LIM homeodoména transkripčný faktor Isl1 riadi normálny pyloric vývoj zacielením Gata3

LIM homeodoména transkripčný faktor Isl1 riadi normálny vývoj pyloru zacielením Gata3
abstraktné
pozadia
Abnormality v vrátnika vývoji, alebo kontrakcie funkciu pyloru spôsobujú refluxom dvanástnika obsahu do žalúdka a zvyšuje riziko žalúdočné a metaplázia rakovina. Abnormality pylorické regióne sú tiež spojené s vrodenými vadami, ako sú pomerne bežné novorodeneckej hypertrofickou pylorostenózy, a primárne duodenogastrický refluxu. Preto pochopenie pyloric vývoj má veľký klinický význam. Tu sme skúmali úlohu MEZ homeodoména transkripčný faktor Isl1 v pylorických vývoji.
Výsledky
vyšetrení Isl1 prejavu v rozvojových myši žalúdku imunohistochémia, celej hore in situ hybridizácia stroje a real-time kvantitatívne PCR preukázali že Isl1 je vysoko exprimovaný vo vyvíjajúcej sa myšou žalúdka, najmä v hladkej svaloviny pyloru. Isl1 expresia bola tiež skúmaná imonufluoreskujúca v ľudskej hypertrofické pylorostenózy, kde bolo nájdené väčšina buniek hladkého svalstva vyjadriť Isl1. Isl1
funkcie v embryonálnom vývoji žalúdku bola skúmaná použitím tamoxifen-indukovatelný Isl1
modelu knockout myši. Isl1
nedostatok vedie k takmer úplnej absencii pyloru vonkajšie pozdĺžne svaloviny na embryonálny deň 18,5, čo je v súlade s Gata3
null myšou fenotyp. Chromatínu immunoprecipitation, luciferázové testy a elektroforetické testy posun mobility odhalilo, že Isl1 zaistí normálny vývoj pyloric priamo cielenie Gata3
.
Závery
Táto štúdia ukazuje, že Isl1-Gata3
transkripcie regulačné os je zásadné pre normálny pyloric vývoj. Tieto zistenia sú veľmi klinicky významné a môže pomôcť lepšie pochopiť cesty, ktoré vedú k pyloric ochorenia.
Kľúčové
α-aktínu hladkého svalstva Gata3 Isl1 pyloru pozadí
stavovec čreva je pozoruhodný štruktúra, ktorá požije a trávia potravu, absorbuje živiny, a odstraňuje odpadové produkty. Črevo pochádza z jednoduchú rúrkovou konštrukciu zloženú z troch zárodočných vrstiev, vrátane podkladového endoderm, obklopujúce splanchnic mezodermu, a ectoderm [1-3]. V myšiach embryí, črevo stane vzorom pozdĺž predozadný, chrbtová, brušné, vľavo-vpravo, a radiálnych osí. Črevo trubica sa skladá z foregut, črevá a zadného čreva pozdĺž jej predozadná osi [4, 5]. Ako vývoj postupuje, foregut vedie k pažeráka, žalúdka, pečene, pľúc a pankreasu. Črevá, tvoria tenké črevo a zadné tráviaci trakt sa vyvinie do hrubého čreva [1, 5-8].
Žalúdok je odvodený zo zadného foregut. Žalúdok morfologicky odlišuje od foregut trubice okolo embryonálny deň 9,5 (E9.5) a expanzia pred žalúdočnej mezenchymu umožňuje doménou žalúdka, aby bola viditeľná na začiatok E10.5 [9]. Mezenchýme bunky žalúdka diferencujú na štyroch odlišných sústredných vrstiev, vrátane lamina propria, svalové mukózy, a kruhové a pozdĺžne hladkého svalstva v rôznych fázach embryonálneho vývoja [10]. Tým E11.5, žalúdok je výrazne rozšírený. Žalúdok hladký sval rozlišuje na E13, so zreteľnou vrstvou a-aktínu hladkého svalstva (α-SMA) pozitívne bunky sa objavujú a kruhového svalovej vrstvy tvoriaci celom žalúdka [11]. Hladkého svalstva vrstva zahusťuje v zúženom prospektívnej pyloru zvierača oblasti pri teplote asi E14.5 [2, 9]. V E18.5 je pyloru zvierača začne fungovať v prevencii refluxu dvanástnikových obsahu do žalúdka [9].
