LIM homeodomain Transkriptiouns Faktor Isl1 erfëllt normal pyloric Entwécklung vun Gata3

LIM homeodomain Transkriptiouns Faktor gezielt Isl1 erfëllt normal pyloric Entwécklung vun Gata3 VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Abnormalities zu pyloric Entwécklung oder zu contractile Funktioun vun der pylorus Ursaach reflux vun ausléisen gezielt Inhalter an de Mo a Erhéijung de Risiko vun gastric metaplasia a Kriibs. Abnormalities vun der pyloric Regioun sinn och zu Mëssbildunge Mängel wéi déi relativ heefeg neonatal hypertrophic pyloric stenosis Hausnummeren, an alleréischter duodenogastric reflux. Dofir, ass vu grousser Relevanz Medeziner pyloric Entwécklung Versteesdemech. Hei, mir d'Roll vun der LIM homeodomain Transkriptiouns Faktor Isl1 zu pyloric Entwécklung ze propagéieren. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Examen Isl1 Ausdrock an den Entwécklungslänner Maus Mo vun immunohistochemistry, hannen ganz am situ VerfÜgung hybridization an real-Zäit grouss Hinnen alleguer bewisen datt Isl1 ass an den Entwécklungslänner Maus Mo, am Prinzip vun der glat Muskel Layer vun der pylorus héich ausgedréckt. Isl1 Ausdrock war och vun immunofluorescence zu Mënsch hypertrophic pyloric stenosis wou d'Majoritéit vun glat Muskel Zellen iwwerpréift auszedrécken Isl1 fonnt goufen. Isl1 VerfÜgung Funktioun vun embryonal Mo. Entwécklung war e tamoxifen-inducible Isl1 VerfÜgung Knockout Maus Modell schreiwen propagéieren. Isl1 VerfÜgung hunn Nerve bal komplett Feele vun der pyloric baussenzege futti longitudinal Muskel um embryonal Dag 18.5, déi mat Gata3 VerfÜgung automatesch Maus phenotype konsequent ass. Chromatin immunoprecipitation, luciferase assays, an electrophoretic Mobilitéit Verréckelung assays Teamchef Isl1 normal pyloric Entwécklung garantéiert duerch direkt Gata3 VerfÜgung gezielt. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung Dës Etude, déi de Transkriptiouns reglementaresche Achs VerfÜgung Isl1-Gata3 Sarkasmus ass wichteg fir normal pyloric Entwécklung. Dës bruet ginn héichqualifizéiert klinesch relevant an hëllefen kann besser Weeër verstoen ze pyloric Krankheet Haaptfiguren. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung α-glat Muskel actin Gata3 Isl1 Pylorus Background VerfÜgung D'Wierbeldéieren GUT ass eng formidabel Struktur datt ingests an digests Liewensmëttel, absorbéiert nährstoffaarme, a verschwënnt Offall Produiten. D'GUT originates aus engem einfachen Bléien Struktur aus dräi meeschten Schichten dorënner eng Basisdaten endoderm, engem Ëmfeld splanchnic mesoderm, an eng ectoderm [1-3]. An Maus embryonal, gëtt de GUT laanscht de anterior-posterior, däischtere-Friessfeinde, lénks-Recht, a radial Axen Bonaparte. D'GUT Rouer aus der foregut, midgut, an hindgut laanscht seng anterior-posterior Achs [4, 5]. Als Entwécklung Verlaf, gëtt de foregut klammen bis de esophagus, Mo, Liewer, Longen, a Bauchspaicheldrüs. D'midgut Formen de klenge Daarm an der hindgut entwéckelt an déi grouss Daarm [1, 5-8]. VerfÜgung de Mo vun der posterior foregut ofgeleet ass. De Mo differenzéiert morphologically vum foregut Rouer ronderëm embryonal Dag 9,5 (E9.5) an den Ausbau vun der Pré-gastric mesenchyme erlaabt d'Domain vun der Mo op E10.5 siichtbar Ufank gin [9]. Mesenchymal Zellen vun Mo. differenzéiert an véier verschidde konzentresch Schichten, dorënner lamina propria, muscularis mucosae, an kreesfërmeg an longitudinal glat Muskel um verschidden Etappe vun embryonal Entwécklung [10]. Vun E11.5, ass de Mo. gemaach vergréissert. De Mo glat Muskel