mRNA Isl1 Köpa och var allvarligt nedregleras i Isl1
MCM /Del
möss, medan Gremlin Mössor och Nkx2.5
uttryck minskade något. Pilarna pekar pyloric sphincter.
Isl1 mål och aktiverar dess transkription
Gata3
selektivt uttrycks i pylorus i utvecklings musembryo [19, 20] Gata3
. Uttryck av både Isl1
och Gata3
mRNA observerades i pylorus vid E14.5, men huruvida Gata3 och Isl1 uttrycks i samma celler har inte undersökts. Därför undersökte vi uttrycket av Isl1 och Gata3 genom immunofluorescens analyser. Resultaten visade att Isl1 och Gata3 proteiner samuttrycktes i samma celler i pylorus vid E14.5 och E18.5 i Isl1
F /+ c
KONTROLL magar (Figur 8). Dessutom området som uttrycker Gata3 var signifikant mindre i Isl1
MCM /Del
mutant pyloric glatt muskulatur skiktet vid E14.5 (Figur 8A) och det var förlorat vid E18.5 i pyloric OLM skiktet (figur 8B). Således var Isl1
krävs för Gata3
expression i den dorsala pyloric OLM skiktet. För att undersöka om Isl1 reglerar pyloric utveckling genom att direkt reglera Gata3
utförde vi bioinformatik analys av Gata3 iska locus. Musen Gata3
genen innehåller flera förmodade Isl1 responselement (ATTA /TAAT) vid -2,832 baspar (bp) och 1002 bp från transkriptions initieringsställen [37]. Vi identifierade 10 områden som innehöll en förmodad Isl1 bindningsställe (Figur 9A), och 10 par motsvarande primers utformades för att förstärka dessa regioner efter kromatin immunoprecipitation (chip) studier där man använt antikropp mot Isl1. Immunoutfälldes genomiskt DNA erhölls från pyloric regioner av musembryon vid E14.5. Av de 10 förmodade Isl1 bindningsområden, två separata områden, i -2558 bp till -2303 bp (P1 region) och -1081 bp till -855 bp (P6 region), ockuperades av Isl1 protein. Detta resultat bekräftades genom semikvantitativ PCR (Figur 9B) och faldig anrikning metoden (figur 9C). Figur 8 Förlust av Isl1 eliminerar dorsala pyloric yttre längsgående muskel Gata3 expression. (A) Double immunfärgning för Isl1 och Gata3 i rygg pylorus vid E14.5. Regionen mesodermala celler (asterisker) som uttrycker Gata3 var mindre i Isl1
MCM /Del
pylorus än Isl1
Fl +
. (B) Double immunfärgning för Isl1 och Gata3 i rygg pylorus vid E18.5. Inducerbara Isl1 knockout elimineras effektivt Isl1 uttryck, med åtföljande förlust av Gata3 uttryck i rygg OLM-celler (asterisker). Gula streckade linjer markerar det epiteliska basalmembranet och vita streckade linjerna anger ICM och OLM gräns. Vit pilspets indikerar icke-specifik färgning. Rödfärgning är Isl1, är grön färgning Gata3, och DAPI nukleära motfärgning (DNA) är blå. Skalstrecken: 50 ^ M. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• En ovanlig orsak av gastrointestinala phytobezoars: diospyros lotus
• Transkriptionsfaktom FOXO4 nedregleras och hämmar tumörtillväxt och metastaser i gastric cancer