Zadné alebo pyloru časti žalúdka je anatomická spojenie medzi žalúdka a dvanástnika. Na konci pyloru, odlišné chlopňové chlopne pyloru zvierača možno vidieť [2]. Za normálnych fyziologických podmienok, žalúdok je závislá na peristaltické kontrakcie rozomlieť a ťah čiastočne stráveného jedla a pyloru opiera o zosilnenú pyloru zvierača na reguláciu prietoku potravín do tenkého čreva. Abnormality pyloru vývoja alebo v kontraktilné funkcie pyloru spôsobiť reflux dvanástnikových obsahu do žalúdka a zvyšuje riziko žalúdočné metapláziu a rakoviny [12, 13]. Abnormality pyloru súvisí s vrodenými vadami [14-16]. Z tohto dôvodu, veľká pozornosť bola venovaná regulačných prvkov a ciest vývoja žalúdka, najmä pylorus a pylorického vývoj zvierača.
Predchádzajúce údaje mláďa navrhol, že kostnej morfogenetické proteín (BMP) signalizácia reguluje mezenchýme expresiu Nkx2.5
a Sox9
, ktorá má vplyv na charakter pyloric epitelu, ale nemá žiadny vplyv na pyloric hladkej svaloviny [5, 17], čo naznačuje, že mezenchýme signalizáciu neznámymi faktory ovplyvňujú pyloric epitelu fenotyp. U myší, molekulárne mechanizmy pyloru formácie sú málo rozumie, s relatívne málo z faktorov potrebných pre ktoré boli identifikované v normálnej pyloric vývoj. Tie, ktoré boli uvedené Sox9
[17], Six2
[9], Bapx1
[18], Nkx2.5
[3, 17], Gremlin
[9], a Gata3
[19, 20]. Ablácia transkripčného faktoru homeodomény, Six2
, vyjadrený v zadnej žalúdku, narúša zosilnenie pylorické hladkej svaloviny a zmierňuje zúženie pyloru zvierača. Okrem toho, strata Six2
odstraňuje Sox9
expresiu, a znižuje Nkx2.5 stroje a gremlin
expresiu v pyloru, aj keď tento výraz neskôr obnoví [9], čo naznačuje, že Six2
Sox9
, Nkx2.5 stroje a Gremlin
sú vyžadované pre pyloru rozvoj. Okrem toho, Nkx2.5
, Sox9 stroje a Gata3
sú spoločne vyjadrené v chrbtovej pyloric vonkajšej pozdĺžny sval (OLM) vrstve, ktorá dozrieva medzi E14.5 a E16.5. V nadväznosti na vypustení Nkx2.5
alebo Gata3
chrbtovej vrátnika OLM je takmer chýba a zúženie pyloru zvierača je zmiernený [20].
Lim homeodoménu (LIM-HD) transkripčný faktor Isl1 bol pôvodne bolo zistené, že fungovali ako inzulínového génu zosilňovacieho väzobný proteín [21]. Isl1 sa skladá z dvoch tandemových LIM domén a homeodomény. Homeodoména, s helix-turn-helix štruktúru, sa viaže na regulačné DNA sekvencie cieľových génov, zatiaľ čo LIM domény sú zapojené najmä na interakciách proteín-proteín, ktoré regulujú aktivitu LIM-HD [22]. Isl1 zohráva kľúčovú úlohu pri určovaní buniek, proliferáciu a diferenciáciu v nervovom systéme [23, 24], srdce [25] a hypofýzu [26]. Okrem toho, Isl1 expresie bola zistená v žalúdku mezenchymu [27, 28] a gastrointestinálnom epitelu v oboch embryonálnych a dospelých myší [29]. Avšak role Isl1 vo vývoji žalúdku ešte musia byť preskúmané. V tejto štúdii sme sa zaoberali Isl1 expresiu v žalúdku. Isl1 bol vysoko exprimovaný v neskoršom žalúdku v raných fázach vývoja a bol predovšetkým obmedzené na bunky hladkej svaloviny v pyloru. Ak chcete skontrolovať Isl1
funkciu vo vývoji žalúdku, sme použili model knockout myši tamoxifén indukovatelný. /- -
Mutanti zomrieť približne E10.5 v dôsledku chýb tvorby srdca, pretože Isl1 bolo potrebné indukovatelný modelu. Naše výsledky ukazujú, že Isl1 je zásadný pre tvorbu pylorické OLM vrstve počas organogenézy žalúdka.