differenzéiert um E13, mat engem z'ënnerscheedde futti vun α-glat Muskel actin (α-SMA) -positive Zellen optauchen an eng kreesfërmeg Muskel futti ganze Mo administrativ [11]. Déi glat Muskel futti thickens am constricted mèi pyloric sphincter Regioun op iwwer E14.5 [2, 9]. Op E18.5, fänkt d'pyloric sphincter zu bedengt der reflux vun ausléisen Inhalter an de Mo ze fonktionnéieren [9]. VerfÜgung D'posterior oder pylorus Deel vun de Mo ass d'Präparaten menaarbecht tëscht de Mo an der Ausléiser. An der Kappgare vun der pylorus, kann d'Frae valvular flaps vun der pyloric sphincter gesi ginn [2]. Ënner normal gestallt Konditiounen, hänkt de Mo op seng peristaltic Kontraktioun zu Letzebuerg läit an Schub der deelweis verdaut Liewensmëttel, an der pylorus berout op seng thickened sphincter pyloric de Flux vum Iessen an de klenge Daarm ze kontrolléieren. Abnormalities zu pyloric Entwécklung oder an der contractile Funktioun vun der pylorus Ursaach reflux vun ausléisen Inhalter an de Mo a Erhéijung de Risiko vun gastric metaplasia a Kriibs [12, 13]. Abnormalities vun der pylorus sinn ze Mëssbildunge Mängel Zesummenhang [14-16]. Dofir, huet vill Opmierksamkeet fir d'Regulatioun Elementer an Édouard vun Mo. Entwécklung ze ginn, virun allem pylorus an pyloric sphincter Entwécklung. VerfÜgung virdrun Donnéeën vun Schüler ugeholl datt Schanken morphogenetic FAQ (Name) sécher mesenchymal Ausdrock vun Nkx2.5 VerfÜgung reguléieren an Sox9 VerfÜgung, déi de Charakter vun der pyloric epithelium schellt mä huet keen Effet op pyloric glat Muskel [5, 17], suggeréiert datt mesenchymal sécher vum onbekannte Facteure beaflossen der pyloric epithelial phenotype. An der Maus, sinn molekulare Mechanisme vun pyloric Opstellung wéineg verstan, mat relativ wéineg vun de Facteure fir normal pyloric Entwécklung néideg identifizéiert ginn mussen. Déi schonn hunn och Sox9 VerfÜgung [17], Six2 VerfÜgung [9], Bapx1 VerfÜgung [18], Nkx2.5 VerfÜgung [3, 17], Gremlin VerfÜgung [9], an Gata3 VerfÜgung [19, 20]. Ablation vun der homeodomain Transkriptiouns Faktor, Six2 VerfÜgung, an posterior Mo. ausgedréckt, desorganiséieren thickening vun der pyloric futti glat Muskel an attenuates constriction vun der pylorus sphincter. Zousätzlech, Verloscht vun Six2 VerfÜgung Sox9 VerfÜgung Ausdrock entfält, an verklengert Nkx2.5 VerfÜgung an Gremlin VerfÜgung Ausdrock am pylorus, obwuel dësem Ausdrock spéit sech [9], datt Six2 VerfÜgung suggeréiert, Sox9 VerfÜgung, Nkx2.5 VerfÜgung, an Gremlin VerfÜgung sinn fir pyloric Entwécklung néideg. Zousätzlech, Nkx2.5 VerfÜgung, Sox9 VerfÜgung, an Gata3 VerfÜgung sinn Co-ausgedréckt am däischtere pyloric baussenzege longitudinal Fleesch (OLM) futti datt tëscht E14.5 an E16.5 matures. Nom Läsche vun Nkx2.5 VerfÜgung oder Gata3 VerfÜgung, den däischtere pyloric OLM bal veréiert gëtt an constriction vun der pylorus sphincter ass attenuated [20]. VerfÜgung D'LIM homeodomain (LIM-HD) Transkriptiouns Faktor Isl1 war ursprénglech zu Funktioun als Insulin Gentherapie enhancer bindend FAQ [21] fonnt. Isl1 ass aus vun zwee zwee LIM Domainen an enger homeodomain. D'homeodomain, mat hirem Wendel-Tour-Wendel Struktur, Photo'en ze reglementaresche DNA Message vun Zil- Genen, iwwerdeems de LIM Beräicher haaptsächlech zu FAQ-FAQ Interaktioune Équipe sinn, datt d'Aktivitéit vun der LIM-HD [22] regléieren. Isl1 spillt kritescher Rollen zu Zell Determinatioun, Prolifératioun, an dat an der nervös System [23, 24], Häerz [25], an pituitary drüs [26]. Ausserdeem huet Isl1 Ausdrock ginn an gastric mesenchyme