Výsledky
Isl1 je vyjadrená v embryonálnom myšiam žalúdku
Skúmali sme Isl1
hladiny mRNA v embryonálnom myšiam žalúdku v reálnom doba kvantitatívne PCR (RT-qPCR) a celá hora in situ hybridizácia
(chcete). Isl1
mRNA bol pôvodne zistený u E11.5 pomocou RT-qPCR. Isl1
dosiahla najvyššiu úroveň u E13.5, nasledovaný prudkým poklesom na E14.5 a nemá žiadne významné zmeny do dospelosti (ďalší súbor 1: Obrázok S1A). Tento výsledok bol podobne ako predchádzajúce správy [29]. Lokalizácia Isl1
mRNA expresia bola skúmaná s použitím priať. Vykonali sme Isl1
želajú vo embryonálnom žalúdka u E11.5, E13.5 a E14.5. V E11.5, Isl1
bol lokalizovaný do zadnej polovice žalúdka (ďalší súbor 1: Obrázok S1B). Avšak, Isl1
PRIANIA signál bol oveľa silnejší a kondenzuje v pyloru podľa E13.5 (obrázok 1A). Ako vývoj žalúdok postupovala, pylorus aj naďalej vyjadrovať Isl1 stroje a expresiu Isl1
rozšírená na potenciálnemu pyloric zvierača u E14.5 (ďalší súbor 1: Obrázok S1B). Avšak, Isl1
PRIANIA signál značne oslabila z E13.5 do E14.5. Tieto Isl1
WISH výsledky súhlasil s výsledkami Isl1
RT-qPCR. Obrázok 1 Isl1 je vyjadrená v vyvíjajúci sa myší žalúdka. (A) Analýza Embryonálne žalúdka WISH preukázala, že Isl1
expresie bola obmedzená na vrátnika v E13.5 (šípka). (B) Imunohistochemické farbenie na Isl1 v žalúdku. Rezy z embryí boli usporiadané v rostrálnym do chvostovej postupne v E11.5 a E13.5 a Isl1 expresie bola hlavne lokalizovaná do mezenchymu zadného žalúdka. V E14.5 a E18.5, Isl1 bol vysoko exprimovaný v bunkách hladkého svalstva z pyloru, aj keď tam boli niektoré Isl1-pozitívnych buniek v lamina propria (šípok). Zväčšené obrazy v orámovaných oblastiach sú uvedené nižšie originálnych obrazov. D, dvanástorníka; Liv, pečene; Pa, pankreasu; St, žalúdok. Scale tyče originálnych obrázkov: 100 um; mierka tyče zväčšených snímok :. 50 um
sme potom hodnotená expresia Isl1 proteínu imunohistochemicky. Výsledky preukázali, že Isl1 bol lokalizovaný hlavne na zadnej žalúdka mezenchymu z E11.5 do E13.5, potom Isl1 bol vyjadrený v hladkých svalových bunkách pyloru (obrázok 1B a ďalší súbor 1: Obrázok S1C), a bol tiež detekovateľný v lamina propria (obrázok 1B, šípky). U dospelých myší žalúdku, len niekoľko Isl1-pozitívnych buniek bolo pozorované v hladkej svaloviny. (Ďalšie súbor 1: Obrázok S1C)
Isl1-pozitívne bunky sú spoločne exprimované s a-aktínu hladkého svalstva v embryonálnej myší žalúdku
Ak chcete zistiť, či Isl1 výraz bol príbuzný k hladkému vývoju svalu pyloru sme skúmali expresiu Isl1 a najskoršie hladkého svalstva obrysové α-SMA fluorescenčnou metódou. Výsledky ukázali, že podiel Isl1-pozitívnych buniek, ktoré exprimujú α-SMA postupne zvyšuje (obrázok 2). V E11.5, žiadne α-SMA-pozitívnej bunky boli detekované, keď Isl1 bol vysoko exprimovaný v mezenchymu zadného žalúdku. V E14.5, podmnožina Isl1-pozitívnych buniek, a to najmä tie, ktoré vo vnútornom kruhovom svale (ICM) z pyloru, boli α-SMA pozitívnym. Tým E16.5, pyloric OLM už prešla diferenciácie [20]. V E18.5, väčšina Isl1-pozitívnych buniek v pyloru bola α-SMA