fonnt [27, 28] an gastrointestinal epithelium Souwuel embryonal an erwuessener Mais [29]. Allerdéngs huet d'Roll vun Isl1 am Mo. Entwécklung nach lant gin. Am Moment studéieren, iwwerpréift mir Isl1 Ausdrock am Mo.. Isl1 war an der posterior Mo. zu Grondsteen vun Entwécklung a war haaptsächlech limitéiert fir d'Fonctionnéieren Muskel Zellen vun der pylorus héich ausgedréckt. Isl1 VerfÜgung Funktioun am Mo. Entwécklung ze iwwerpréifen, geheescht mir eng tamoxifen-inducible Knockout Maus Modell. An inducible Modell waren war well Isl1 - /- VerfÜgung mutants um stierwen ongeféier E10.5 zu Feier am Häerz Opstellung zoumaachen. Eis Resultater weisen, datt Isl1 fir Opstellung vun der pyloric OLM Layer am Mo. organogenesis néideg ass. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Isl1 ass zu embryonal Maus Mo. ausgedréckt VerfÜgung Mir Isl1 VerfÜgung mRNA Niveauen am embryonal Maus Mo. iwwerpréift vun real- Zäit grouss Hinnen alleguer (RT-qPCR) a ganz hannen am situ VerfÜgung hybridization (wëllen). Isl1 VerfÜgung mRNA war am Ufank um E11.5 vun RT-qPCR fonnt. Isl1 VerfÜgung den héchsten Niveau op E13.5 erreecht, vun enger ëmmer manner um E14.5 gefollegt, an hat kee groussen Ännerungen an Nesset (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1a). Dëst Resultat war ähnlech zu enger viregter gemellt [29]. D'Lokalisatioun vun Isl1 VerfÜgung mRNA Ausdrock war mat wënschen propagéieren. Mir standing Isl1 VerfÜgung félicitéiere embryonal Mo op E11.5, E13.5, an E14.5. Op E11.5, war Isl1 VerfÜgung zu der posterior Halschent vun de Mo. en der (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1b). Allerdéngs war d'Isl1 VerfÜgung wënschen Signal vill méi staark an d'pylorus vun E13.5 (Dorënner 1A) kondenséiert. Als Mo. Entwécklung lues, weiderhinn d'pylorus Isl1 VerfÜgung an Ausdrock vun Isl1 auszedrécken VerfÜgung um E14.5 (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1b) zu der mèi pyloric sphincter verlängert. Allerdéngs, geschwächt der Isl1 VerfÜgung wënschen Signal gefierwt aus E13.5 zu E14.5. Dës Isl1 VerfÜgung wënschen Resultater concurred mat Isl1 VerfÜgung RT-qPCR Resultater. Figur 1 Isl1 ass an den Entwécklungslänner Maus Mo. ausgedréckt. (A) embryonal Mo. wënschen Analyse bewisen, dass Isl1 VerfÜgung Ausdrock fir d'pylorus um E13.5 (Pfeil) limitéiert war. (B) Immunohistochemical staining fir Isl1 am Mo.. Sektiounen aus Embryo'en sech zu rostral zu caudal Haaptrei am E11.5 an E13.5 arrangéiert, a Isl1 Ausdrock huet haaptsächlech un der mesenchyme vun der posterior Mo en der. Op E14.5 an E18.5, war Isl1 héich an glat Muskel Zellen vun der pylorus ausgedréckt, obwuel et e puer Isl1-positiv Zellen am lamina propria waren (arrowheads). Vergréissert Biller vun Statue Regiounen ginn ënnert original Biller gewisen. D, Ausléiser; Liv, Liewer; Pa, Bauchspaicheldrüs; St, Moo. Skala Baren vun original Biller: 100 μm; Skala Baren vun vergréissert Biller:. 50 μm VerfÜgung Mir dann Isl1 FAQ Ausdrock vun immunohistochemistry évaluéieren. Resultater bewisen, dass Isl1 haaptsächlech un der posterior Mo. mesenchyme aus E11.5 zu E13.5 en der huet, dann Isl1 war an glat Muskel Zellen vun der pylorus (Dorënner 1B an Weider Fichier 1: Dorënner S1c) ausgedréckt, a war och Magnéitfeld an der lamina propria (Dorënner 1B, arrowheads). . An erwuessener Maus Mo, nëmmen e puer Isl1-positiv Zellen sech am Fonctionnéieren Muskel futti observéiert (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S1c) VerfÜgung Isl1-positiv Zelle Co-ausgedréckt mat α-glat Muskel actin zu embryonal Maus Mo.