pozitívnym. Isl1 vyjadrenie pokračoval v zrelé pylorických ICM a OLM a lamina propria bunky tiež vyjadril Isl1 (Ďalší súbor 1: Obrázok S2). Okrem toho, Isl1 expresie bola skúmaná v ľudských vzorkách hypertrofickou pylorostenózy pomocou imunofluorescencie, a výsledky ukázali, že Isl1 bol tiež exprimovaný v ľudských bunkách hladkého svalstva z pyloru (ďalší súbor 1: Obrázok S3). Preto tieto výsledky naznačujú, že Isl1 sa môže podieľať na tvorbe pyloru zvierača. Obrázok 2 Dvojité imunologické pre Isl1 a α-aktínu hladkého svalstva v myších buniek hladkého svalstva chrbtovej pyloru. Isl1 a α-SMA ko-expresie v bunkách hladkého svalstva u E11.5, E14.5 a E18.5. Žlté bodkované čiary označujú epiteliálne bazálnu membránu, biele silné prerušované čiary ukazujú ICM a OLM hranice a biele prerušované čiary ukazujú OLM a pankreasu hranicu. Červené sfarbenie je Isl1, zelené sfarbenie je alfa-SMA a DAPI nukleárnej kontrastným (DNA) je modrá. α-SMA, α-aktínu hladkého svalstva; ICM, vnútorný kruhový sval; OLM, vonkajšie pozdĺžny sval; Pa, pankreasu; St, žalúdok. Scale bary :. 50 um
Isl1 výraz je účinne ablácia v Isl1
ICM /F
-inducible knockout myší
Ku skúmanie účinkov Isl1
ablácia na vývoj žalúdka, sme použili Isl1
ICM /F
-inducible Cre (Isl1

ICM /Del) myší (obrázok 3A) a Isl1
F /+ m
ice boli použité ako kontroly [30, 31]. Embryá bola genotyp PCR pri E18.5 (ďalší súbor 1: Obrázok S4) a intaktnej alebo mutant Isl1
mRNA sa vyznačuje semi-kvantitatívnej PCR (obrázok 3B). Obrázok 3 Účinnosť Isl1 ablácia v žalúdkoch Isl1 ICM /Del mutant myši žalúdkov pri E18.5. (A) tamoxifen indukovatelný Cre rekombinázy, vyreže DNA sekvencie, lemovaný dvoma loxP
miestach. (B) Isl1
hladiny RNA bola ablácia v Isl1
ICM /DEL
mutantov žalúdkov, ako je zrejmé semi-kvantitatívnej PCR. Isl1
F /+ m
ľad ukázala produkt párové 592 báz, zatiaľ čo Isl1
ICM /DEL
myši generované produkt párové 303 báz. (C) Isl1 bola významne down-regulované na úrovni proteínu v Isl1
ICM /DEL
zmutovaných žalúdka, ako je ukázané Western blot. Expresie embryí v E11.5 bol použitý ako pozitívna kontrola. (D) expresie proteínov Isl1 v Isl1
F /+ a
nd Isl1
ICM /Del
embryonálny pyloru. Isl1 expresia bola významne znížená u Isl1
ICM /DEL
embryonálnych žalúdkov, ako je vidieť imonufluoreskujúca. Obrázky v Isl1
F /+ na
nd Isl1
ICM /DEL
boli spracovávané na rovnakom snímke a fotografoval pri rovnakej expozícii. Zväčšené obrazy Oblasti v rámčeku sú uvedené na pravej strane zlúčených obrazov. Žlté šípky ukazujú reprezentatívne Isl1-pozitívne bunky a biele šípky ukazujú reprezentatívne Isl1-negatívne bunky. Žlté bodkované čiary označujú epiteliálne bazálnej membránu. Scale bary :. 50 um
Western blot analýzy ukázali, že hladiny Isl1 proteínu v zárodočnom žalúdku Isl1
ICM /Del
myši boli podstatne nižšie ako v Isl1
F /+ m
ľad (obrázok 3C). Výsledky preukázali imunofluorescenčný výrazne znížila Isl1 farbenie v pyloru z Isl1
ICM /Del
myší v porovnaní s kontrolami (3D obrázok). Tieto údaje ukazujú, že Isl1
výraz bol účinne down-regulované v Isl1
ICM /Del
mutantný žalúdky.