fir ze kucken, ob war Isl1 Ausdrock Zesummenhang mat Fleesch Entwécklung vun der pylorus glat, iwwerpréift mir den Ausdrock vun Isl1 an d'éischt glat Muskel Bewaacher α-SMA benotzt immunofluorescence. Resultater bewisen, dass den Undeel vun Isl1-positiv Zellen α-SMA lues fräi (Dorënner 2) ausdrécken. Op E11.5, kee α-SMA-positiv Zellen sech fonnt, obwuel Isl1 héich an de mesenchyme vun der posterior Mo. ausgedréckt huet. Op E14.5, engem Ziel vun Isl1-positiv Zellen, haaptsächlech déi vun den zentrale kreesfërmeg Fleesch (kréien mat) vun der pylorus, goufen α-SMA positiv. Vun E16.5, huet pyloric OLM schonn dat weiderentwéckelt [20]. Op E18.5, goufen d'Majoritéit vun Isl1-positiv Zellen am pylorus α-SMA positiv. Isl1 Ausdrock persisted am alen pyloric kréien mat an OLM, an lamina propria Zellen och Isl1 (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S2) ausgedréckt. Ausserdeem war Isl1 Ausdrock vun mënschlecher Echantillon vun hypertrophic pyloric stenosis vun immunofluorescence iwwerpréift, an Resultater bewisen, dass Isl1 och am mënschleche glat Muskel Zellen vun der pylorus (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S3) ausgedréckt huet. Dofir, proposéiere dës Resultater datt Isl1 an der Opstellung vu pyloric sphincter matschaffe kann. Figur 2 Double immunostaining fir Isl1 an α-glat Muskel actin zu Maus glat Muskel Zellen vun den däischtere pylorus. Isl1 an α-SMA Co-Ausdrock a glat Muskel Zellen am E11.5, E14.5, an E18.5. Yellow agekreest Linnen d'epithelial Keller Membran uerg, wäiss décke agekreest Linnen weg kréien mat an OLM Grenzen, a wäiss agekreest Linnen weg OLM an Bauchspaicheldrüs Grenz. Red staining ass Isl1, gréng staining ass α-SMA, an DAPI nuklear counterstaining (DNA) ass blo. α-SMA, α-glat Muskel actin; Kréien mat, zentrale kreesfërmeg Muskel; OLM, baussenzege longitudinal Muskel; Pa, Bauchspaicheldrüs; St, Moo. Skala Baren:. 50 μm VerfÜgung Isl1 Ausdrock ass zu Isl1 effektiv ablated VerfÜgung MCM /F VerfÜgung -inducible Knockout Mais VerfÜgung Auswierkunge vun Isl1 VerfÜgung ablation op Mo. Entwécklung ze ermëttelen, mir geheescht Isl1
MCM /F VerfÜgung -inducible Cre (Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung) Mais (Dorënner 3A) an Isl1 VerfÜgung F /+ m VerfÜgung Äis sech als kontrolléiert benotzt [30, 31]. an intakt oder Mann- Isl1 VerfÜgung mRNA war Ënnerscheedung vun semi-grouss Hinnen alleguer (Dorënner 3B): embryonal sech vun Hinnen alleguer op E18.5 (Dorënner S4 Weider Fichier 1) genotyped. Figur 3 Effizienz vun Isl1 ablation zu Mamm vun Isl1 MCM /Del Mann- Maus Mamm um E18.5. (A) Tamoxifen-inducible Cre recombinase excised DNA Message vun zwee loxP VerfÜgung Siten Agang. (B) Isl1 VerfÜgung RNS Niveau waren an Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- Mamm ablated wéi vun semi-grouss Hinnen alleguer gesinn. Isl1 VerfÜgung F /+ m VerfÜgung Äis weisen eng 592 huel Pair Produit hierkommen Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais eng 303 huel Pair Produit entsteet. (C) Isl1 war vill verwandelt-reegelen op d'FAQ Niveauen am Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- Mamm wéi déi westlech blot gewisen. Ausdrock vun embryonal um E11.5 war als positive Kontroll benotzt. (D) Isl1 FAQ Ausdrock vun Isl1 VerfÜgung F /+ eng VerfÜgung rg Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung embryonal pylorus. Isl1 Ausdrock war zu Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung embryonal Mamm bedeitend reduzéiert ginn, wéi déi vun immunofluorescence gesinn. Biller vun Isl1 VerfÜgung F /+ eng VerfÜgung rg Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung gläichzäiteg aussetzt op der selwechter Rutsch an fotografeschen verschafft goufen. Vergréissert Biller vun der Statue Beräicher sinn op der rietser Ofwiersäit vun de fusionéierte Biller gewisen. Yellow arrowheads weisen Vertrieder Isl1-positiv Zellen, a wäiss arrowheads weisen Vertrieder Isl1-negativ Zellen. Yellow agekreest Linnen uerg der epithelial Keller Membran. Skala Baren:. 