Pyloric abnormality v Isl1
ICM /f
mutantov
Ak chcete skúmať účinky Isl1
ablácia na rozvoj žalúdka, porovnali sme morfologické a histologické rozdiely medzi Isl1
ICM /Del stroje a Isl1
F /+ s
tomachs u E18.5. V E18.5, žltá tekutina bola pozorovaná u Isl1
ICM /Del
žalúdky, ale nie v žalúdkoch Isl1
F /+ l
ittermates (Obrázok 4A, hviezdička) , Histologické vyšetrenie preukázalo, že chrbtová pyloric hladkého svalstva vrstva bola oveľa tenšie v pyloru časti Isl1
ICM /DEL
myší v porovnaní s kontrolami (Obrázok 4B). Skúmali sme expresiu a distribúciu alfa-SMA v oboch Isl1
ICM /Del
mutantov a Isl1
F /+ p
ylorus. Výsledky imunofluorescenčný preukázali, že deficit Isl1 viedlo k takmer úplnej absencii pylorické OLM vrstvy na E18.5 a zvyšné bunky boli voľne organizované (obrázok 5A, hviezdičky). Okrem toho zúženie pyloru zvierača bola zoslabená v Isl1
ICM /Del
mutantný žalúdky, keď v porovnaní s zúženie Isl1
F /+ s
tomachs (obrázok 5B) , Ďalej sme analyzovali expresiu hladkého svalstva špecifický proteín Calponin-1 u E18.5 a imunofluorescenčné výsledky ukazujú, že strata Isl1 tiež za následok takmer neprítomnosti Calponin-1 expresie v dorzálním pyloru OLM vrstvy, podobne ako výsledok s a- SMA (Ďalší súbor 1: Obrázok S5). Sox9 je vyjadrená v oboch epitelu a mezenchymu [9] a je nutná pre vývoj OLM a formovanie pyloru zvierača zúženie [20]. Naše výsledky ukazujú, že imunofluorescenčný Sox9 zostali na normálnu úroveň v žalúdku epitelu Isl1
ICM /DEL
myši na E14.5 a E18.5 (Obrázok 6, šípok), ale oblasť pyloru hladkého svalstva exprimujúce Sox9 bola významne znížená v Isl1
ICM /del
mutantov v E14.5 (obrázok 6A, hviezdička) a chýbajúce u E18.5 (obrázok 6B, hviezdicky). Preto bolo nutné Isl1
pre Sox9
prejavu v chrbtovej pyloru OLM buniek. Tieto výsledky ukazujú, že Isl1 je rozhodujúca pre reguláciu vývoja myší vrátnika hladkého svalstva. Obrázok 4 morfologické a histologické zmeny v rozvojových žalúdok Isl1 ICM /Del mutantov. (A) Gross a mikroskopický dôkaz pre žalúdočné vád v Isl1
ICM /DEL
myšou. Celá montáž pohľady na E18.5 v Isl1
F /+ A
ND Isl1
ICM /DEL
myši žalúdky. Isl1
ICM /Del
mutantný žalúdky postrádal funkčné pyloru zvierača (hrot šípu), čím sa umožní spätný tok tekutiny, ako bolo pozorované v mutantný embryí. Žltá tekutina je označený hviezdičkou. (B) Hematoxylin a eozín farbenie Isl1
F /+ a
nd Isl1
ICM /DEL
myš pylorus na E18.5. Chrbtová pyloric hladkého svalstva (čierna boxoval región) bol prominentný v Isl1
F /+ e
mbryos, ale bol oveľa tenšie Isl1
ICM /DEL
embryí. Zostávajúca časť pyloru histologicky normálna. Zelené bodkované čiary označujú epiteliálne bazálnej membránu. Zväčšené obrazy v orámovaných oblastiach sú uvedené nižšie originálnych fotografií. Scale tyče originálnych fotografií: 200 um; mierka tyče zväčšených obrázkov: 50 um. H &. E, hematoxylín a eozín
Obrázok 5 strata Isl1 narúša tvorbu chrbtovej pyloru vonkajšieho pozdĺžneho svalu. (A) imonufluoreskujúca Isl1 a alfa-SMA v Isl1
F /+ a
nd Isl1
ICM /Del
embryonálny pylorus na E18.5. Strata Isl1 za následok takmer úplnú stratu a-SMA-pozitívnych buniek na chrbtovej pyloru OLM (hviezdičky). Žlté bodkované čiary označujú epitelu bazálnu membránu a biele prerušované čiary ukazujú ICM a OLM hranicu. Červené sfarbenie je Isl1, zelené sfarbenie je alfa-SMA a DAPI nukleárnej kontrastným (DNA) je modrá. Scale bary: 50 um. (B) α-SMA imonufluoreskujúca Isl1
F /+ a
nd Isl1
ICM /Del
embryonálny pylorus na E18.5. V porovnaní s Isl1
F /+ e
mbryos, ktorých pyloru zvierača zúženie bol širší Isl1
ICM /DEL
zvierat. sú zobrazené merania zvierač zúženie. Žlté bary vymedziť pylorus a poukázať na významné odlišnosti v šírke medzi Isl1
F /+ systémom
nd Isl1
ICM /DEL
vzoriek. Údaje sú stredná hodnota ± SEM (n =
6 myší na skupinu), * P Hotel &0,05 (Student t-test
). Scale bary: 50 um. α-SMA, α-aktínu hladkého svalstva; ICM, vnútorný kruhový sval; OLM, vonkajšie pozdĺžny sval.
Obrázok 6 Strata Isl1 eliminuje chrbtovej pyloric vonkajšej pozdĺžny sval Sox9 výraz. (A) Dvojité imunologické pre Isl1 a Sox9 vo chrbtovej vrátnika u E14.5. V neprítomnosti Isl1, doména mesodermálních buniek (hviezdičky) vyjadrujúca Sox9 bol menší. (B) Dvojité imunologické pre Isl1 a Sox9 vo chrbtovej vrátnika u E18.5. Indukovatelná Isl1 knockout účinne eliminované Isl1 výraz, so súčasnou stratou Sox9 expresiu v chrbtovej OLM buniek (skryto). Sox9 výraz bol normálny žalúdočné epitel na oboch stupňoch (šípok). Žlté bodkované čiary označujú epiteliálne bazálnu membránu a biele bodkované čiary oddelený ICM a OLM. Červené sfarbenie je Isl1, zelené sfarbenie Sox9 a DAPI nukleárnej kontrastným (DNA) je modrá. Scale bary: 50 um. ICM, vnútorný kruhový sval; OLM, vonkajšie pozdĺžny sval.
Expresia a distribúcia génového produktu proteín 9,5 (PGP9.5), enterickú nervového systému markeru [32], bol neporušený u E18.5 v Isl1
ICM /Del
mutantný žalúdky (Ďalší súbor 1: Obrázok S6). Pankreasu a dvanástnika homeobox gén 1 (Pdx1) je vyjadrený v epitelových bunkách segmente antrálnej-pyloru a rostrální dvanástnika [33]. Naše výsledky ukázali, že imunofluorescenčný Pdx1 výraz bol podobný Isl1
ICM /Del
myší v porovnaní s kontrolami u E18.5 (ďalší súbor 1: Obrázok S7). Okrem toho, žalúdok myšou a dvanástnikové epiteliálne hranica bola stanovená medzi E14.5 a E16.5 [34], že táto doba sa zhoduje s rozvojom OLM vrstvy [20]. Testovali sme integritu črevnej epitelové pyloric hranicu žalúdka-small pri E18.5 tým, že skúma expresiu črevá špecifické epitelu markeru Cdx2 [19]. Naše výsledky Imunohistochémia ukázala, že poloha epitelu pyloric hraníc v Isl1
ICM /DEL
myší bola podobná ako u kontrol (ďalší súbor 1: Obrázok S8). Tieto výsledky ukazujú, že strata Isl1 neovplyvňuje inervácie alebo epiteliálne vývoj vrátnik.