50 μm VerfÜgung Western blot Analysë weisen, datt Isl1 FAQ Niveauen am embryonal Mo vun Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais sech wesentlech méi niddreg wéi déi vun Isl1 VerfÜgung F /+ m VerfÜgung Äis (Dorënner 3C). Immunofluorescence Resultater bewisen vill Isl1 staining zu pylorus vun Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais als Verglach zu Kontrollen (Dorënner 3D) reduzéiert. Dës Donnéeë weisen datt Isl1 VerfÜgung Ausdrock war effektiv verwandelt-reglementéiert Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- Mamm. VerfÜgung Pyloric abnormalities zu Isl1 VerfÜgung MCM /F VerfÜgung mutants
fir Auswierkunge vun Isl1 VerfÜgung ablation op Mo. Entwécklung ermëttelen, mir Verglach morphological an histological Differenzen tëscht Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung an Isl1 VerfÜgung F /+ den VerfÜgung tomachs um E18.5. Op E18.5, war säi Valoriséierung vun Isl1 observéiert VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mamm awer net zu Mamm vun Isl1 VerfÜgung F /+ l VerfÜgung ittermates (Dorënner 4A, Stäerchen) . Histological Ënnersichung bewisen, dass d'däischtere pyloric glat Muskel futti war vill phenomenal an de pylorus vun Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais am Verglach mat Kontrollen (Dorënner 4B). Mir iwwerpréift Ausdrock an Verdeelung vun α-SMA an zwee Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung mutants an Isl1 VerfÜgung F /+ p VerfÜgung ylorus. Immunofluorescence Resultater bewisen, dass Isl1 hunn zu bal komplett Feele vun der pyloric OLM Layer um E18.5 gefouert, a blouf Zellen sech openaner organiséiert (Dorënner 5A, Noten). Zousätzlech, constriction vun der pyloric sphincter zu Isl1 attenuated war VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- Mamm wann Verglach mat constriction zu Isl1 VerfÜgung F /+ den VerfÜgung tomachs (Dorënner 5B) . Ausserdeem, mir analyséieren Ausdrock vun der glat Muskel spezifesch FAQ Calponin-1 op E18.5, an immunofluorescence Resultater bewisen, dass Verloscht vun Isl1 och nervös Feele vun Calponin-1 Ausdrock vun der däischtere pyloric OLM futti virgedroen, ähnlech mat α- zu Resultat SMA (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S5). Sox9 ass an zwee epithelium an mesenchyme ausgedréckt [9] an ass fir Entwécklung vun OLM an Opstellung vun pyloric sphincter constriction néideg [20]. Eis immunofluorescence Resultater weisen, datt Sox9 um normal Niveauen am Mo. epithelium vun Isl1 blouf VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais bei E14.5 an E18.5 (Dorënner 6, arrowheads), mä am Beräich vun pyloric glat Muskel Sox9 ausdrécken war zu Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung mutants um E14.5 (Dorënner 6A, Noten) a veréiert um E18.5 (Dorënner 6B, Noten) bedeitend reduzéiert. Soumat war Isl1 VerfÜgung fir Zellen Sox9 VerfÜgung Ausdrock an däischtere pyloric OLM néideg. Dës Resultater weisen, datt Isl1 kritesch ass fir Entwécklung vun Maus pyloric glat Muskel Regulatioun. Figur 4 Morphological an histological Ännerungen an den Entwécklungslänner Mo vun Isl1 MCM /Del mutants. (A) Gross an microscopic Beweiser fir Mo. Mängel an Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais. Ganz Montéierung Meenung bei E18.5 zu Isl1 VerfÜgung F /+ eng VerfÜgung rg Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Maus Mamm. Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- Mamm gefeelt engem funktionell pyloric sphincter (arrowhead), doduerch reflux vun Flesseggassystem astellen wéi zu Mann- embryonal observéiert. Yellow Flesseggassystem ass vum Stär mat. (B) Hematoxylin an eosin staining vun Isl1 VerfÜgung F /+ eng VerfÜgung rg Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Maus pylorus um E18.5. Den däischtere pyloric glat Fleesch (schwaarz Statue Regioun) war Haaptcheffe vun Isl1 VerfÜgung F /+ E VerfÜgung mbryos, mee war vill phenomenal an Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung embryonal. De Rescht vun der pylorus war histologically normal. Green agekreest Linnen uerg der epithelial Keller Membran. Vergréissert Biller vun Statue Regiounen ginn ënnert original Fotoen gewisen. Skala Baren vun original Fotoen: 200 μm; Skala Baren vun vergréissert Biller: 50 μm. H &. E, hematoxylin an eosin VerfÜgung Dorënner 5 Verloscht vun Isl1 Opstellung vun den däischtere pyloric baussenzege longitudinal Muskel desorganiséieren. (A) Immunofluorescence vun Isl1 an α-SMA an Isl1 VerfÜgung F /+ eng VerfÜgung rg Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung embryonal pylorus um E18.5. Verloscht vun Isl1 schéinen bal komplett Verloscht vun α-SMA-positiv Zellen am däischtere pyloric OLM (Noten). Yellow agekreest Linnen uerg der epithelial Keller Membran a wäiss agekreest Linnen weg kréien mat an OLM Grenz. Red staining ass Isl1, gréng staining ass α-SMA, an DAPI nuklear counterstaining (DNA) ass blo. Skala Baren: 50 μm. (B) α-SMA immunofluorescence vun Isl1 VerfÜgung F /+ eng VerfÜgung rg Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung embryonal pylorus um E18.5. Verglach mat Isl1 VerfÜgung F /+ E VerfÜgung mbryos, war d'pyloric sphincter constriction indirekten an Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Déieren. Sphincter constriction Miessungen sinn gewisen. Yellow Baren demarcate der pylorus an Highlight der markéiert Ënnerscheed zu Breet tëscht Isl1 VerfÜgung F /+ eng VerfÜgung rg Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Echantillon. Date sinn mengen ± Sem (n VerfÜgung = 6 Mais pro Grupp), * P VerfÜgung &Si besteet; 0,05 (Student d't VerfÜgung Azeton). Skala Baren: 50 μm. α-SMA, α-glat Muskel actin; Kréien mat, zentrale kreesfërmeg Muskel; OLM, baussenzege longitudinal Muskel. VerfÜgung 6 Verloscht vun Isl1 Dorënner der däischtere pyloric baussenzege longitudinal Muskel Sox9 Ausdrock entfält. (A) Double immunostaining fir Isl1 an Sox9 am däischtere pylorus um E14.5. An d'Flichte vun Isl1, den Domain vun mesodermal Zellen (Noten) Sox9 ausdrécken war kleng. (B) Double immunostaining fir Isl1 an Sox9 am däischtere pylorus um E18.5. Inducible Isl1 Knockout effektiv Isl1 Ausdrock, mat concomitant Verloscht vun Sox9 Ausdrock vun der däischtere OLM Zellen (Noten) éliminéiert. Sox9 Ausdrock war normal am Mo. epithelium souwuel Etappen (arrowheads). Yellow agekreest Linnen uerg der epithelial Keller Membran a wäiss agekreest Linnen trennen kréien mat an OLM. Red staining ass Isl1, gréng staining ass Sox9, an DAPI nuklear counterstaining (DNA) ass blo. Skala Baren: 50 μm. Kréien mat, zentrale kreesfërmeg Muskel; OLM, baussenzege longitudinal Muskel. VerfÜgung Expression an Verdeelung vun FAQ Gentherapie Produit 9,5 (PGP9.5), eng enteric nervös System Tandel [32], war intakt um E18.5 zu Isl1 VerfÜgung MCM /Del
Mann- Mamm (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S6). Pancreatic an ausléisen homeobox Gentherapie 1 (Pdx1) ass an epithelial Zellen vun der antral-pyloric Segment an der rostral Ausléiser [33] ausgedréckt. Eis immunofluorescence Resultater weisen, datt Pdx1 Ausdrock war ähnlech zu Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais wann Verglach mat Kontrollen um E18.5 (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S7). Ausserdeem war d'Maus Mo an ausléisen epithelial Grenz tëscht E14.5 etabléierten a E16.5 [34], dës Period Wale mat der Entwécklung vun der OLM futti [20]. Mir getest d'Integritéit vun de Mo-kleng Daarm epithelial pyloric Grenz bei E18.5 vum Ausdrock vun enger Daarm-spezifesch epithelial Bewaacher Cdx2 waat [19]. Eis immunohistochemistry Resultater bewisen, dass d'Positioun vun der epithelial pyloric Grenz zu Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais bis datt vun Kontrollen ähnlech