Strata Isl1 nemá vplyv na proliferáciu alebo apoptózu pyloru vnútorné kruhové svalov a vonkajších pozdĺžnych svalových buniek
Či Isl1 výraz bol súvisiace na proliferáciu buniek z pyloru, sme sa zaoberali spoločnou lokalizáciu Isl1 a proliferačnej markerov bromdeoxyuridinu (BrdU) pomocou imunofluorescencie v Isl1
F /m +
ľadu. Naše výsledky ukázali, že BrdU-pozitívne bunky boli hustá u E11.5 a rozptýlené v regiónoch na E14.5 a E18.5 (ďalší súbor 1: Obrázok S9a) ICM a OLM. Okrem toho je podiel proliferujúcich ICM a OLM buniek výrazne nelíšila medzi Isl1
ICM /Del stroje a Isl1
F /+ m
ľadu na E18.5 ( dodatočné súbor 1 :. Obrázok S9b)
Aby bolo možné posúdiť možný vplyv na apoptózu, sme sa zaoberali štiepi kaspázy 3 výraz v E18.5, a naše výsledky imunofluorescenčný ukázali, nedošlo k žiadnym kaspázy 3 pozitívnych buniek v pyloru ICM alebo OLM vrstve z Isl1
ICM /Del stroje a Isl1
F /+ m
ľad (Ďalší súbor 1: Obrázok S10). Tieto údaje naznačujú, že Isl1 ablácia neovplyvňuje proliferáciu alebo apoptózu pyloric ICM a OLM buniek.
Strata výsledkov Isl1 v znížená expresie Gata3
Gremlin stroje a Nkx2.5
Vzhľadom k tomu, mnohých faktorov, vrátane Bapx1
[18], Barx1
[35], Gata3
[19, 36], Gremlin
[5], Nkx2.5
[2] a Six2
[9], boli hlásené sa podieľa na regulácii pylorických vývoja sme skúmali účinky straty Isl1 na expresiu týchto génov u E14.5 a E18.5. RT-qPCR výsledky ukázali, že strata Isl1
neovplyvnila expresiu Bapx1
alebo Barx1
buď E14.5 alebo E18.5 (7A, B). V E18.5, α-SMA stroje a Six2
hladiny mRNA boli významne nižšie u Isl1
ICM /DEL
myší v porovnaní s kontrolami (obrázok 7b). U oboch E14.5 a E18.5, Nkx2.5
Gata3 stroje a Gremlin
hladiny mRNA v žalúdku Isl1
ICM /DEL
Myši boli nižšie ako ovládacie prvky (Obrázok 7A, B). Gata3
hladiny mRNA boli približne 70% sa znížila na oboch stupňoch skúmaných (7A, B). Na základe týchto výsledkov sme skúmali Isl1
Gata3
Gremlin stroje a Nkx2.5
expresie v Isl1
ICM /F
mutanta a Isl1
F /+ s
tomachs pomocou priať. Výsledky ukázali, že expresia každej z týchto génov bolo obmedzené predovšetkým na vrátnika oblasti, ako sa očakávalo; Gata3
výraz bol viac znížený zmutovaných žalúdky; a Gremlin stroje a Nkx2.5
mal iba drobné zmeny (obr 7E, F). Isl1 stroje a Gata3
výraz bol najviac silne ovplyvnený (7C, d). Tieto výsledky boli v súlade s údajmi RT-qPCR a naznačujú, že Isl1 reguluje expresiu Gata3
Gremlin stroje a Nkx2.5
. Obrázok 7 Aberrant génu v hindstomach v Isl1 ICM /Del mutantov. (A) RT-qPCR analýzy hladín mRNA hindstomach obohateného transkripčných faktorov na E14.5 naznačuje významnú redukciu α-SMA
Six2 Nkx2.5
Gata3 stroje a Gremlin
mRNA v Isl1
ICM /del
mutantný žalúdky (n
= 4). Všetky výsledky boli normalizované k GAPDH úrovní
mRNA. (B) RT-qPCR Analýza hladín mRNA hindstomach obohateného transkripčných faktorov na E18.5 naznačuje významné zníženie Nkx2.5
Gata3 stroje a gremlin
mRNA v Isl1
MCM /del
mutantný žalúdky (n
= 4). Všetky výsledky boli normalizované k GAPDH úrovní
mRNA. Údaje sú stredná hodnota ± SEM (n = 6 myší na skupinu
). * P Hotel < 0,05 oproti Isl1
F /+
; ** P Hotel < 0,01 oproti Isl1
F /+
(Student t-test
). (CF) analýza PRIANIA mRNA potvrdilo stratu Isl1
Gata3
Gremlin stroje a expresie Nkx2.5
mRNA u E14.5 v Isl1
ICM /DEL
mutanta žalúdky. Isl1 stroje a Gata3
mRNA boli vážne down-regulované v Isl1
ICM /DEL
myšou, zatiaľ čo Gremlin stroje a Nkx2.5
výraz boli mierne znížená. Šípky ukazujú na pyloric zvierača.
Isl1 ciele Gata3 stroje a aktivuje jej transkripcii
Gata3
je selektívne vyjadrenú v pyloru v rozvojovom myšacieho embryá [19, 20]. Expresia oboch Isl1 stroje a Gata3
mRNA bola pozorovaná v pyloru u E14.5, ale či Gata3 a Isl1 sú vyjadrené v rovnakých bunkách nebola skúmaná. Preto sme skúmali expresiu Isl1 a Gata3 imonufluoreskujúca analýzy. Výsledky ukázali, že Isl1 a Gata3 proteíny boli spoločne vyjadrené v rovnakých bunkách pyloru u E14.5 a E18.5 v Isl1
F /+ c
ontroly žalúdky (Obrázok 8). Okrem toho, oblasť vyjadrujúca Gata3 bola významne menšie v Isl1
ICM /Del
mutant pyloru hladkého svalstva vrstva na E14.5 (obrázok 8A), a to bolo stratené v E18.5 v pyloru OLM vrstve (Obrázok 8B). Preto bolo nutné Isl1
pre Gata3
prejavu v chrbtovej pyloru OLM vrstvy. Ak chcete zistiť, či je Isl1 reguluje vývoj pyloric priamo regulovaním Gata3
sme vykonali analýzu bioinformatiky Gata3 genómovej lokuse. Myš Gata3
gén obsahuje niekoľko domnelých Isl1 odozvy prvky (ATTA /TAAT) pri -2,832 párov báz (bp) až +1,002 bp od začatia transkripcie miest [37]. Identifikovali sme 10 oblastí, ktoré obsahovali záväzné miesta (obrázok 9a) predpokladaný Isl1 a 10 párov zodpovedajúcich priméry boli navrhnuté tak, aby zosilnenie týmto regiónom nasledujúce chromatínu imunoprecipitáciou (čipu) štúdie využívajúce protilátky proti Isl1. Imunoprecipitovány genomická DNA bola získaná z pyloru oblastí myších embryí na E14.5. Z 10 domnelých Isl1 záväzných oblastí, dve oddelené oblasti, v -2,558 až -2,303 bp bp (P1 región) a -1,081 bp až -855 bp (P6 región), boli obsadené Isl1 bielkovín. Tento výsledok bol potvrdený semikvantitatívny PCR (Obrázok 9B) a ohybové spôsobu obohacovania (Obrázok 9C). Obrázok 8 Strata Isl1 eliminuje chrbtovej pyloru vonkajších pozdĺžnych svalov Gata3 výraz. (A) Dvojité imunologické pre Isl1 a Gata3 vo chrbtovej vrátnika u E14.5. Oblasť mesodermálních buniek (hviezdička) vyjadrujúca Gata3 bol menší v Isl1
ICM /DEL
pyloru než Isl1
Fl +
. (B) Dvojité imunologické pre Isl1 a Gata3 vo chrbtovej vrátnika u E18.5. Indukovatelná Isl1 knockout účinne eliminované Isl1 výraz, so súčasnou stratou Gata3 expresiu v chrbtovej OLM buniek (skryto). Žlté bodkované čiary označujú epitelu bazálnu membránu a biele prerušované čiary označujú ICM a OLM hranicu. Biela hrot šípu označuje nešpecifické škvrnu. Červené sfarbenie je Isl1, zelené sfarbenie Gata3 a DAPI nukleárnej kontrastným (DNA) je modrá. Scale bary: 50 um. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Vzácna príčina gastrointestinálne phytobezoars: Diospyros lotus
• Transkripčný faktor FOXO4 je down-regulovaná a inhibuje proliferáciu nádoru a metastázy do žalúdka cancer