war (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S8). Dës Resultater weisen, datt e Verloscht vun Isl1 net innervation oder epithelial Entwécklung vun der pylorus betreffen. VerfÜgung Verloscht vun Isl1 net Prolifératioun oder apoptosis vun pyloric zentrale kreesfërmeg Fleesch a baussenzege longitudinal Muskel Zellen Afloss VerfÜgung ze kucken ob Isl1 Ausdrock war am Zesummenhang zu Zell Zouhuelen vun der pylorus, iwwerpréift mir Co-Lokalisatioun vun Isl1 an der proliferative Bewaacher bromodeoxyuridine (BrdU) immunofluorescence zu Isl1 VerfÜgung F /+ m VerfÜgung Äis benotzt. Eis Resultater weisen, datt BrdU-positiv Zellen am E11.5 a Streeung duerch d'kréien mat an OLM Regiounen am E14.5 an E18.5 (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S9a) dichten goufen. Zousätzlech, den Undeel vun proliferating kréien mat an OLM Zellen war net vill anescht tëscht Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung an Isl1 VerfÜgung F /+ m VerfÜgung Äis um E18.5 ( Weider Fichier 1:. Dorënner S9b) VerfÜgung fir e potentiellen Impakt op apoptosis bewäerten, iwwerpréift mir Caspase 3 Ausdrock um E18.5 eenalecn, an eise immunofluorescence Resultater weisen et kee Caspase waren 3-positiv Zellen zu pyloric kréien mat oder der OLM Layer vun Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung an Isl1 VerfÜgung F /+ m VerfÜgung Äis (Zousätzleche Fichier 1: Dorënner S10). Dës Donnéeë weisen, datt Isl1 ablation Afloss net Prolifératioun oder apoptosis vun pyloric kréien mat an OLM Zellen. VerfÜgung Verloscht vun Isl1 Resultater am ofgeholl Ausdrock vun Gata3 VerfÜgung, Gremlin VerfÜgung, an Nkx2.5
zënter enger Zuel vu Facteuren, dorënner Bapx1 VerfÜgung [18], Barx1 VerfÜgung [35], Gata3 VerfÜgung [19, 36], Gremlin VerfÜgung [5], Nkx2.5 VerfÜgung [2] , an Six2 VerfÜgung [9], muss gemellt ginn an Regulatioun vun pyloric Entwécklung bedeelegt ginn, iwwerpréift mir d'Effete vun Verloscht vun Isl1 op Ausdrock vun dësen Genen um E14.5 an E18.5. RT-qPCR Resultater weisen, datt e Verloscht vun Isl1 VerfÜgung net Ausdrock um vu Bapx1 VerfÜgung oder Barx1 VerfÜgung Afloss huet entweder E14.5 oder E18.5 (Dorënner 7A, B). Op E18.5, α-SMA VerfÜgung an Six2 VerfÜgung mRNA Niveauen sech wesentlech méi an Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais als Verglach mat Kontrollen (Dorënner 7B). Op béiden E14.5 an E18.5, Nkx2.5 VerfÜgung, Gata3 VerfÜgung, an Gremlin VerfÜgung mRNA Niveauen am Mo vun Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais sech niddreg wéi Kontrollen (Dorënner 7A, B). Gata3 VerfÜgung mRNA Niveauen waren ongeféier 70% op béide Etappen ofgeholl iwwerpréift (Dorënner 7A, B). Baséierend op déi Resultater, ze propagéieren mir Isl1 VerfÜgung, Gata3 VerfÜgung, Gremlin VerfÜgung, an Nkx2.5 VerfÜgung Ausdrock vun Isl1 VerfÜgung MCM /F VerfÜgung Mann- an Isl1 VerfÜgung F /+ den VerfÜgung tomachs wëllt benotzen. Resultater bewisen, dass Ausdrock vun all eenzel vun dësen Genen haaptsächlech un der pyloric Regioun agespaart war, wéi erwaart; Gata3 VerfÜgung war Ausdrock méi zu Mann- Mamm reduzéiert; an Gremlin VerfÜgung an Nkx2.5 VerfÜgung haten nëmmen dezent Ännerungen (Dorënner 7, F). Isl1 VerfÜgung an Gata3 VerfÜgung Ausdrock waren déi staark betraff (Dorënner 7C, D). Des Resultater sinn konsequent mat RT-qPCR Daten a virschloen, datt Isl1 reguléieren Ausdrock vun Gata3 VerfÜgung, Gremlin VerfÜgung, an Nkx2.5 VerfÜgung. Figur 7 Aberrant Gentherapie Ausdrock vun hindstomach zu Isl1 MCM /Del mutants. (A) RT-qPCR Analyse vun mRNA Niveau vun hindstomach-beräichert Transkriptiouns Faktoren op E14.5 beweist däitleche Minus vun α-SMA VerfÜgung, Six2 Nkx2.5 VerfÜgung, Gata3 VerfÜgung, an Gremlin VerfÜgung mRNA zu Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- Mamm (n VerfÜgung = 4). All Resultater goufen zu Niveau vun Gapdh VerfÜgung mRNA normalized. (B) RT-qPCR Analyse vun mRNA Niveau vun hindstomach-beräichert Transkriptiouns Faktoren op E18.5 beweist en däitleche Minus vun Nkx2.5 VerfÜgung, Gata3 VerfÜgung, an Gremlin VerfÜgung mRNA an der Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- Mamm (n VerfÜgung = 4). All Resultater goufen zu Niveau vun Gapdh VerfÜgung mRNA normalized. Date sinn mengen ± Sem (n = 6 VerfÜgung Mais pro Grupp). * P VerfÜgung &Si besteet; 0,05 versus Isl1 VerfÜgung F /+ VerfÜgung; ** P VerfÜgung &Si besteet; 0,01 versus Isl1 VerfÜgung F /+ VerfÜgung (Student d't VerfÜgung Azeton). (CF) wënschen mRNA Analys confirméiert Verloscht vun Isl1 VerfÜgung, Gata3 VerfÜgung, Gremlin VerfÜgung, an Nkx2.5 VerfÜgung mRNA Ausdrock um E14.5 an der Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- Mamm. Isl1 VerfÜgung an Gata3 VerfÜgung mRNA sech dësem Ugrëff-reglementéiert Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mais hierkommen Gremlin VerfÜgung an Nkx2.5 VerfÜgung Ausdrock liicht reduzéiert huet. Feiler Punkt un der pyloric sphincter. VerfÜgung Isl1 Ziler Gata3 VerfÜgung an activéiert seng Transkriptiouns VerfÜgung Gata3 VerfÜgung selektiv an der pylorus vun den Entwécklungslänner Maus Embryo ausgedréckt ass [19, 20]. Ausdrock vun zwou Isl1 VerfÜgung an Gata3 VerfÜgung mRNA war an der pylorus um E14.5 observéiert, mä ob Gata3 an Isl1 sinn an déi selwecht Zellen ausgedréckt huet lant net ginn. Dofir, mir iwwerpréift Ausdrock vun Isl1 an Gata3 vun immunofluorescence analyséiert. Resultater bewisen, dass Isl1 an Gata3 Proteinen am selwechten Zellen vun der pylorus um E14.5 an E18.5 zu Isl1 Co-ausgedréckt huet VerfÜgung F /+ c VerfÜgung ontrol Mamm (Dorënner 8). Ausserdeem war de Beräich Gata3 ausdrécken däitlech méi kleng an Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung Mann- pyloric glat Muskel Layer um E14.5 (Dorënner 8A) an et war op E18.5 am pyloric OLM futti verluer (Well 8B). Soumat war Isl1 VerfÜgung fir Gata3 VerfÜgung Ausdrock vun der däischtere pyloric OLM futti néideg. Ze ermëttelen, ob Isl1 pyloric Entwécklung reguléieren duerch direkt Regulatioun Gata3 VerfÜgung, standing mir Bioinformatik Analyse vun der Gata3 Frankräich nët. D'Maus Gata3 VerfÜgung Gentherapie enthält puer putative Isl1 Äntwert Elementer (ATTA /TAAT) op -2.832 huel Puer (BP) zu +1.002 BP vum Transkriptiouns Initiatioun Siten [37]. Mir identifizéiert 10 Beräicher datt ee putative Isl1 bindend Site (Dorënner 9A) aus, a 10 Puer entspriechend primers entworf goufen dës Regiounen folgenden chromatin immunoprecipitation (Chip) Studien zu Meenungsfreiheet nennt antibody zu Isl1 schreiwen. Immunoprecipitated Frankräich DNA war vun pyloric Regioune vun Maus embryonal um E14.5 kritt. Vun der 10 putative Isl1 bindend Beräicher, zwee diskret Regiounen, an der -2.558 BP zu -2.303 BP (P1 Regioun) a -1.081 BP bis -855 BP (P6 Regioun), goufe vun Isl1 FAQ besat. Dëst Resultat war vun semi-grouss Hinnen alleguer (Dorënner 9B) an d'Weeër Beräicherung Method (Dorënner 9C) confirméiert. Figur 8 Verloscht vun Isl1 entfält den däischtere pyloric baussenzege longitudinal Muskel Gata3 Ausdrock. (A) Double immunostaining fir Isl1 an Gata3 am däischtere pylorus um E14.5. Der Regioun vun mesodermal Zellen (Noten) ausdrécken Gata3 war kleng am Isl1 VerfÜgung MCM /Del VerfÜgung pylorus wéi Isl1 VerfÜgung Fl + VerfÜgung. (B) Double immunostaining fir Isl1 an Gata3 am däischtere pylorus um E18.5. Inducible Isl1 Knockout effektiv Isl1 Ausdrock, mat concomitant Verloscht vun Gata3 Ausdrock vun der däischtere OLM Zellen (Noten) éliminéiert. Yellow agekreest Linnen uerg der epithelial Keller Membran a wäiss agekreest Linnen déi kréien mat an OLM Grenz unzeginn. White arrowhead beweist Net-spezifesch stain. All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Eng rar Ursaach vun gastrointestinal phytobezoars: diospyros Lotus
• D'Transkriptiouns Faktor FOXO4 Minus-reglementéiert an bremst entholl Prolifératioun an Metastasen zu gastric cancer